魏伯俊[1]2000年在《P53和p16在喉癌及手术切缘中的表达及其临床意义》文中研究表明手术是治疗喉癌尤其是非早期患者的主要手段。术后局部复发和颈部转移是影响手术疗效的主要原因。本研究是为探讨p53和p16蛋白表达与喉癌的生物学特性之间的关系而设计的。 本文选择中国医学科学院肿瘤医院头颈外科自1980～1992年间手术切缘为阴性但术后复发的病例共52例作为研究对象，并按照病人的年龄、性别、临床分型、TNM分期、病理分级、术前放疗剂量等匹配因素选择相应的对照组。在对照组中，所有病例均随访5年以上无复发。 在病理医生复查手术切缘为阴性后，对两组手术切缘和肿瘤标本同时行p53和p16蛋白的免疫组织化学染色检查，以探讨其在两组肿瘤和手术切缘中的表达情况及其与肿瘤的病理分级、肿瘤生长方式，尤其是与局部复发和颈淋巴结转移之间的关系。从实验中发现：1．p53和p16蛋白表达的异常是喉癌发生过程中的早期事件，p53和p16蛋白水平都不能单独反映手术切缘粘膜上皮的病理状态；2．手术切缘粘膜中p53和p16蛋白的同时异常或者手术切缘中粘膜上皮以外有p16和／或p53异常染色的细胞都与局部复发有关；3．p53和p16蛋白异常同时存在的喉癌具有较强的侵袭能力和较高的局部复发率及淋巴结转移率。 本研究结果表明，p53和p16蛋白免疫组化染色的联合使用可以提高肿瘤阳性手术切缘的检出率，为术后高危局部复发病例的筛选提供理论依据，从而为正确选择术后放疗提高治愈率奠定了基础。
魏伯俊, 唐平章, 屠规益, 吕宁, 梁克[2]2000年在《喉癌组织及手术切缘P53和P16蛋白表达与局部复发的关系》文中进行了进一步梳理目的 用免疫组织化学方法监测P16和P5 3蛋白在喉癌手术切缘中的表达情况及其与肿瘤局部复发的关系。方法 选择HE染色病理学检查手术切缘为阴性但术后肿瘤局部复发的 5 2例喉癌作为复发组 ,并按照患者的年龄、性别、临床分型、TNM分期、病理分级、术前放疗剂量等可能影响因素选择 48例随访 5年以上无肿瘤局部复发者为无复发组。对 2组手术切缘和肿瘤标本同时行P16和P5 3蛋白免疫组织化学检查。结果 在 10 0例喉癌组织中P5 3蛋白的表达率和P16蛋白的丢失率分别为 5 4%和 40 % ,喉癌组织中P16和P5 3蛋白表达同时异常的喉癌患者当其手术切缘粘膜中P16和P5 3蛋白表达也同时异常时 ,其术后肿瘤局部复发率为 85 %。P16和P5 3蛋白表达与喉癌的临床分型和T分期无关。结论 采用免疫组化方法联合检测P16和P5 3蛋白在喉癌组织和手术切缘中的表达情况可为筛选术后肿瘤局部复发的高危病例提供依据。
李亮[3]2014年在《区域癌化与喉鳞癌外科手术切缘的研究》文中研究说明背景和目的：喉鳞癌组织学上以鳞状细胞癌最为常见。喉鳞癌目前的治疗手段仍以外科手术为主。现代喉外科学提倡：喉鳞癌治疗应在保证生存率的前提下，尽量保留喉的功能。但是如何既保证生存率，又最大限度地保留喉功能是目前提高喉鳞癌手术疗效的瓶颈。外科切缘不仅是保证患者术后生存率与生存质量的核心因素，同时也是实施喉功能保留手术时临床医师较难把握的手术关键之一。切缘过大则喉正常组织被过多地切除，术后喉功能受损，严重影响患者术后的生存质量；切缘过小则容易导致肿瘤细胞残留，引起患者术后的复发，降低了生存率，因此对于外科切缘量和性的把握是临床医师诊疗过程中面临的棘手问题。常规喉外科切缘是否安全，常以形态学及组织病理学为基础，但常规病理学检查为阴性时仍有一定局部复发率，这反映出病理学检查在手术切缘安全判断的局限性。“区域癌化”(field cancerization)是指在外界致癌因素影响下，特定器官的一个或一组细胞积累遗传学改变，转化为癌前细胞，在致癌因素的持续作用下，癌前细胞进一步累积基因改变而转变为具有恶性的肿瘤细胞，而那些发生了基因改变的癌前细胞可以存在于切缘组织病理正常的黏膜中。杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）反映的是肿瘤发生中特征性的基因改变，是研究肿瘤区域癌化的一种常用技术手段，目前针对喉鳞癌“区域癌化”的研究尚少。本研究拟通过LOH分析，验证喉鳞癌患者癌化区域的存在，通过分析比较基因改变情况，探寻在喉鳞癌发生发展过程中可能涉及的位点，并对目前的外科切缘的安全性进行探讨。方法：调取35例喉鳞癌患者手术切除后石蜡包埋组织标本，其中5例为术后复发并行二次手术患者。依据第7版UICC标准及WHO标准对患者进行TNM分期及病理分级。石蜡包埋组织行7μm连续切片、HE染色，在显微镜下区分肿瘤、癌旁及切缘等不同细胞分区并对各分区进行筛查，挑选符合标准的标本；使用激光捕获显微切割技术（Laser Capture microdissection，LCM）分别在肿瘤中心(T)，癌旁（F1-F4：癌旁距离<5mm； F5：癌旁距离>5mm），以及切缘(Ma-Md)位置进行显微切割，提取细胞；分别检测各区域细胞的LOH情况；结合病案资料分析对比各分区的LOH情况。为了检验喉鳞癌中是否存在区域癌化，本研究中使用位于9p、3p、17p、18q以及8p染色体上的9个微卫星位点（microsatellite）。这些位点选取是来自于潜在或者已知的抑癌基因的连锁位点，同时根据文献报道，选择在头颈肿瘤中研究较多的位点。对于在肿瘤中检测到LOH的患者，根据LOH的模式差异判断复发喉癌的克隆来源，并使用微卫星位点分析癌旁黏膜及手术切缘的差异。结果：1.喉鳞癌患者中有25例在癌细胞中心位置(T)检出一个或多个位点的LOH，检出率83.3%（25/30）；2.9个微卫星位点在肿瘤中心的检出率分别为： D3S1284（31.6%）、D3S1300（44.4%）、D3S1234（55%）、D3S1568（47.1%）、D9S171（44.4%）、D9S1870（42.1%）、TP53（58.8%）、D18S1110（33.3%）以及D8S518（35.3%）。3.在5名复发患者中，复发肿瘤LOH的模式与原发肿瘤的LOH一致；4.抑癌基因TP53在肿瘤中心位置LOH检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、淋巴转移、T分期均无关（P＞0.05），与病理分级相关（P=0.021<0.05）。其余各指标在肿瘤中心位置LOH检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、淋巴转移、病理分级、T分期均无关（P＞0.05）；5.微卫星位点在癌旁黏膜（F1-F4，F5）有不同程度检出，各微卫星位点检出率分别是：D3S1284（83.3%）、D3S1300（75%）、D3S1234（72.7%）、D3S1568（75%）、D9S171（87.5%）、D9S1870（75%）、TP53（80%）、D8S518（33.3%）以及D18S1110（33.3%）；6.微卫星位点在切缘（Ma-Md）有不同程度LOH检出，各微卫星位点检出率分别是：D3S1284（83.3%）、D3S1300（37.5%）、D3S1234（54.5%）、D3S1568（50%）、D9S171（62.5%）、D9S1870（62.5%）、TP53（70%）、D8S518（16.7%）以及D18S1110（16.7%）；7.18名患者(60%)癌旁黏膜存在至少一个微卫星位点的LOH，其中10名患者（编号：1、4、6、9、10、12、14、23、26、27）不同区域的癌旁黏膜表现为相同的基因改变，6名患者（编号：11、17、19、20、22、25）癌旁黏膜表现为不同的基因位点的丢失。此外还有2名患者只有一个区域发生LOH（编号：3、8）；8. D8S518位点LOH在17、23患者癌旁黏膜检出，尤其是17号患者，该位点的改变扩展到了手术的切缘。D18S1110在3、20号患者的癌旁黏膜中检出，其中20号患者在手术后8个月发生了喉癌的复发（编号33）；;9.15名患者(50%)切缘检测到至少1个位点的LOH，其中6名患者（编号：4、8、9、10、12、22）不同区域的切缘黏膜表现为相同的基因改变，1名患者（编号：3）切缘黏膜表现为不同的基因位点的丢失，其余8名患者（编号：6、11、14、17、19、23、26、27）只有一个区域的切缘检测到了LOH；10.8名患者(编号：1、6、10、11、14、19、26、27)肿瘤中心（T）与癌旁区域表现为相同的基因改变，10名患者的肿瘤中心（T）较癌旁黏膜有额外的基因改变(编号：3、4、8、9、11、12、17、20、23、25)。此外，有6名患者(编号：3、6、10、11、14、19)肿瘤中心（T）与切缘表现为相同的基因改变，还有10名患者(编号：3、4、8、9、12、17、22、23、26、27)切缘黏膜表现不同于肿瘤中心（T）的基因改变；11.12名患者（编号：3、4、6、8、9、10、11、12、14、17、19、26）同一标本中手术切缘与癌旁黏膜具有LOH的一致性，这两个区域具有共同的基因改变过程。而3号患者切缘（Mb）、22（Mb、Md）、27号患者切缘（Ma）表现出与癌旁黏膜的LOH模式的差异；12.5名复发肿瘤患者的癌旁黏膜都检测到了微卫星的LOH,3名患者(编号：31、32、34)癌旁黏膜与肿瘤LOH模式一致，33和35号患者肿瘤中心（T）较癌旁黏膜有额外的基因改变。4名复发患者(编号：32、33、34、35)在切缘检测到LOH，发生LOH的位点较肿瘤中心（T）减少。与原发肿瘤相比复发肿瘤的切缘和癌旁黏膜的LOH模式存在差异，31号患者未在切缘检测到LOH，32、33、34、35号患者癌旁黏膜的LOH模式不同于相对应的原发肿瘤癌旁黏膜，32、33、34、35号患者切缘检出的LOH模式也与原发肿瘤存在差异；13.癌旁黏膜（F1-F4，F5）LOH检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、T分期、病理分级均无关（P＞0.05），与淋巴转移相关（P=0.008<0.05）；14.切缘（Ma-Md）LOH检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、T分期、病理分级均无关（P＞0.05），与淋巴转移相关（P=0.003<0.05）；15. TP53在癌旁黏膜（F1-F4，F5）检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、病理分级、T分期均无关（P＞0.05），与淋巴转移相关（P=0.049<0.05）。其余指标在癌旁黏膜（F1-F4，F5）检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、淋巴转移、病理分级、T分期均无关（P＞0.05）。所有分指标在切缘（Ma-Md）检出与喉鳞癌患者的年龄、肿瘤发生的部位、淋巴转移、病理分级、T分期均无关（P＞0.05）。结论：1.微卫星位点D3S1300、D3S1234、D3S1568、D9S171、D9S1870、TP53在肿瘤中检测超过40%，说明在喉鳞癌中这6个位点易发生改变，可考虑作为检测喉鳞癌LOH的位点；2.复发的喉鳞癌与原发肿瘤存在克隆相关性，是属于喉鳞癌的局部原位复发，说明组织学阴性的切缘作为手术切除范围的判定存在一定风险；3.研究中只有TP53的LOH与病理分级相关(p<0.05)，但该结果仍需进一步深入研究。其他指标与年龄、性别、肿瘤部位、T分期以及淋巴结转移均无相关性；4.喉鳞癌是多因素、多阶段、多步骤参与的渐进的病变过程；5.本研究中大多数的喉鳞癌患者癌旁黏膜存在区域癌化，而且癌化区域的范围随患者不同而发生变化，有相当大的一部分的患者区域癌化扩展到手术的切缘；6. D8S518和D18S1110位点在癌前区域向喉鳞癌发展的过程中可能起关键作用，目前还需进一步的研究；7.癌旁黏膜的TP53的LOH可以考虑用来评估喉鳞癌是否发生淋巴结转移。
孙秀梅[4]2005年在《声门型喉癌手术深部切缘的角蛋白定量分析》文中进行了进一步梳理目的通过对60例声门型喉癌不同距离手术深部切缘的病理学观察及角蛋白表达的研究,为临床确定不同分期声门型喉癌手术的深部安全切缘提供客观依据。 方法收集临床资料完整的声门型喉癌60例,术前均未行放、化疗,根据TNM分期行不同喉部分切除术,术中标记深部切缘。术后将标记切缘的组织经10%中性福尔马林固定,纵向每3mm距离连续切片,取肿瘤最大面的组织块。行连续切片,切片厚5μm,间隔60张取1张HE染色、免疫组化染色,行常规病理观察及角蛋白在不同分期声门型喉癌组织、不同距离深部切缘中的表达。 结果(1)T1期声门型喉癌角蛋白表达肿瘤与2、3、5mm深部切缘比较均有显著意义,P<0.05;2、3、5mm切缘比较差异无显著意义,P>0.05。(2)T2、T3期声门型喉癌,肿瘤与2mm,3mm与5mm对比角蛋白表达差异无显著意义,P<0.05:肿瘤与3、5ram,2与3、5mm对比差异有显著意义,P<0.05。(3)T4期声门型喉癌,肿瘤与2、3mm,2与3mm对比差异无显著意义,P>0.05;肿瘤与5mm,2、3与5mm对比差异有显著意义,P<0.05。 结论 声门型喉癌手术深部安全切缘,因肿瘤浸润范围(即T分级)不同而不同,T1期深部安全切缘为2mm,T2、T3期为3mm,T4期则至少保证5mm。
冉龙娟[5]2013年在《喉癌手术切缘免疫组化研究现状》文中认为喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤，主要病理类型为鳞状细胞癌。手术治疗为其主要的治疗方式，其预后与手术切缘的状态明显相关，临床上以组织病理检查诊断判定切缘是否安全，但病理检查阴性患者仍有一定的局部复发率。研究表明在细胞形态学发生变化之前，已经出现分子水平改变及生化代谢改变。现已有许多研究者通过免疫组化方法对喉癌的某些蛋白的测定，评估其与喉癌的发生、发展的关系。本文综合评述了用免疫组化检测喉癌手术切缘某些蛋白的表达及其与喉癌手术切除范围定性、复发、转移等方面的研究现状。
伊海金[6]2006年在《喉癌肿瘤标志物、喉癌分子切缘以及临床因素与喉癌复发的相关性研究》文中研究表明目的： 喉癌是耳鼻咽喉—头颈外科常见恶性肿瘤之一，临床上喉癌治疗后复发并不少见，影响喉癌术后复发的因素是复杂多样的。为探讨喉癌复发的相关因素，本文回顾分析103例喉癌病例资料，从肿瘤标志物、喉癌分子切缘以及临床因素三个方面对喉癌的复发进行单因素、多因素分析。 方法： 应用免疫组化方法检测喉癌复发组与未复发组原发灶的CyclinD1、P27、P53以及e IF4E表达状况，探讨CyclinD1、P27、P53以及e IF4E对喉癌复发的意义；应用免疫组化方法检测喉癌复发组与未复发组切缘的的CyclinD1、P27、P53以及e IF4E表达状况，探讨喉癌病理学阴性切缘而CyclinD1、P53、e IF4E阳性表达以及P27阴性表达(即所谓分子切缘阳性)对喉癌复发的意义；通过回顾性分析收治的103例喉癌的临床资料，探讨喉癌复发的临床因素。并综合三方面因素对喉癌复发进行多因素分析。 结果： 喉癌术后复发组与未复发组原发灶的CyclinD1、P27、P53表达有显著性差异(p＜0.05)，喉癌术后复发组与未复发组原发灶的e IF4E表达无显著性差异，(p＞0.05)。喉癌术后复发组与未复发组切缘的CyclinD1、P27、P53、e IF4E表达有显著性差异(p＜0.05)，e IF4E复发组切缘阳性表达率高于CyclinD1、P27(阴性表达)以及P53。喉癌术后复发与原发肿瘤部位、T分期、淋巴结转移、喉癌病理分化程度以及首次手术方式有关；与年龄、性别、是否术后放疗无关；Logitic多因素回归分析显示：喉癌术后复发与肿瘤T分期、淋巴结转移、喉癌病理分化程度以及首次手术方式有关。 最后综合肿瘤标志物、喉癌分子切缘以及临床因素三个方面的Logistic多
张春明[7]2008年在《喉癌外科切缘的三维研究》文中认为目的喉癌是耳鼻咽喉-头颈外科常见的恶性肿瘤之一,手术是喉癌治疗的主要手段。由于喉解剖部位的不规则性及肿瘤浸润生长呈三维性,喉癌原发灶的安全完整切除要求准确把握肿瘤的黏膜切缘、黏膜下浸润及基底浸润程度。手术切缘的癌细胞残留可能导致手术失败,引起局部复发。科学确定外科切缘是决定喉癌患者术后生存率及喉功能保留的核心因素。本课题通过利用组织病理学及生物学等多种方法,对喉癌切缘进行立体研究,了解喉癌的三维浸润特征,从而对开展以安全切缘为基础的喉癌外科治疗提供一定的理论依据。方法用流式细胞术检测喉癌组织及癌旁0.5cm、1.0cm、2.0cm处黏膜组织异倍体率、DNA指数;用免疫组织化学方法检测喉癌组织及癌旁0.5cm、1.0cm、2.0cm处增殖细胞核抗原及基质金属蛋白酶-2的表达;用喉癌组织大体手术标本沿长轴取肿瘤最大面的组织切片,观察并测出喉癌组织在黏膜下潜性浸润距离;比较不同部位、不同T分期及不同形态的喉癌组织黏膜下浸润情况;行常规病理学观察及细胞角蛋白-19免疫组织化学染色,检测其在深部切缘的表达情况,观察喉癌组织基底浸润特征。结果1.喉癌组织与癌旁0.5cm、1cm、2cm处黏膜DNA含量和PCNA表达有显著性差异;2.喉癌组织与癌旁0.5cm、1cm处黏膜组织中MMP-2的表达有显著性差异,MMP-2的阳性表达率与喉癌颈淋巴结转移及肿瘤T分期存在相关性;3.不同部位、不同T分期及不同喉癌大体形态的黏膜下浸润距离:喉癌声门型和声门上型两者没有统计学差异;喉癌T_(1-2)期和T_(3-4)期两者有统计学差异;喉癌外生型、溃疡浸润型和混合浸润型中,前者分别与后两型比较,均有显著性差异,后两型之间无显著性差异;4.CK-19在喉癌组织基底远侧不同距离的表达与T分期存在相关性,与肿瘤原发灶位置也存在相关性。结论1.能够反映喉癌细胞增殖和侵袭特性一些生物学指标从喉癌组织向周围黏膜组织移行过程中渐趋正常,根据这个规律可以提出喉癌0.5cm的基本安全切缘与1.0cm的理想安全切缘;2.喉癌原发灶T分期越晚,肿瘤黏膜下浸润程度越重;外生型喉癌的黏膜下浸润程度轻,溃疡浸润型、混合浸润型喉癌黏膜下浸润程度重;局部晚期的溃疡浸润型、混合浸润型喉癌应慎行喉部分切除术;3.喉癌手术深部安全切缘,因肿瘤浸润范围(即T分级)不同而不同;喉癌组织基底远侧的喉部组织,如肌肉组织、结缔组织和软骨组织等,未发现CK-19阳性表达;喉部的弹性膜、软骨膜和软骨是癌组织侵袭的屏障,是喉癌手术基底切除的解剖标志。
常玮[8]2010年在《c-FLIP和RECK在喉鳞癌及癌旁组织中的表达及对于喉癌手术的指导意义》文中指出目的：1,探讨癌基因c-FLIP和抑癌基因RECK在喉癌组织中的表达与喉癌临床特征的关系,了解喉癌的生物学行为。并从细胞和基因水平探讨c-FLIP和RECK在喉癌及癌旁不同距离粘膜组织中表达变化特征,分析两者作为喉癌特异性分子指标的可行性,并探讨喉癌手术粘膜安全切缘的范围。2,研究RECK因子在声门上喉癌中的表达特征,初步探索声门上喉癌粘膜下浸润的距离及深部切缘安全界的标准。方法：1,分别采用PV9000免疫组织化学两步法及RT-PCR方法检测38例喉磷癌组织及距癌组织边缘2mm、5mm、10mm粘膜组织中c-FLIP和RECK蛋白的表达及mRNA转录情况,同时取距离癌组织边缘15mm处粘膜组织作为对照。2,应用免疫组化方法检测24例声门上喉鳞癌及粘膜下浸润不同距离的深部切缘组织中RECK蛋白的表达,并采用图像分析技术,计算蛋白表达的平均光密度值,结果采用均数±标准差(mean±SD)的形式表示,并进行方差分析,组间采用SNK检验。结果：1, c-FLIP和RECK在喉鳞癌组织中的表达水平与患者临床分期和肿瘤病理学分级分别成正相关和负相关。c-FLIP在伴颈淋巴结转移组中的表达水平明显高于非转移组,而RECK则正好相反。2,c-FLIP表达情况依癌组织→癌旁2mm→癌旁5mm→癌旁10mm→癌旁15mm顺序递减,而RECK则递增。c-FLIP在癌组织与癌旁5mm、10mm、15mm组织之间表达水平有显著性差异(P<0.05),而与癌旁2mm处组织之间差别无统计学意义。RECK在癌组织与癌旁5mm、10mm、15mm组织之间表达水平有显著性差异(P<0.05),而与癌旁2mm处组织之间差别无统计学意义。3,RECK蛋白在声门上喉癌中的表达与病理分化程度及临床分期有密切关系。4,RECK蛋白的表达量在声门上喉癌及不同距离深部切缘组织中沿癌组织→2mm→5mm→10mm→15mm这样的顺序呈现出递增趋势。平均光密度值测定得出癌组织,2mm,5mm处组织三者之间表达无明显差别(P=0.088),10mm与15mm处组织表达也无差别(P=0.251),但前三者与后两者之间的表达量有显著差别(P<0.01)。结论：1,c-FLIP和RECK两因子在喉鳞癌组织中的表达水平与喉鳞癌患者的临床病理参数密切相关。2,c-FLIP和RECK可能都参与了喉鳞癌的发生、发展,并与喉鳞癌的浸润及转移有密切关系。3,c-FLIP和RECK在喉鳞癌组织中及癌旁各距离粘膜组织中表达情况进一步表明以距肿瘤边缘5mm作为粘膜安全切缘的标准较为适宜。4,声门上喉癌粘膜下深部切缘的安全切除范围可能达到0.5.1cm之间,有待于术后随访进一步证实。
李祎宁[9]2016年在《共转染bcl-2、survivin基因shRNA对紫杉醇诱导的喉癌Hep-2细胞影响的研究》文中提出喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,在我国占头颈部肿瘤的13.9%。喉癌的治疗目前多采用以手术为主、联合放化疗的综合治疗,在最大程度根除肿瘤的基础上保全喉的功能,在保证患者的生存率的同时提高生存质量。但手术后复发和转移仍是喉癌的主要致死原因,而且放疗和化疗毒副作用较大。因此,寻找新的安全、有效、毒副作用小的治疗方法成了关注的焦点。细胞增殖和细胞凋亡失常在肿瘤的发生、发展过程中普遍存在的现象已经得到研究人员的共识。Bcl-2基因是一原癌基因,其高表达可引起肿瘤发生,而且它能够明显延长细胞的生存,是目前公认的比较重要的细胞凋亡调控基因。Survivin是新近发现的IAP家族成员,在人类常见的肿瘤组织中呈现高表达。Bcl-2和survivin基因在喉癌组织中均呈现高度表达,而且其表达与组织病理的分化程度降低、临床分期的增加、淋巴结转移的出现呈正相关。由于肿瘤是一种多基因参加,多步骤与多阶段的疾病,因此针对上述两个基因靶点的联合治疗可能会起到更好地效果。近年来RNA干扰技术被应用于恶性肿瘤基因治疗的试验研究中。它通过小干扰RNA与目的癌基因的mRNA按照碱基互补的原理特异性结合,干扰目的基因的翻译、转录和蛋白质形成的功能,阻止目的蛋白生成,诱导癌细胞凋亡或向成熟方向分化,进而达到抑制肿瘤生长的目的。紫杉醇是近年来发现的一种新型的、具有广谱高效抗癌活性的药物。已有多个临床研究证实紫杉醇在头颈部鳞状细胞癌治疗中具有较好的效果。因此本研究把bcl-2、survivin基因和紫杉醇作为生物化疗联合应用研究的靶点,利用RNAi技术研究将两种基因同时沉默并联合紫杉醇诱导观察其对喉癌Hep-2细胞的影响,探究其相互作用的机制,为肿瘤治疗寻找新的安全有效的途径。研究目的：(1)构建bcl-2 shRNA及survivin shRNA慢病毒表达载体,探讨利用RNAi技术沉默喉癌Hep-2细胞中bcl-2和survivin基因后,细胞中相应目的基因的表达情况。(2)观察bcl-2和survivin基因沉默后对喉癌Hep-2细胞生长的影响及细胞周期的影响。(3)探讨共转染bcl-2 shRNA及survivin shRNA后Hep-2细胞中相应目的基因的表达情况及对Hep-2细胞增殖的影响。(4)阐明共转染bcl-2、survivin基因shRNA对Taxol诱导的Hep-2细胞凋亡的影响。研究方法：(1)根据siRNA设计原则构建bcl-2 shRNA及survivin shRNA慢病毒表达载体。(2)采用RT-PCR方法检测shRNA转染后对喉癌Hep-2细胞中bcl-2和survivin基因mRNA水平的影响。(3)用Western blot方法检测shRNA转染以及转染联合紫杉醇诱导后对Hep-2细胞中bcl-2和survivin蛋白水平的影响。(4)免疫荧光细胞化学法检测shRNA转染及紫杉醇诱导后Hep-2细胞的形态变化及目的基因的表达情况。(5)用CCK-8法检测bcl-2 shRNA及survivin shRNA单独转染、共转染及其联合紫杉醇诱导后对Hep-2细胞增殖的影响。(6)用流式细胞仪检测转染bcl-2 shRNA、survivin shRNA及shRNA转染联合紫杉醇诱导后对Hep-2细胞周期的影响。(7)用caspase3舌性检测试剂盒检测共转染bcl-2 shRNA、survivin shRNA对紫杉醇诱导的Hep-2中caspase3的活性。(8)应用SPSS19.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,对计量资料,多个样本均数比较应用单因素方差分析及重复测量资料的方差分析,两样本均数比较采用t检验。检验水准P<0.05。结果(1)利用RNAi技术成功的构建了Survivin和Bcl-2基因的shRNA慢病毒表达载体,并成功转染喉癌Hep-2细胞,转染后目的基因的siRNA在细胞中稳定表达。(2)Bcl-2和survivin siRNA干扰喉癌Hep-2细胞后,单独转染组细胞中相应沉默的基因的mRNA表达减少(P<0.01),共转染组较单独转染组减少显著(P<0.01)。(3)Western blot显示转染组细胞内目的蛋白表达减少(P<0.01),共转染组细胞中较单独转染组显著减少(P<0.01)。加入紫杉醇后各组细胞中目的蛋白均比未加紫杉醇组细胞中表达明显减少(P<0.05),且转染联合组中目的蛋白的表达较加入紫杉醇前明显减少(P<0.01)。(4)免疫荧光细胞化学法检测结果显示在激光扫描共聚焦显微镜下可见转染组中相应基因的表达减弱,且转染细胞出现凋亡的形态学改变。紫杉醇作用后细胞形态出现明显的凋亡小体,且凋亡细胞内目的基因表达减少。(5)Bcl-2和survivin siRNA分别干扰喉癌Hep-2细胞后,可以明显抑制其增殖(P<0.05),共转染组较单独转染组抑制作用更明显(P<0.05),而且发现在转染48h时各转染组对细胞增殖的抑制作用稳定且高效。(6)Bcl-2和survivin siRNA干扰喉癌Hep-2细胞,可以影响其细胞周期。沉默bcl-2基因后出现S期阻滞；沉默survivin后导致由G1期进入S期细胞减少,出现了G0/G1期阻滞,从而抑制了细胞增殖。(7)紫杉醇诱导喉Hep-2细胞24h和48h细胞生长均被显著抑制(P<0.05和P<0.01),但两个时间点上对细胞生长的抑制无明显差别(P>0.05)(8)通过转染联合紫杉醇作用的三个时间点上来检测对细胞增殖的影响,发现转染24h时加入紫杉醇联合诱导24h,此时对细胞生长的抑制效果最显著(P<0.05),优于单独转染组及紫杉醇作用组(P<0.05)。(9)Bcl-2和survivin siRNA干扰喉癌Hep-2细胞后,caspase3活性显著增强(P<0.01),且共转染组较单独转染组明显(P<0.05)。联合紫杉醇作用后其活性较单独作用时明显(P<0.05),尤其是转染survivin siRNA联合紫杉醇组更明显(P<0.01)。(10)紫杉醇诱导细胞出现了G2/M期阻滞。转染pshRNA-Survivin联合紫杉醇诱导后,G2/M期细胞阻滞较单独紫杉醇作用更明显。Survivin基因沉默后增强了紫杉醇对细胞周期G2/M期的阻滞作用。结论(1)利用RNAi技术成功的构建了Survivin和Bcl-2基因的shRNA慢病毒表达载体,并成功转染喉癌Hep-2细胞,转染后目的基因siRNA在细胞中稳定表达。(2)Survivin和Bcl-2 shRNA可有效沉默喉癌Hep-2细胞中的Survivin和Bcl-2基因,下调其蛋白及mRNA的表达水平,且二者共转染后两种基因的表达的均减少,且较单独沉默时更明显。并且两种基因沉默后明显地抑制了Hep-2细胞的增殖,增强了caspase3的活性,且同时沉默时作用更显著,这两种基因可协同促进细胞的凋亡。(3)紫杉醇诱导Hep-2细胞后可明显抑制细胞增殖,有效增强caspase3的活性,而且细胞中bcl-2和survivin蛋白表达明显减少,紫杉醇抑制了两种抗凋亡基因的表达。(4)共转染Survivin和Bcl-2 shRNA与紫杉醇联合诱导Hep-2细胞,共沉默的基因可明显提高紫杉醇抗肿瘤细胞增殖的效果,并可协同其细胞周期阻滞及促进细胞凋亡,增强抗肿瘤作用的疗效。
吴珠[10]2005年在《Survivin和P53在喉鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达及其临床意义的研究》文中指出研究喉鳞癌及癌旁组织中survivin、P53的表达情况,从基因蛋白水平角度探讨其与喉鳞癌的临床特征的关系以及手术安全切缘范围,我们对38例喉癌手术标本,10例声带息肉标本进行了研究。 本文分别采用免疫组化SP和PV方法,对38例原发性喉鳞状细胞癌的喉癌组织和癌旁2mm、5mm和10mm黏膜以及10例声带息肉行survivin、P53的表达检测。 结果显示,survivin蛋白在声带息肉中不表达;38例喉癌组中survivin蛋白表达阳性率65.8%(25/38);癌旁2mm组织中survivin蛋白表达阳性率47.4%(18/38);癌旁5mm组织中survivin蛋白表达阳性23.7%(9/38);癌旁10mm组织中survivin蛋白表达阳性率2.6%(1/38);survivin蛋白表达与喉鳞癌患者临床分期、组织分化、淋巴结转移有关,差异有显著性(P<0.05),survivin蛋白阳性表达率在颈淋巴结阳性、组织分化程度低及Ⅲ-Ⅳ期的病人中高;survivin蛋白阳性表达在不同年龄组、不同发生部位的差异无显著性(P>0.05)。P53在声带息肉中不表达;38例喉癌组中P53阳性率为60.5%(23/38);癌旁2mm组织中P53阳性率为52.6%(20/38);癌旁5mm组织中P53阳性率为31.6%(12/38);癌旁10mm组织中P53阳性率为5.3%(2/38);P53蛋白表达与喉鳞癌患者临床分期、组织分化、淋巴结转移有关,差异有显著性(P<0.05),P53蛋白阳性表达率在颈淋巴结阳性、组织分化程度低及Ⅲ-Ⅳ期的病人中高;P53蛋白阳性表达在不同年龄组、不同发生部位的差异无显著性(P>0.05)。survivin、P53的表达阳性率依声带息肉→癌旁10mm→癌旁5mm→癌旁2mm→喉癌组顺序递增,且survivin、P53的表达在距肿瘤5mm以内的癌旁组织与癌旁组织10mm处有显著性差异(P<0.05)。 结果表明,应用survivin、P53在喉癌的表达检测,两个指标综合使用可以较准确地辅助对喉癌的早期诊断,通过检测证实距肿瘤5mm以内的癌旁组织应视为癌前期病变,以切缘距肿瘤5mm作为喉癌手术安全切缘的标准较为合适。通过应用检测survivin、P53在喉癌及其癌旁组织中的表达,确定喉癌手术切缘的安全界线,为临床确定喉癌手术切缘的安全界线提供了一个新的方法。
参考文献：
[1]. P53和p16在喉癌及手术切缘中的表达及其临床意义[D]. 魏伯俊. 中国协和医科大学. 2000
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[3]. 区域癌化与喉鳞癌外科手术切缘的研究[D]. 李亮. 山西医科大学. 2014
[4]. 声门型喉癌手术深部切缘的角蛋白定量分析[D]. 孙秀梅. 青岛大学. 2005
[5]. 喉癌手术切缘免疫组化研究现状[D]. 冉龙娟. 重庆医科大学. 2013
[6]. 喉癌肿瘤标志物、喉癌分子切缘以及临床因素与喉癌复发的相关性研究[D]. 伊海金. 中国协和医科大学. 2006
[7]. 喉癌外科切缘的三维研究[D]. 张春明. 山西医科大学. 2008
[8]. c-FLIP和RECK在喉鳞癌及癌旁组织中的表达及对于喉癌手术的指导意义[D]. 常玮. 山西医科大学. 2010
[9]. 共转染bcl-2、survivin基因shRNA对紫杉醇诱导的喉癌Hep-2细胞影响的研究[D]. 李祎宁. 吉林大学. 2016
[10]. Survivin和P53在喉鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达及其临床意义的研究[D]. 吴珠. 青岛大学. 2005
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