赵淑玲[1]2003年在《马尾松毛虫质型多角体病毒全基因组序列的测定与分析》文中研究说明本论文由两章组成。第一章对质型多角体病毒的研究作了综述性介绍，包括对质型多角体病毒的分类、多角体及病毒粒子、复制及组装、基因组结构和功能等方面作了阐述。另外，本章还对马尾松毛虫质型多角体病毒的研究作了重点的介绍。第二章进行了马尾松毛虫质型多角体病毒（DpCPV）全基因组序列的测定与分析研究。马尾松毛虫质型多角体病毒属于呼肠孤病毒科、质型多角体病毒属，基因组由十条分段的dsRNA组成。在本文中，我们完成了DpCPV全基因组序列的测定工作。对测得的序列分析表明，每一基因组片段含一个开放性阅读框，两末端存在保守的核苷酸序列，分别为5'(AGUAA)和3'(GUUAGCC)。根据DpCPV-Hn编码的蛋白和呼肠孤病毒科其它成员编码的蛋白的比较结果推测，DpCPV-Hn S1、S3、S4、S6、S7分别编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP5，S2编码蛋白为病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp），S5、S8、S9编码蛋白为病毒的非结构蛋白，S10为多角体蛋白基因。功能性结构域分析显示，VP3 氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel 的甲基化酶有同源性，推测VP3在病毒mRNA的加帽过程中起重要作用。VP4含有亮氨酸锌指结构和ATP/GTP结合位点，推测VP4具有核酸结合活性。S5编码蛋白的氨基酸序列部分区域与口蹄疫病毒的2A蛋白酶（ FMDV 2Apro）非常相似。对几种CPV的RNA聚合酶基因和多角体蛋白基因的进化分析表明，DpCPV-Hn为I型CPV，和BmCPV的进化关系非常相近
彭晗[2]2015年在《马尾松毛虫质型多角体病毒P44、P50蛋白的表达与定位》文中研究表明马尾松毛虫以松针为食,是一种危害较大的森林害虫。马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,DpCPV)是马尾松毛虫的病原微生物,为我国特有物种。DpCPV在农业方面的主要用途是用做微生物杀虫剂,具有安全、高效、无污染的特性。DpCPV的增殖主要通过直接感染目的昆虫的方式,但是受外界环境影响较大。目前对马尾松毛虫质型多角体病毒的研究主要集中在对病毒自身核苷酸序列及其结构的分析,而对有关核酸编码蛋白的修饰、定位和功能的研究报道却较少。因此深入研究DpCPV结构蛋白的修饰机制,将有助于了解病毒入侵机制,为后续马尾松毛虫病毒制剂的生产与虫害的防治工作提供理论依据。本研究通过分别构建DpCPV的P44和P50蛋白的原核和真核表达载体,实现两者原核表达和真核共表达,研究两者的相互作用,并对P50蛋白在昆虫细胞内的定位进行探究。研究结果显示:DpCPV s7编码的结构蛋白P50和s8编码的非结构蛋白P44在大肠杆菌内成功表达,与理论的蛋白分子量大小一致;免疫家兔制备多克隆抗体分别和相应的蛋白进行免疫印迹反应,鉴定了多克隆抗体的特异性;在昆虫细胞Sf9中实现了P50和P44蛋白的共表达。P50在真核细胞内表达的蛋白大小与在原核细胞内表达蛋白的大小一致,P44在真核内表达的大小比原核表达的略小。可见在昆虫Sf9细胞内,P50蛋白不能自我剪切修饰,同时也表明P44蛋白未参与P50蛋白的切割修饰。利用激光共聚焦显微镜观察P50-eGFP的融合蛋白亚细胞定位发现,P50蛋白定位于细胞质中。本研究初步探索了Dp CPV不同片段所编码的蛋白间的相互作用,同时对P50在昆虫细胞中的定位进行了探究。实验结果为后续研究P50蛋白的切割修饰机制提供基础数据,同时也为探究DpCPV非结构蛋白与结构蛋白的相互作用提供了方法学参考,而对P50蛋白的定位研究则为研究其他RNA病毒中的结构蛋白表达定位提供了可参考的方法,本实验的结果数据为探索DpCPV侵染昆虫细胞机制提供了相关实验依据。
杨苗苗[3]2012年在《思茅松毛虫核型多角体病毒及全基因组分析》文中认为松毛虫类害虫是我国重大森林害虫之一。思茅松毛虫Dendrolimus kikuchiiMatsumura属鳞翅目Lepidoptera枯叶蛾科Lasiocampidae松毛虫属Dendrolimus。目前防治该害虫以化学农药为主。杆状病毒具有很强的专化性，对环境和非靶标生物安全，是一种理想的病原微生物杀虫剂。世界上已有50多种商品化生产的杆状病毒杀虫剂用于农林害虫的控制。因此，寻找致病力强的杆状病毒来防治该害虫显得非常必要。目前，作者在云南思茅松毛虫重灾区采集到了一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒，主要研究结果如下：1.思茅松毛虫核型多角体病毒（DekiNPV）形态学和毒力研究发现了一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒，定名为DekiNPV。多角体呈不规则型，直径大小0.79~2.31μm（n=100），平均直径1.64±0.1μm，其表面凹凸不平，且有大量的长条形、圆形孔洞，长条形居多，大小（173.00~254.00）×(55.10~116.00) nm；一个多角体中有多个杆状病毒粒子，杆状病毒粒子长约（252.22~359.38）×（70.18~200.00）nm，两端钝圆或平截，其内含有1~9个核衣壳，大小（24.00~28.60）×（242.00~340.00）nm,平均大小25.80±0.86×265.00±12.66nm (n=50)，为多粒包埋型。用浓度2.2×104~2.2×108PIB/mL5个浓度的DekiNPV接种于3龄思茅松毛虫幼虫发现，DekiNPV对3龄思茅松毛虫幼虫有很强的毒力；LT50随着浓度的降低而增长，分别为6.89、7.18、8.16、10.31和11.13d，LC50为1.72×105PIB/mL；3龄思茅松毛虫幼虫感染DekiNPV后第7d幼虫开始大量死亡，死亡高峰期为感染病毒后的第7~10d。对在实验室连续传四代后的DekiNPV进行超微结构观察发现，传代后的DekiNPV形态结构与原代一致，具有稳定性。2. DekiNPV基因组全序列分析分析了DekiNPV全基因组序列，DekiNPV基因组大小为141，454bp， C+G含量为48.04%。预测DekiNPV含有146个开放阅读框(ORF)，其大小在150个核苷酸以上，并与其它ORF有最小的重迭。其中有133个DekiNPV的ORF与报道已测序的杆状病毒具有同源性，13个ORF为该病毒特有，占全基因组的12.4%。基于DekiNPV的29个杆状病毒核心基因构建了该病毒的进化树，进化分析发现DekiNPV属于鳞翅目杆状病毒Group Ⅰ组，与MaviMNPV、BomaNPV、BmNPV、PlxyMNPV、RoMNPV和AcMNPV亲缘关系近。DekiNPV基因组中含有16个保守的结构基因，DekiNPV基因组缺失P6.9和odv-e56。该基因含有抗凋亡基因iap-1，iap-2和iap-3。DekiNPV基因组含中有12个bro基因。DekiNPV分别与AcMNPV、BmNPV、ChchNPV、LdMNPV、MacoNPV-B、SeMNPV和XecnGV进行了基因对等比较分析，发现该病毒与AcMNPV和BmNPV表现出了最好的线性关系。同源区分析发现，DekiNPV中共有11个hr。3. DekiNPV的PCR检测方法根据DekiNPV特有阅读框ORF146设计两对引物建立PCR检测方法，用DekiNPV基因组DNA为模板扩增出了426bp和655bp片段，PCR产物经测序结果与引物选取片段大小一致。分别以两对引物对DekiNPV的基因组DNA、多角体进行检测，最小量检测均达到了0.8fg/mL DNA和5PIB/mL，在感病虫体内检测到了DekiNPV的存在。该方法具有灵敏度高、特异性强、早期检测等特点，可以用于DekiNPV寄主域、替代寄主和病毒在种群中动态变化等领域的研究。4. DekiNPV寄主域及其替代寄主的研究用11种鳞翅目昆虫（云南松毛虫Dendrolimus houi、马尾松毛Dendrolimus punctatus、文山松毛虫Dendrolimus punctatus wenshanensis、赤松毛虫Dendrolimus spectabilis、美国白蛾Hyphantria cunea、舞毒蛾Lymantria dispar、灰茶尺蠖Ectropis grisescens、棉铃虫Helicoverpa armigera、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小菜蛾Plutella xylostella和斜纹夜蛾Spodoptera litura）和两株昆虫细胞系[sf-9细胞和杨扇舟蛾细胞（CAF-clan II）]研究了DekiNPV的寄主域和替代寄主。研究发现DekiNPV具有很强的专化性，但DekiNPV可以诱发美国白蛾、云南松毛虫、马尾松毛、文山松毛虫和赤松毛虫体内潜伏性感染病毒。
吴萍[4]2010年在《家蚕感染质型多角体病毒差异表达基因研究》文中研究说明家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV)是养蚕业的主要病原之一,给养蚕业带来了巨大的经济损失。开展家蚕感染质型多角体病毒相关基因的研究,正确理解宿主与质型多角体病毒的应答与互作关系对质型多角体病的诊断及研发新的防治措施至关重要。本研究采用抑制消减杂交技术构建了家蚕感染BmCPV中肠和正常中肠正反向消减cDNA文库,测序分析共得到36个已知基因和20个新的ESTs序列。荧光定量PCR分析了3个上调基因(核糖体蛋白L11、铁蛋白和碱性核酸酶基因)及3个下调基因(抑制凋亡蛋白、丝氨酸蛋白酶及类胰蛋白酶基因)在感染BmCPV 6h、12h、24h、48h及72h后的相对转录水平。采用基因芯片技术比较分析了感染家蚕BmCPV的试验组与对照组中的差异表达基因。在感染24h、48h及72h后,分别得到了9个、51个及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明,在感染48及72h后,大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平发生了下调,所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平均发生了上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白基因的表达水平发生了上调,具有氧化还原酶活性功能的基因其表达水平均发生了下调。研究表明家蚕感染BmCPV后,体内的氨基酸代谢水平受到破坏,宿主细胞内蛋白质合成降低,一些与转录翻译相关的基因为了满足病毒增殖的需求被高水平表达。另一方面,宿主细胞为抵制病毒的入侵可能启动了凋亡机制来清除被感染的细胞,病毒的入侵也诱导了一些与自身免疫相关的基因的表达上调。采用快速末端扩增技术首次克隆了编码家蚕泛素活化酶E1功能蛋白1基因(ubiquitin-activating enzyme E1- domain containing 1, UbE1DC1)及另一个未知功能的家蚕假定蛋白基因的全长cDNA,并对其氨基酸序列进行了生物信息学分析。UbE1DC1基因全长cDNA为1919 bp,包含100 bp的5’非翻译区和637 bp的3’非翻译区。开放阅读框1182 bp,共编码393个氨基酸。该蛋白含有一个THiF_MoeB_hesA_family结构域,这是一个ATP结合位点,属泛素活化酶E1家族。家蚕假定蛋白基因全长cDNA为486 bp,包含108 bp的5’非翻译区和153 bp的3’非翻译区。开放阅读框225 bp,共编码74个氨基酸,该蛋白含二次跨膜结构,整个多肽链表现为疏水性,可认为是疏水性蛋白。UbE1DC1及家蚕假定蛋白基因在丝腺、血液、脂肪体、生殖体及中肠中均可表达,荧光定量PCR结果表明,UbE1DC1在正常中肠中的表达水平显着高于感染中肠中的表达水平,是其9.78倍。推测当BmCPV入侵家蚕后,UbE1DC1的转录水平下调,使得感染细胞免受凋亡而进一步增殖。家蚕假定蛋白基因在感染BmCPV中肠中的表达水平显着高于正常中肠中的表达水平,是其6.28倍。上调机制尚不清楚。研究结果为从分子水平上阐明BmCPV对家蚕的致病机理提供了新的理论依据和研究方向,为进一步研究UbE1DC1及家蚕假定蛋白基因与BmCPV感染的关系奠定了基础。
纪昌艳[5]2007年在《马尾松毛虫质型多角体病毒的流行病学研究》文中认为本论文由两章组成：第一章对质型多角体病毒的研究作了综述性介绍，包括对质型多角体病毒的分类、多角体、病毒粒子、感染质型多角体病毒昆虫的病症、质型多角体病毒的推广和应用以及昆虫病毒的流行病学等方面做了比较详细的阐述。第二章对马尾松毛虫质型多角体病毒的流行病做了初步的调查，应用巢式RT-PCR方法检测从野外释放“生物导弹Dp-Ⅰ”的林区采集马尾松毛虫单虫样本，结果发现：2006年释放“生物导弹Dp-Ⅰ”的王福店林区的松毛虫体内DpCPV阳性率为40～70％，平均阳性率为58％，相应对照区的阳性率为10～40％，平均阳性率为24％；2005年释放“生物导弹Dp-Ⅰ”的丁家畈林区松毛虫体内DpCPV阳性率为30～80％，平均值也为58％，相应对照区的阳性率为10～20％，平均值为16％。本实验结果在分子生物学水平上验证了卵寄生蜂是能够将昆虫病毒携带到目标害虫，并能够使没有被寄生的松毛虫卵孵化后的幼虫被病毒感染，最终导致病毒在整个林区的松毛虫种群内流行，同时实验结果还说明了“生物导弹Dp-Ⅰ”的应用能有效增强马尾松毛虫质型多角体病毒的扩散，诱导靶标害虫在林间形成病毒流行病。
贺倩, 刘小侠, 张青文[6]2010年在《昆虫质型多角体病毒的研究进展》文中认为质型多角体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV)隶属呼肠孤病毒科Reoviridae质型多角体病毒属Cypovirus,通常基因组由10个节段双链RNA构成。RNA分子量为3～27u。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异,目前CPV已被分为19个电泳型。不同于呼肠孤病毒科其它成员,CPV为单层衣壳,而不是常见的双层衣壳结构,衣壳蛋白主要由衣壳蛋白、大突起蛋白及塔式突起蛋白组成。大部分质型多角体病毒引起昆虫慢性疾病,造成寄主死亡或适应性降低。随着RNA病毒基因序列测定技术的成熟,质型多角体病毒的序列测定方面取得较大进展,目前GenBank核苷酸序列数据库中已经公布了家蚕Bombyx mori CPV电泳型1两个株系(H株和I株)、舞毒蛾Lymantria dispar CPV电泳型1、舞毒蛾CPV电泳型14及粉纹夜蛾Trichoplusia ni CPV电泳型全基因组序列,为该病毒的进化与起源的研究提供更多的遗传信息。本文从结构功能、侵染特点、基因组特点及应用前景等方面综述了昆虫质型多角体病毒的研究进展。
段兵[7]2004年在《文山松毛虫质型多角体病毒p44和p119基因的表达与分析》文中研究表明质多角体病毒（CPV）隶属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属。其宿主范围包括鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目等。迄今为止，已在 200 多种昆虫体内发现有 CPV 感染。CPV 在感染过程中，在被感染昆虫中肠上皮细胞的胞质内能产生被称为多角体的蛋白包涵体。CPV 基因组由 10 条双链 RNA(dsRNA)组成。由于缺少合适的细胞系以及不同型质多角体病毒的高度多样性，以致对不同质多角体病毒的蛋白功能和蛋白数目研究非常有限。 本文进行了对文山松毛虫质型多角体病毒 p44 基因和 p119 基因的克隆与原核表达的研究。将 p44 基因克隆到原核表达载体 pET－28a 上，用 IPTG 诱导表达，对表达的条件进行了优化。对不同来源的 p44 基因做了同源性分析。经测序 P44基因长 1174bp，编码含 390 个氨基酸，大约分子量为 43.7KDa 的蛋白。对 DpCPVp44 基因核酸序列推导的氨基酸序列分析知其与 BmCPV S8 片段、LdCPV－1 S8 片段和磷酸甘油酸变位酶有同源性。这表明 P44 可能是非结构蛋白。p119 基因全长 3177 个核苷酸，编码分子量大约为 120kDa 的由 1058 个氨基酸组成的蛋白。对其推导氨基酸序列同源性比较分析表明与 RRSV S2 片段和 RBSV S3 片段同源。
王成燕[8]2012年在《混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制》文中指出核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus, NPV)作为一类昆虫病原微生物,资源丰富,对害虫作用独特且对环境安全,是一种理想的害虫生物防治剂。但天然的昆虫病毒因宿主范围窄、作用速度慢和作用活性低,大大限制了其在生产上的应用。如何打破昆虫病毒的专化性以及提高它们的毒力成了拓宽昆虫病毒应用范围的重点和难点。NPV间自然重组现象较为普遍,不同NPV间重组可产生宿主域扩大病毒；另外病毒的毒力与宿主密切相关,在一种新宿主中的连续传代可提升其对传代宿主毒力,不过其对原宿主毒力显着下降。病毒在两种不同宿主中交替传代后,病毒能否对两种宿主同时具有高毒力?尚无实验证明。因此,研究不同病毒混合侵染后的宿主域变化及其在不同宿主中交替传代过程中的毒力演化对于揭示病毒进化规律及发掘宿主域扩大和病毒毒力提升具有着重要意义。本研究以鳞翅目重大害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和甜菜夜蛾S. exigua为靶标对象,首先研究两种病毒混合侵染后的宿主域变化,接着研究宿主域扩大病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中交替传代时的毒力演化,最后研究病毒多角体超微结构变化和遗传变异,主要研究结果如下：1病毒混合侵染后的宿主域扩大和交替传代时的毒力演化本文选用不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾NPV (SINPV)日本福冈株和不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾NPV (SeNPV)美国株,将它们共同侵染甜菜夜蛾后,获得了能同时感染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的宿主域扩大病毒株系,其对斜纹夜蛾的致病力与SINPV相当,致死中浓度(LC50值)无显着差异,同时对甜菜夜蛾也具备了一定的侵染力,但尚显着低于SeNPV对甜菜夜蛾的毒力。进一步将该病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这两种宿主中按4种模式进行交替传代,分别为以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的严格交替传代,以及以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的非严格交替传代,研究病毒毒力的演化规律。发现宿主域扩大病毒在经历斜纹夜蛾和甜菜夜蛾多代交替传递过程中,其对甜菜夜蛾的毒力有显着上升,且对斜纹夜蛾的毒力未有显着下降,但在传递20代过程中,除从斜纹夜蛾开始的严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾的毒力一直呈上升趋势,以甜菜夜蛾为起始宿主的严格交替模式以及两种非严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾毒力未一直呈上升趋势,在14代以内显着上升,此后则有所下降。研究表明两种宿主中的交替传代可以提高病毒对一种宿主的适应性且同时保持了其对另一种宿主的适应性。2混合侵染和交替传代后多角体超微结构变化通过透射电镜观察研究了病毒混合侵染和交替传代后其多角体超微结构变化。比较了混合侵染前、混合侵染后、交替传代后以及连续传代后病毒的多角体超微结构。观察结果表明,各病毒均属多粒包埋型病毒,混合侵染没有引起病毒多角体大小的改变,多角体直径无显着差异。但经以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代以及在斜纹夜蛾中的连续传代后,病毒多角体的直径显着减小。同时还发现混合侵染和交替传代都没有造成病毒多角体内病毒束数量的改变,多角体内病毒束平均数量在各病毒间无显着差异。但带来病毒束内核衣壳数量的变化,经过混合侵染及在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中的一次交替传代后,病毒束内平均病毒核衣壳数较起始的SINPV福冈株显着下降,在经历20代次交替后,仍显着低于福冈株,而在斜纹夜蛾中连续传代时病毒核衣壳的数量未有显着变化。另外从各病毒束内不同核衣壳的分布来看,SeNPV美国株中病毒束内核衣壳分布均匀,62.5%病毒束中病毒核衣壳数量为3个,而其余病毒则分布较广,在以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代后的病毒中,病毒核衣壳的数量在1-12个间。研究表明,SeNPV和SlNPV昆合侵染以及在两种宿主中交替繁殖后能够改变其多角体的组装,从而带来多角体超微结构的变化。3混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因变异通过基因组酶切、基因克隆分析研究了病毒混合侵染后的遗传变异。病毒基因组DNA限制性酶切结果表明,混合侵染后宿主域扩大病毒的基因组DNA酶切图谱较混合侵染前的SINPV福冈株没有产生明显变化,Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ这4种限制性酶切图谱均与混合侵染前一致。进一步对病毒多角体蛋白基因(polh)分析发现,病毒混合侵染后其polh基因序列较混合侵染前SlNPV在第281个碱基上发生突变,氨基酸序列也发生相应的变化。另还对宿主域扩大病毒细胞凋亡抑制基因(iap)进行了克隆,发现其与已报道的SpliNPV iap基因同源性达95%,与SlNPV中国株G2iap基因同源性和SlNPV日本株iap同源性均只有80%。4混合侵染和交替传代后病毒全基因组序列变化分析对混合侵染和交替传代前后叁个病毒株系的全基因组序列进行了分析,研究发现,SlNPV和SeNPV经过混合侵染后产生的宿主域扩大病毒,在基因组大小上较SlNPV福冈株变小,基因数量也有变化,少了1个基因,基因总长度也有增加；再经过交替传代,基因总长度进一步变长。再从各病毒基因总长度占基因组的百分比来看,混合侵染后产生的宿主域扩大病毒较混合侵染前SlNPV基因总长度占基因组百分增加,再经交替传递20代后,百分比进一步增加。各病毒株系GC含量变化不大。病毒基因组全序列具体分析则发现混合侵染后病毒lef-8(晚期表达因子)基因产生了一个碱基的变化,另外病毒基因组内有一个255bp片段的插入,且在进一步交替传递20代后,此变化仍存在。
何蕾[9]2014年在《家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组片段7（S7）功能的研究》文中提出家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cypovirus，BmCPV）是家蚕幼虫的主要病原微生物之一，能感染家蚕中肠细胞导致家蚕发生中肠型脓病，引起养蚕歉收。BmCPV基因组由10个dsRNA节段组成，S7节段编码结构蛋白VP7。本研究用VP7抗体通过免疫组织化学、Western blotting检测了VP7在细胞内的定位、切割、表达时相，探讨了抑制vp7基因表达对BmCPV增殖的影响，通过Co-IP筛选了VP7与宿主细胞互作候选蛋白，并通过质谱对候选蛋白进行了鉴定，研究结果为深刻理解S7节段编码的VP7的功能、BmCPV与宿主的互作提供了新的线索。1. BmCPV VP7的原核表达和多克隆抗体的制备将vp7基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，构建了重组质粒pET-28a-S7。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株并诱导表达，结果显示重组蛋白VP7的分子量约为55kDa。将重组蛋白VP7免疫成年小鼠，制备VP7抗体。Western blotting检测结果显示制备的多抗具有特异性，可用于VP7的检测。2. BmCPV VP7的切割分析为了分析BmCPV VP7是否被切割，将vp7基因克隆进pIZT/V5-His载体，构建了重组质粒pIZT/V5-His-S7，该质粒转染家蚕BmN细胞，经抗生素Zeocin筛选获得表达VP7重组蛋白的稳定转化细胞。用His6抗体进行Western blotting检测发现，转化细胞表达的重组蛋白VP7的分子量约为65kDa，比理论分子量略大。用VP7抗体进行Western blotting检测发现，除了65kDa的重组蛋白VP7外，还能检测到分子量约为35kDa的2种蛋白（V35a, V35b），推测VP7在转化细胞中被切割成了分子量较小的蛋白。对感染BmCPV6d的BmN细胞和感染BmCPV8d的中肠后部组织进行Western blotting检测，结果显示，在感染的BmN细胞和感染的中肠组织中，均可检测到分子量约为55kDa的蛋白条带，除此之外，在感染的BmN细胞中也可检测到分子量约为20kDa的蛋白条带，在感染BmCPV的中肠组织中也可检测到25kDa和20kDa的蛋白条带。说明VP7在病毒感染的细胞中被切割，但在感染的培养细胞和感染的中肠组织中切割方式存在差异，VP7在感染细胞与非感染细胞中的切割方式也存在不同。用VP7抗体对BmCPV病毒粒子进行Western blotting检测，发现除可检测到55kDa的特异性条带外，还能够检测到分子量约38、25和10kDa大小的3个蛋白条带，推测BmCPV病毒粒子中存在不同切割程度的VP7。3. VP7的亚细胞定位及BmCPV感染过程中VP7蛋白水平的变化分析对感染BmCPV8d的中肠后部进行组织免疫荧光检测发现，绿色荧光集中在细胞质中，表明VP7定位在细胞质。感染BmCPV1d～12d后的中肠后部组织蛋白定量后进行Western blotting检测，在感染7d的组织中，可检测到20kDa左右的蛋白条带；感染8d时，VP7表达量增加，可检测到55、25和20kDa蛋白；感染9d时，VP7表达量达到高峰，除可检测到55kDa蛋白外，也可检测到28、25、20和18kDa蛋白条带；10、11和12d VP7的表达与第9d相似，但多检测到1个分子量约为22kDa蛋白。推测VP7在病毒增殖的不同时期，其切割方式可能存在细微差异。4.抑制vp7基因表达对病毒增殖的影响为了进一步探究vp7基因表达对病毒增殖的影响，3龄起家蚕注射VP7-siRNA(1μg/头)，24h后，人工感染BmCPV，48h后检测vp7和vp1的RNA水平，结果显示vp7基因和vp1基因的相对表达水平分别下降了5.2倍和15.4倍；BmN培养细胞分别转染3种VP7-siRNA24h后，人工感染BmCPV，48h后检测vp7和vp1的RNA水平，结果显示vp7基因相对表达量分别下调17.5、9.7和4.7倍，vp1基因的相对表达量分别下调13.0、6.3和3.0倍，表明抑制vp7基因表达，可抑制BmCPV病毒的增殖。5. VP7相互作用宿主蛋白的筛选与鉴定为了研究VP7与宿主蛋白的相互作用，利用免疫共沉淀和质谱分析筛选鉴定与VP7互作的候选宿主蛋白，共鉴定到18种与VP7互作的宿主蛋白；信息分析结果显示，这些蛋白涉及到糖代谢、胆固醇代谢、核苷酸降解、线粒体与细胞质之间的阴离子转运、围食膜形成、免疫应答、转录调节、JH结合、蛋白降解、细胞周期与凋亡等各个方面。
乔鲁芹[10]2007年在《美国白蛾核型多角体病毒及其感病寄主检测方法的研究》文中提出从多方面研究了美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HcNPV)。内容包括：HcNPV形态特征、美国白蛾幼虫的感染HcNPV的病理过程、美国白蛾幼虫对病毒的敏感性、病毒对寄生性天敌昆虫白蛾周氏啮小蜂的影响、建立了荧光定量PCR和ELISA分析技术检测核型多角体病毒的方法，并对病毒在幼虫体内增殖动态进行了定量检测。主要研究内容和取得的结果如下：1、利用电子显微镜进行观察，发现美国白蛾核型多角体具有多种形态：有的为叁角形、四角形、也有五角型、六角型的，直径大小为0.8～2μm；为多粒子包埋型，囊膜大小为0.4～0.6μm×0.57～1.11μm；囊膜内病毒粒子的数目一般4-12个。2、测定了美国白蛾2～5龄幼虫对HcNPV的敏感性。2龄幼虫对HcNPV敏感性最高，5龄幼虫对病毒敏感性最低。幼虫感染病毒后，其半数致死浓度LC_(50)值随着幼虫龄期的增加而增大；3龄、4龄和5龄幼虫的LC_(50)值分别是2龄幼虫的14倍、105倍和3500倍。以每毫克幼虫体重半数致死中浓度(毫克体重的LC_(50)值)作为衡量幼虫对病毒敏感程度的指标，则2龄幼虫对病毒的敏感性分别是3龄、4龄和5龄幼虫的3.3倍、4.5倍和59.7倍。在相同龄期内，幼虫感染病毒后半数死亡时间随感染剂量的下降而升高。2龄幼虫在感染剂量为5.3×10~5 PIBs／mL、5.3×10~4 PIBs／mL、5.3×10~3 PIBs／mL时，LT_(50)值分别为4.6天、6天、8.8天；5龄幼虫在感染剂量为5.3×10~8 PIBs／mL、5.3×10~7 PIBs／mL时，LT_(50)值分别为12天、14.2天；而在相同剂量下，半数死亡时间随着龄期的增加而增加。在感染剂量为5.3×10~5 PIBs／mL时，2龄、3龄、4龄幼虫的LT_(50)值分别为4.6天、11.1天、14.7天，5龄幼虫在此剂量下，死亡率只有15％。结论为：美国白蛾幼虫对其HcNPV的敏感性不仅与幼虫体重相关，而且与龄期相关。3、美国白蛾幼虫在接毒后，不同组织细胞随时间推延而发生一系列的病理变化。在感染病毒后48h，观察到中肠细胞核内产生浅色的环状带；在感染后120h，体壁真皮细胞发生异常分裂增生，出现双层细胞结构；在168h真皮细胞层出现3～4层细胞结构，这是HcNPV感染的特有症状；感染后216h，体内大部分组织解体，成熟的多角体充满体腔，幼虫濒于死亡。4、根据美国白蛾核型多角体病毒的多角体蛋白基因Polyhedrin的保守序列，利用引物设计软件Beacon Designer 5.0设计了特异性引物。用SYBR Green荧光染料法构建了标准曲线y=-3.450x+36.154，检测灵敏度为10~1～10~2copies／μL。建立了快速检测美国白蛾核型多角体病毒的方法。5、通过已建立的荧光定量PCR检测HcNPV多角体蛋白基因Polyhedrin的方法，对感病幼虫的中肠、血淋巴及整个虫体进行了检测。发现中肠细胞在感病后12～108h内，每毫克肠重的Polyhedrin基因拷贝数在10~4～10~5copies范围内波动，在此范围内并没有呈现出明显的增高或降低的趋势；血淋巴样本Polyhedrin拷贝数在3～108h内呈现增长趋势，但范围保持在10~4 copies／μL之内。幼虫样本每毫克体重Polyhedrin拷贝数对数值与感染时间(h)对数值呈直线相关，回归方程式为：y=3.901x±1.094(R=0.966，P＜0.01)。6、建立了间接ELISA检测样品中的美国白蛾核型多角体的方法，确定兔抗美国白蛾核型多角体病毒最佳抗血清蛋白的含量为53.65μg／mL，美国白蛾病毒液抗原最佳浓度为10~7PIBs／mL，最佳封闭条件为0.5％BSA+2％蔗糖封闭37℃水浴2h、4℃24h。美国白蛾病毒抗原的最小检出量为0.304μg／mL，即1.77×10~4PIBs／mL。7、美国白蛾核型多角体病毒浓度在3.12×10~5～1.0×10~7PIBs／mL范围内其对数值与吸光度OD_(490)呈线性关系；在死亡前两天幼虫体内多角体达到平台期。8、选取了包括HcNPV在内的目前我国利用药剂防治美国白蛾中有代表性的几种，模拟林间施药方式，研究了它们对美国白蛾的重要寄生性天敌—白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea Yang成蜂安全性。同时研究了HcNPV对白蛾周氏啮小蜂繁殖的影响。结果表明：化学农药对白蛾周氏啮小蜂成蜂的寿命有显着影响；仿生农药和生物杀虫剂对成蜂寿命没有显着影响；而核型多角体病毒对小蜂繁殖没有显着影响。以上研究结果表明在美国白蛾幼虫期使用HcNPV病毒、蛹期放蜂的综合治理美国白蛾的技术是科学而可行的。
参考文献：
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[4]. 家蚕感染质型多角体病毒差异表达基因研究[D]. 吴萍. 中国农业科学院. 2010
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[6]. 昆虫质型多角体病毒的研究进展[J]. 贺倩, 刘小侠, 张青文. 昆虫知识. 2010
[7]. 文山松毛虫质型多角体病毒p44和p119基因的表达与分析[D]. 段兵. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2004
[8]. 混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制[D]. 王成燕. 南京农业大学. 2012
[9]. 家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组片段7（S7）功能的研究[D]. 何蕾. 苏州大学. 2014
[10]. 美国白蛾核型多角体病毒及其感病寄主检测方法的研究[D]. 乔鲁芹. 中国林业科学研究院. 2007
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