【摘要】 目的：建立功劳木溶液微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法对需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法，控制菌检查法进行方法验证。结果：采用5倍稀释法进行需氧菌计数和金黄色葡萄球菌检查，采用常规法进行霉菌和酵母菌计数、控制菌铜绿假单胞菌检查，5种试验菌回收率均＞50%，控制菌阳性菌生长良好。结论：确定了功劳木溶液的微生物限度检查方法，可以客观地反映药物中的微生物污染情况，有效控制其质量。
【关键词】功劳木溶液；需氧菌；霉菌及酵母菌；控制菌；微生物限度检查
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）03-0393-02
功劳木溶液是我院制剂室生产的以功劳木为主要成分的外用中成药制剂，功能清热解毒，消炎杀菌，在我院有几十年的使用历史，疗效确切。考虑到主要成分盐酸小檗碱对需氧菌、霉菌及酵母菌存在一定的抑制作用[1]，常规方法不一定能真实反映药品中微生物污染情况，现按照《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法（通则1105、1106、1107）[2]有关规定，建立微生物限度检查方法，并对所采用的检查方法进行方法验证，以确认供试品的抑菌活性和保证检测方法的可靠性。
1.材料
1.1 仪器设备
YP1201N电子天平、101A-3B型电热干燥箱、LDZX-30FBS高压蒸汽灭菌器、BSC-1300ⅡB2型生物安全柜、SPX-150B-Ⅱ恒温培养箱、MJ-160B-Ⅱ霉菌培养箱
1.2 培养基
胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、溴化十六烷三甲基铵琼脂培养基、甘露醇琼脂培养基，均为广东环凯微生物科技有限公司生产
1.3 试药
1.3.1消毒液 5%石碳酸溶液、75%乙醇溶液。
1.3.2稀释剂 pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液。
1.3.3菌种 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉，均来自中国医学细菌保藏中心，传代次数不超过5代。
1.3.4样品 功劳木溶液 批号：20150908；20151015；20151130。
2.方法及结果
2.1 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时；接种白色念球菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。分别取上述培养物适量，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu（铜绿假单胞菌为10～100cfu）的菌悬液。接种黑曲霉的孢子至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，于20～25℃培养5～7天，使大量的孢子产生。加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花的无菌吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。
2.2 供试液的制备
取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 ml，制成1:10供试液。
2.3 计数法的建立及验证
2.3.1试验组 常规平皿法：取上述制备好的供试液，加入1ml试验菌液（使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu），混匀，取混合液1ml注入平皿中，立即倾注45℃约15ml琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，细菌置30～35℃培养48h，真菌置20～25℃培养72h，点计结果。
培养基稀释平皿法：取混合液0.2ml注入平皿，其余同常规平皿法。
2.3.2菌液组 除不加供试液外，其余操作同试验组，以测定所加入的试验菌数。
2.3.3阴性对照组 不加菌，以稀释剂代替供试品，方法同试验组。
2.3.4供试品对照组 除不加菌悬液外，其余操作同试验组，以测定供试品本底菌数。
2.3.5 回收率计算：
2.4 控制菌检查方法的建立及验证
2.4.1试验组 铜绿假单胞菌：取供试液（1：10）10ml和10～100cfu铜绿假单胞菌加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取胰酪大豆胨增菌培养物划线于溴化十六烷三甲基铵平板，30～35℃培养18～72小时，观察其菌落形态。
金黄色葡萄球菌：取供试液（1：10）10ml和10～100cfu金黄色葡萄球菌加入100ml，200ml，500ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取胰酪大豆胨增菌培养物划线于甘露醇琼脂平板，30～35℃培养18～72小时，观察其菌落形态。
2.4.2阴性对照组 不加菌，以稀释剂代替供试品，方法同试验组。
2.4.3阳性对照组 不加供试液，方法同试验组。
2.4.4样品组 不加菌，方法同试验组。
2.5 结果
2.5.1预实验结果 预试验结果表明，常规平皿法金黄色葡萄球菌试验组回收率为15.6%，其余各菌种回收率均大于50%，显示功劳木溶液对金黄色葡萄球菌有抑制作用，故采用培养基稀释法进行金黄色葡萄菌回收率试验。
2.5.2回收率试验结果 从表1可知，采用培养基稀释平皿法进行金黄色葡萄球菌的回收率试验，常规平皿法进行大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验，结果在0.5～2之间，符合要求。
表1 三批样品试验菌株回收率(%,n=3)
2.5.3控制菌试验结果 对铜绿假单胞菌进行检查，样品组，阴性对照组无菌生长，试验组（接种至100ml增菌液），阳性菌对照组有菌生长，说明采用常规法方法可行。对金黄色葡萄球菌进行检查，样品组，阴性对照组无菌生长，试验组（接种至500ml增菌液），阳性菌对照组有菌生长，说明采用培养基稀释5倍法方法可行。
3.讨论
由参考文献可知，功劳属植物对多种细菌及霉菌均有抑制作用[3，4]，根据实验结果，实验条件浓度下的功劳木溶液仅对金黄色葡萄球菌有抑制作用，并且通过培养基稀释法可以消除抑制作用，客观反映药物中微生物的污染情况。根据方法验证结果，总结功劳木溶液微生物限度检查法为：取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，制成1:10供试液。采用培养基稀释5倍法进行需氧菌计数和金黄色葡萄球菌检查，采用常规法进行霉菌和酵母菌计数，控制菌铜绿假单胞菌检查。
【参考文献】
[1]董雷，杨晓红，刘银燕等.十大功劳属植物的药理作用[J].中国现代药物应用，2007，1(6):72.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典 2015年版 四部[S].北京:中国医药科技出版社，2015:140-149.
[3]杨淑文.32种中草药抑菌活性的比较研究[J].安徽农业科学，2011，39(8):1361.
[4]欧阳蒲月，朱翠霞，陈劲锡等.宽苞十大功劳提取物抑菌活性的初步研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32(3):15.
基金项目:全国中药特色技术传承人才项目，国中医药人教函[2015]168号
论文作者:游燕,黄丁英
论文发表刊物:《医药前沿》2017年1月第3期
论文发表时间:2017/2/21
标签：培养基论文; 溶液论文; 葡萄球菌论文; 方法论文; 功劳论文; 铜绿论文; 金黄色论文; 《医药前沿》2017年1月第3期论文;