黑龙江省大庆市红岗区杏树岗镇卫生院 163512
【摘 要】目的 对2011～2013年大庆市手足口病病例的不同标本进行病原体检测和分析，了解到大庆市的手足口病感染状况。方法 对临床诊断为手足口病的患者的粪便标本460份，咽拭子标本549份（EV阳性345份，EV71阳性23份，CA16阳性13份），用RT-PCR是实时荧光定量PCR检测肠道通用病毒、CVA16和EV71，华山的急性期血清采用酶联免疫吸附试验检测EV71和CAV16的IgM抗体。结果 患者的粪便标本肠道病毒总阳性率为82.26%（378/460），CVA16的阳性率为37.40%（172/460），EV71的阳性率为25.41%（116/460），其他肠道病毒为19.66%（90/460），CVA16行阳性率高于EV71。粪便标本的肠道病毒阳性率高于咽拭子的38.75%（345/549）（χ2=27.01，P<0.01）。发病年龄多为1～5岁，主要集中在3岁左右，男性患者多余女性患者。对手足口病病例的急性期血清进行酶免疫检测，EV71和CVA16的阳性率分别为28.70%（31/108）和33.33%（36/108），和粪便标本的阳性率的核酸检测比较，有较高的相关性。结论 2011～2013年度本市的手足口病疫情以肠道病毒通用型为主，粪便标本的阳性率较高，急性期血清的免疫实验结果和分子生物系相符，采用分子生物学方法检测手足口病的病原体，用酶联免疫吸附试验检测血清抗体，对手足口病的诊断有重要作用。
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【关键词】手足口病；肠道病毒；EV71；CA16
Abstract：the pathogen detection and analysis of different samples of 2011 ~ 2013 in HFMD cases，learned that the city of HFMD infection. Methods the clinical diagnosis of stool specimens of HFMD patients in 460 samples，549 samples of pharynx swabs（345 were EV positive，23 were EV71 positive，13 were positive for CA16），with RT-PCR real time fluorescence quantitative PCR detection of enterovirus，CVA16 and EV71，Huashan's acute phase serum by ELISA the adsorption of IgM antibody test for the detection of EV71 and CAV16. The stool specimens of the patients with intestinal virus positive rate was 82.26%（378/460），the positive rate of CVA16 was 37.40%（172/460），the positive rate of EV71 was 25.41%（116/460）and other enterovirus 19.66%（90/460），CVA16 positive rate was higher than EV71. The positive rate of enterovirus stool specimens is higher than that of pharyngeal swab 38.75%（345/549）（2=27.01，P<0.01）. The age of onset was 1 to 5 years old，mainly concentrated in the age of 3 years old，male patients with excess female patients. On foot and mouth disease cases in acute phase serum by enzyme immunoassay，the positive rate of EV71 and CVA16 were 28.70%（31/108）and 33.33%（36/108），comparison of nucleic acid detection and positive rate of stool specimens，had a higher correlation. Conclusion the 2011 ~ 2013 year in the city of HFMD with enterovirus universal type，stool positive rate is higher，the immune experimental results in acute phase serum and molecular biology are using molecular biology method to detect the pathogen of HFMD，adsorption detection of serum antibody test by ELISA，plays an important role in diagnosis on foot and mouth disease.
Key words：hand，foot and mouth disease；intestinal virus；EV71；CA16
手足口病（Hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒（EV）引起的常见传染病，多发生于5岁以下儿童，大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，个别重症患儿如果病情发展快，可导致死亡[1]，引起手足口病最常见病原为柯萨奇病毒A组16型（CVA16）和肠道病毒71型（EV71），2007年北京市将手足口病纳入全市传染病常规报告系统，2008年5月2日起，手足口病纳入我国丙类传染病管理，大庆市红岗区自2006年初开始有手足口病例报告，近年来，HFMD发病率显著升高，并呈现季节性流行和全年散发趋势，现对2011～2013年大庆市红岗区手足口病病原学监测数据进行分析，探索手足口病病原学特征，为手足口病防控工作提供科学依据[2]。
1 材料与方法
1.1标本采集对象的选择和数量 标本采集对象为疫情出现时手足口病的临床诊断病例。用于进行检测的标本有粪便、咽拭子和血清。临床标本在运输和贮存过程中避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在 0～8℃运输和保存。进入实验室后，不能立即进行检测的放置于-80℃冰柜中低温保存，其中包括本地医院临床诊断为手足口病的患者粪便标本460份，咽拭子549份，血清108份。
1.2标本的种类及采集于运输 粪便标本：采集患者发病7d内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量为5～8g/份，采集后的粪便立即放入无菌采便管内，4℃暂时保存或者于12h内送到实验室，-0℃以下低温冷冻保存，若需要长期保存则将标本置于-80℃冰箱内。
咽拭子标本：采集患者发病3d内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用的棉签采集，适度用力擦拭涂抹于咽后壁和两侧的扁桃体部位，应避免触及舌部；然后迅速将棉签放入装有3mlHank’s保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧封盖并密封，以防止干燥。4℃暂存或12h内送入实验室，-20℃以下低温冷冻包藏，若需要长期保存则将标本置于-80℃冰箱。
血清标本：采集发病0～3d的急性期病例血清用于抗体检测。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于-20℃以下的冰箱中冷冻保存。
1.3主要试剂和仪器 检测试剂采用中山大学达安基因公司制备的荧光法专用核酸检测试剂盒。严格按照试剂盒说明书操作进行病毒RNA抽提，设计引物，应用abi7500荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR检测。
1.4标本处理 在生物安全柜内，取5g左右的手足口病病例的粪便标本，放入50ml离心管，标记标本号，每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠和1ml氯仿；用振荡器剧烈振荡40min；用冷冻离心机1500g离心20min；在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个带螺旋盖的冻存管中；一管粪便悬液冻存于-70℃作为备份，另一管用于病毒检测和病毒培养。
咽拭子要在标本保存液中充分搅动或振荡（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒！然后在4℃条件下，10000r/min离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。
1.5 Real time-PCR扩增 荧光定量PCR法的反应体系和反应参数依据试剂说明书操作。
1.6统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，应用χ2检验分析多个总体率或构成比之间差异有无统计学意义。
2 结果
2.1不同标本之间的检测结果 2011～2013这3个年度的检测结果，对手足口患者所采集的标本有粪便标本、咽拭子标本、血清标本三类。在粪便标本中，选择合适的标本460份。其中，粪便和咽拭子两类标本核酸检测的肠道病毒阳性率分别为82.26%和37.40%，粪便标本的肠道病毒阳性率高于咽拭子的38.75%（345/549）（χ2=27.01，P<0.01），两类标本的阳性率之间具有显著性差异。急性期的血清标本采用ELISA检测，虽然只能检测EV71和CVA16，但阳性率较高。
2.2 RT-PCR和Real time检测结果
2.2.1手足口病的RT-PCR检测结果10份标本的手足口病肠道病毒通用引物RT-PCR结果显示，10份标本俊文阳性，基因扩增片段为116bp。16份标本的手足口病肠道病毒EV71特异性引物的RT-PCR结果显示，2、3、4、6、9、10、16号标本为阳性，基因扩增片段为226bp。在手足口病肠道病毒CVA16特异性引物的RT-PCR结果中显示，除了8、9均为阳性，基因扩增片段为208bp。
3 讨论
手足口病属于全球传染病，世界大部分地区均有手足口流行病的报道。我国于1981年开始在上海，以后北京、河北、福建等10多个省市先后都有报道。1999年夏季在厦门市流行的手足口病证实为EV71型引起。1985年香港出现EV71流行病，1987年湖北省也出现 EV71流行病。1998年中国台湾出现了历史规模最大的手足口病大流行，诊断129106例，其中405个儿童为重症病例，死亡78例[3]，2008年3月在安微，手足口病爆发是由EV71引起，同样出现多例死亡病例[4]，EV71引起重症感染的比例较大[5]，引起全社会的高度关注。2006、2007年，龙岩市均有手足口病散发的病例，实验室检测证实由 COXA16感染引起，患者病情较轻。2008年9月下旬，龙岩市手足口病爆发、流行，疫情波及全市各个县（市、区），出现多例重症病例，其中1例死亡。
手足口病的发病年龄多为1～5岁，主要集中在3岁左右，男性患者多余女性患者。对手足口病病例的急性期血清进行酶免疫检测，EV71和CVA16的阳性率分别为28.70%（31/108）和33.33%（36/108），和粪便标本的阳性率的核酸检测比较，有较高的相关性。2011～2013年度本市的手足口病疫情以CVA16为主，粪便标本的阳性率较高，急性期血清的免疫实验结果和分子生物系相符，采用分子生物学方法检测手足口病的病原体，用酶联免疫吸附试验检测血清抗体，对手足口病的诊断有着重要作用，但是通常情况下，Cox A16引起的疾病预后相对较好，多为散发，极少导致手足口病的大规模暴发；而EV71型肠病毒则较凶险，除了引起手足口病以外，EV71较 Cox A16所致手足口病有更多机会可引起严重中枢神经系统并发症。因此，在今后临床中应注重埃可病毒感染手足口病患者的防治工作，尤其是EV71型患者，收治重点为早发现、早治疗，避免危重症的发生。
在本研究结果中显示的数据中可以看出，手足口病患者中多以EV、EV71型为主，说明在患者当中多以埃可病毒属感染为主要病源，可能存在EV型和非EV71亚型协同感染；CoxA16仅仅占了很少数的比例。通过研究，我们可以为手足口病预防和控制提供更好的依据，更好的分析病因，掌握病毒病原体的流行特征，找出解决手足口病的办法，更快的治疗手足口病患者，使患者更早的脱离痛苦。以此，以减少手足口病的流行爆发、传染，以及死亡病例的发生。
参考文献：
[1]周世力，杨帆，金奇，等.肠道病毒71型的研究进展[J].病毒学报，2003.19（3）：284-286.
[2]崔爱利，许文波，李秀珠.肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J].病毒学报，2004，20（2）：16-165.
[3]杨秀惠，何家鑫，严延生，等.一起手足口病爆发的病原性诊断与分析[J].中国人兽共患病学报，2007，23（4）：323-326.
[4]冯云，张文宏.肠道V71型及其相关疾病研究进展[J].中华传染病杂志，2008，26（7）：396-398.
[5]周方求，吴锦如，刘立志.PCR-荧光探针发对手足口病不同样品病原学检出率比较[J].实用预防医学，2009，16（1）：259.
论文作者:王凤丽
论文发表刊物:《航空军医》2016年第21期
论文发表时间:2016/11/24
标签：手足论文; 标本论文; 粪便论文; 病毒论文; 肠道论文; 血清论文; 病例论文; 《航空军医》2016年第21期论文;