一、大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达（论文文献综述）
孙杨[1]（2021）在《基于比较转录组学分析代谢改造粘质沙雷氏菌JNB5-1高效合成灵菌红素》文中研究表明灵菌红素（Prodigiosin,PG）是主要由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）产生的一种次级代谢产物,由于其具有免疫抑制和抗癌活性,并且可以替代合成着色剂,有望成为食品着色剂的来源等特性,微生物法合成PG已引起越来越多的关注。S.marcescens JNB5-1可以在30℃时高效合成PG,但在37℃或更高的温度下其合成PG的能力会明显受到抑制,研究其受温度调控对于指导PG工业化生产具有重要意义。本研究通过比较转录组学分析初步解析了温度调控灵菌红素合成的机制,并以此为基础,对S.marcescens JNB5-1进行了系统代谢工程改造,显着提高了重组粘质沙雷氏菌合成PG的效率,主要研究结果如下:（1）对粘质沙雷氏菌灵菌红素合成型（30℃培养）和非合成型（37℃培养）分别在12 h、24 h、36 h取样,通过转录组测序探索PG合成的机制。首先,合成型分别在profile0、1、3中富集到871、422、1029个差异基因,非合成型分别在profile 4、7、6中富集到792、613、684个差异基因。其次,合成型和非合成型之间分别鉴定出751、1702、1941差异表达基因。具体而言,低温有利于PG合成基因簇基因的转录表达,而较高温度则导致翻译、二硫键等基因转录水平下降（暗示蛋白质的不稳定）。同时,群体感应（AI-2）,双组分调节系统（Pho BR和Kdp DE）和sRNA（Csr A和Hfq）等相关基因的转录水平在30℃时上调,以调节PG的生物合成,并参与菌株的毒力和PG的外排。此外,与PG合成相关的代谢途径,例如丙酮酸、不饱和脂肪酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸代谢途径,其编码基因响应温度调控,并且代谢流在30℃时指向PG的生物合成。然而,抑制因子Cpx AR、CRP、Glr KR和Ssr S的转录水平在37℃发生了上调,可能与粘质沙雷氏菌在37℃不能合成PG有关。（2）在37℃或更高温度下,PG合成途径中的氧甲基转移酶（PigF）的转录水平急剧下降。因此,我们尝试通过设计多聚核苷酸片段（polynucleotide fragment,PNF）并将其引入pig F基因和灵菌红素合成基因簇来改善PigF及基因簇的转录稳定性,并观察其对PG产生的影响。首先,利用gfp作为报告基因发现,在3’-UTR添加PNF可以显着提高其mRNA的半衰期。其次,对PNF工作原理进一步分析发现,PNF改变了基因转录水平而不是翻译速率,从而增加了蛋白质表达量。当PNF长度在9 nt和12 nt之间,腺嘌呤的占比约为73-84%时,PNF更有效的改善基因的表达。最后将效果最好的PNF“AAATTT”引入pig N基因,发现PNF可以有效地提高粘质沙雷氏菌合成PG的能力,重组菌在37℃液体LB培养基中能合成PG。（3）随后,通过理性设计二硫键来消除PigF中游离的半胱氨酸进而提高PigF的热稳定性。首先,通过定点突变获得PigF突变酶G176C/M245CPigF、S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF,并验证其二硫键的形成。其次对突变酶热稳定性研究发现,突变酶在热稳定性和半衰期方面具有较为明显的提高,G176C/M245CPigF（6.70 min）、S53CPigF（8.15 min）和G176C/M245C/S53CPigF（8.31 min）的半衰期分别是野生型PigF（4.42 min）半衰期的1.52、1.84和1.88倍。尤其是G176C/M245C/S53CPigF的催化效率和比酶活方面较原始酶分别提高了56.0%和50.1%。最后,分子动力学模拟结果表明二硫键的引入并没有显着改变突变酶的二级结构但提高了酶的刚性,从而提高了热稳定性。（4）CpxR蛋白是革兰氏阴性细菌中的OmpR家族转录调节因子。首先,通过q PCR对cpx系统动态转录水平分析发现,该系统响应温度变化,在37℃时cpx系统相关基因的转录水平上升,而在30℃时其转录水平降低。其次,S.marcescens JNB5-1中cpxR的插入失活增加了PG的合成量,发现在JNB5-1ΔcpxR中,涉及pig基因簇以及脯氨酸、丙酮酸、丝氨酸、蛋氨酸、S-腺苷蛋氨酸等代谢途径中的基因的转录水平均显着增加,从而促进了PG的合成。最后,EMSA结果表明,CpxR可以与pig基因簇的启动子结合,并抑制JNB5-1中PG生物合成相关基因的转录水平,从而调控灵菌红素合成。细菌双杂交、Pull-down和体外磷酸化实验确定第51位天冬氨酸为CpxR的关键磷酸化位点且CpxRD51A不能与pig基因簇的启动子结合,从而确认JNB5-1通过磷酸化激活转录CpxR行使调控功能。（5）通过组合优化粘质沙雷氏菌中灵菌红素合成基因簇基因转录稳定性、PigF蛋白稳定性、解除CpxR的抑制、重塑PG合成代谢流,获得一株高产PG重组菌株JNB5-1/S4。经1L摇瓶发酵实验,JNB5-1/S4在30℃合成PG最高产量可达10.03 g/L,比原始菌JNB5-1提高了86.8%;在37℃合成PG最高产量可达0.87 g/L,比JNB5-1高129.6%。
邵宇[2]（2021）在《重组大肠杆菌全细胞催化合成苯乳酸》文中指出L-苯乳酸是一种天然抑菌物质,对多种病原微生物有广谱抑制作用,有望成为一种新型生物防腐剂。苯乳酸对人和动物细胞均无毒害,在食品、医药、工业等领域发挥重要作用。基于其有良好的稳定性以及光谱抑菌特征,在生产加工过程中存在巨大的潜力。本研究通过构建多酶级联催化反应体系,提高大肠杆菌（Escherichia coli）合成L-苯乳酸的能力。利用共表达L-氨基酸脱氨酶和苯丙酮酸还原酶并偶联葡萄糖脱氢酶进行辅酶再生,建立一种新型L-苯乳酸生物合成方法。各基因成功在大肠杆菌中表达,并对全细胞转化条件进行优化。利用RBS序列优化和增加葡萄糖脱氢酶的拷贝量,有效解决中间产物苯丙酮酸抑制影响,提高了L-苯乳酸的产量。提供了一种简洁、高效的生物催化方法,为实现规模化生产奠定了基础。（1）克隆表达来自普通变形杆菌Proteus vulgaris来源的L-氨基酸脱氨酶（L-AAD）基因laad,研究温度和p H对其催化稳定性的影响,最适反应温度为35℃,最适反应p H为8.0。对不同来源的还原酶进行选择,通过比较酶活和对苯丙酮酸的催化能力选择乳酸杆菌Lactobacillus sp.CGMCC 9967来源的苯丙酮酸还原酶（La PPR）,研究发现最适反应温度和p H分别为30℃、7.0。对辅酶自循环体系进行筛选,比较选择葡萄糖脱氢酶（GDH）有较好的转化速率。（2）初步构建多酶级联共表达体系,当提供足够的苯丙氨酸和葡萄糖时,底物苯丙氨酸可大量被消耗,此时中间产物苯丙酮酸大量积累,浓度达到27.89 g·L-1,而最终产物L-苯乳酸产生速率较为缓慢,随着反应的进行逐渐趋于稳定,最终只生产5.67 g·L-1。中间产物积累浓度较高,影响整个反应顺利进行。可能是由于转化过程中存在关键酶转化不平衡,从而影响苯丙酮酸转化至L-苯乳酸的催化速率。（3）利用RBS分析网站,将不同强度的RBS序列组装到重组质粒pET28a-lappr上,并与葡萄糖脱氢酶（GDH）串联,获得不同RBS强度还原酶和脱氢酶共表达重组菌E.coli/pET28a-rbs1-5-lappr-gdh。当RBS序列更换为rbs2和rbs3时,La PPR的表达显着增加。对酶的添加比例进行调整,研究发现关键酶GDH:La PPR达到最佳催化反应速率时的最适酶活比例为4:1。（4）为了协调具有一个载体的共表达菌株中La PPR和GDH的表达水平,增加GDH的拷贝量。通过调节全细胞生物催化剂中酶的表达,当GDH为2个拷贝量时,中间产物苯丙酮酸的积累减少,减少了84.60%,L-苯乳酸产量有较大的提高,产量增加了3.77倍。对反应转化条件进行优化,最终产量达到21.39 g·L-1,摩尔转化率为71.33%。为提供挖掘成本低廉并能高效转化的生物催化合成苯乳酸的方法具有借鉴作用,同时对其在食品及合成药物行业生产具有广泛的指导意义。
朱灵桓[3]（2021）在《代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇》文中研究说明β-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香醇,因其优越的物化性质而被广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前β-苯乙醇的工业生产方法以成本较高的物理提取法和污染严重的化学合成法为主,这极大地限制了β-苯乙醇的应用范围。利用微生物合成法制备β-苯乙醇具有产品品质优良、环境友好等优势,逐渐成为国内外研究的热点。本课题以酿酒酵母CICC31906 WT-A为研究对象,围绕β-苯乙醇的合成路径解析展开。通过莽草酸途径的改造,实现β-苯乙醇以葡萄糖为前体的从头合成;通过艾氏途径的异源酶表达,建立氨基受体回补的高效合成策略;基于组学技术,在酿酒酵母抗β-苯乙醇胁迫及高产菌株中,解析合成途经相关的调控机制,挖掘关键基因。主要研究内容和主要成果如下:（1）在酿酒酵母中构建以葡萄糖为前体的芳香醇合成途径。解除关键酶的反馈抑制,筛选并表达抗反馈抑制的异源酶,分别为大肠杆菌来源的抗反馈抑制的DAHP合酶(由基因aro GD146N编码)和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶(由基因phe Afbr编码)。发现了限制酿酒酵母五功能酶Aro1p反应速率的关键节点是莽草酸,表达了大肠杆菌来源的莽草酸激酶基因aro L和莽草酸脱氢酶基因ydiB。敲除L-苯丙氨酸转氨酶基因ARO9同时过量表达苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10以减少苯丙酮酸分流,并比较敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1和过表达酮醛转移酶基因TKL1的合成效果。基于上述整合与游离高效表达系统的芳香醇合成途径的组装和表达,酿酒酵母以葡萄糖为碳源、酵母粉与不含硫酸铵和氨基酸的YNB为氮源,合成酪醇与β-苯乙醇的产量分别提高至543 mg/L和641 mg/L,是对照菌株WT-A的5.7倍和6.1倍。（2）利用异源酶的表达在酿酒酵母中搭建β-苯乙醇的高效转化途径。通过单因素筛选,将大肠杆菌来源的L-苯丙氨酸转氨酶Tyr B、乳酸乳球菌来源的苯丙酮酸脱羧酶Kdc A和酿酒酵母来源的乙醛脱氢酶Adh2融合表达于酿酒酵母中,以L-苯丙氨酸为主要氮源的摇瓶发酵得到β-苯乙醇产量为3.13 g/L。其次,引入链霉菌来源的L-谷氨酸氧化酶,实现转氨反应的氨基受体α-酮戊二酸的回补。发现丙酮酸脱羧酶基因PDC5的缺失对β-苯乙醇的合成具有明显的促进作用,整合上述因素对艾氏途径重构优化,以6.7g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵,β-苯乙醇的产量由对照菌株WT-A的2.88 g/L提高至3.59 g/L,对L-苯丙氨酸的摩尔转化率为0.72 mol/mol。（3）基于转录组学,解析PDC5的敲除促进β-苯乙醇合成的调控机制。酿酒酵母pdc5△突变株RM22在以L-苯丙氨酸为前体的培养基中β-苯乙醇产量比对照菌株WT-A高28%。通过对照菌株WT-A和突变株RM22的转录组测序分析,发现涉及氧化还原、胁迫应答等功能的87个基因发生差异表达,其中60个基因显着上调,27个基因显着下调;与此相关的有27个途径,包括细胞内代谢、次级代谢产物的生物合成和氨基酸的生物合成等。通过对β-苯乙醇合成相关的差异表达基因进行分析与验证,确定编码芳香族氨基酸转氨酶基因ARO9的上调是引起菌株RM22中β-苯乙醇合成量增加的主要原因。（4）基于重测序与比较基因组学,在酿酒酵母中挖掘耐受和合成β-苯乙醇的关键基因。通过适应性进化的方法筛选出耐受高浓度β-苯乙醇胁迫的酿酒酵母菌株AD032,其耐受β-苯乙醇和合成β-苯乙醇的能力与对照菌株WT-A相比都有显着提高。从此菌株出发,得到的重组菌株KM032(AD032 pdc5△PTPI-tyr B-kdc A-ADH2 PTPI-LGOX)以6.7 g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵,β-苯乙醇的产量为4.26 g/L,对L-苯丙氨酸的摩尔转化率为0.86 mol/mol。通过对菌株AD032的重测序和比较基因组学分析,发现涉及生物过程、细胞过程和分子功能等的113个基因或ORF的191个氨基酸位点发生突变。进一步探讨和挖掘与β-苯乙醇代谢相关的关键基因,突变基因中己糖转运蛋白（HXTs）、泛素（UBI4）以及相关调控因子（SWI1-SNF2）的过表达均能显着提高酵母细胞合成β-苯乙醇的能力。假定的芳基乙醛脱氢酶编码基因AAD15及突变体均不能将苯乙醛还原为β-苯乙醇。
周正[4]（2021）在《丹酚酸生物合成途径关键催化酶的解析及功能研究》文中认为药用植物在自然界中通过一定的规律,精巧形成各种复杂的天然产物,这些天然产物的生物合成途径解析一直以来都是最前沿的科学问题。探究这一科学问题的关键,则是对关键催化酶的功能进行评价。只有全面、彻底了解酶的功能,才能更好地将它们作为合成生物学底盘元件,异源高效合成天然产物;作为代谢工程调控的潜在靶标,创造高品质“理想药用植物”;作为结构生物学蛋白质工程的候选对象,实现酶功能定向进化。经过近20年的探索,丹参中酚酸类主要成分的生物合成途径已经基本明确,大部分关键催化酶的功能也已经被揭示。该类成分生物合成途径主要是通过苯丙氨酸途径合成4-香豆酰辅酶A,酪氨酸途径合成4-羟基苯乳酸或3,4-二羟基苯乳酸（丹参素）,进而在丹参迷迭香酸合成酶（Rosmarinic Acid Synthase,RAS）及细胞色素P450家族98A亚家族氧化酶（Cytochromes P450 monooxygenase 98A family,CYP98A）的作用下进一步催化形成迷迭香酸。然而,迷迭香酸下游丹酚酸B、丹酚酸E等丹参天然活性成分的生成机制目前仍未明确,仅通过体内实验间接预测可能是丹参漆酶（Laccase,LAC）发挥作用。对于这些关键酶基因,它们的功能和催化机制研究仍需进一步验证和探索。本课题重点关注丹酚酸类成分生物合成途径中三个关键酶家族,分别是Sm RAS、Sm CYP98A氧化酶以及Sm LAC。研究策略如下:通过整合组学数据进行生物信息学分析,筛选出目标催化酶基因;通过异源表达,获得重组酶蛋白;通过体外酶催化实验结合分子对接技术,对酶催化功能和机制进行研究;通过CRISPR/Cas9敲除和过表达实验,对酶体内功能进行研究;通过表达特征分析,对酶的基本表达特征进行研究,进而明确三种关键酶在丹酚酸生物合成途径中所发挥的作用。从丹参基因组中挖掘到了11条Sm RAS,通过转录组和进化分析,筛选出一条在根中高表达,且与其它唇形科植物迷迭香酸合成酶亲缘关系较近的Sm RAS10进行研究。通过大肠杆菌异源表达体系,获得Sm RAS10重组蛋白。体外催化实验发现,Sm RAS10可以催化多种类型的酰基供体与酰基受体的结合,并计算相关反应动力学参数。通过动力学模拟,对Sm RAS10的关键催化位点进行预测。利用CRISPR/Cas9及过表达方法分别对目标Sm RAS10进行了敲除和过表达,发现丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量显着变化,表明Sm RAS10在丹酚酸成分生物合成中,具有较为重要的作用,并可以作为丹酚酸生物合成代谢工程策略的潜在靶标,对提升毛状根中丹酚酸的含量具有现实意义。从丹参基因组中挖掘到了3条Sm CYP98A氧化酶基因,分别为Sm CYP98A75、Sm CYP98A76、Sm CYP98A14。通过转录组和进化分析,对三条氧化酶的组织表达特异性以及与其它物种中CYP98A亚家族氧化酶的亲缘关系进行研究。基于酿酒酵母异源表达体系,获得了含有Sm CYP98A家族氧化酶微粒体蛋白。根据体外酶催化实验,发现Sm CYP98A75与Sm CYP98A14可以分别氧化多种迷迭香酸前体物质,生成迷迭香酸。同时,Sm CYP98A75也可以在4-羟基苯乳酸和Sm RAS存在的情况下,催化4-羟基苯乳酸生成丹参素,推测Sm CYP98A75在丹酚酸生物合成途径中起到和Sm CYP98A14同样重要的作用。分别对上述两种催化酶进行了动力学模拟,预测了两种酶发生催化作用的关键氨基酸位点。利用CRISPR/Cas9系统,构建了针对Sm CYP98A14和Sm CYP98A75两个酶的单基因和双基因敲除载体,通过农杆菌转化,获得转基因毛状根,发现丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的含量明显下降,并且双位点敲除毛状根中酚酸的含量下降相对于单位点敲除毛状根,下降更为显着,表明Sm CYP98A75与Sm CYP98A14在丹酚酸成分生物合成中,具有较为重要的作用。分别对Sm CYP98A75与Sm CYP98A14进行过表达,丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B含量显着增加,表明两个氧化酶酶基因可以作为丹酚酸生物合成代谢工程策略的潜在靶标,同样对代谢工程提升丹酚酸含量具有重要意义。根据前期课题组针对Sm LACs的研究,发现过表达或者抑制Sm LACs后,均会导致丹酚酸含量变化。由于缺少体外催化实验的验证,Sm LAC的功能有待进一步确证。利用毕赤酵母异源表达体系,获得了Sm LAC7、Sm LAC20、Sm LAC28重组蛋白。通过体外酶催化实验,发现三个酶均无法将迷迭香酸直接氧化生成丹酚酸B,但是可以将部分具有二苯乙烯母核的芪类化合物,如氧化白藜芦醇、白皮杉醇催化生成含有呋喃环的二聚产物。由于漆酶在植物体内家族成员众多,功能冗余,因此尝试通过保守位点结构域的基因编辑策略,敲除大部分Sm LACs,探究Sm LAC功能。通过CRISPR/Cas9系统,构建了针对漆酶两个铜离子保守结构域的单位点和双位点敲除载体,并获得转基因毛状根。观察发现,Sm LACs敲除的转基因毛状根的生长发育受到了明显抑制,且木质素与酚酸类成分积累下降显着。通过显微观察发现,Sm LACs敲除后,根的构造发生异常,木质部和韧皮部出现无规则的排列,且界限模糊。对Sm LAC相关研究表明,Sm LAC在丹参根的生长发育中发挥重要作用,并与木质素和酚酸合成息息相关。Sm LAC7、Sm LAC20和Sm LAC28这三个候选漆酶,未能催化迷迭香酸二聚生成丹酚酸B,并不意味该Sm LAC家族无法催化丹酚酸B的生成。由于Sm LAC家族成员众多,仍可能是家族内其它成员发挥催化作用,并有待进一步研究。与此同时,Sm LAC7催化以二苯乙烯为母核的芪类化合物二聚,也为虎杖等以二苯乙烯苷为主要天然产物的药用植物生物合成途径推导起到借鉴作用。综上所述,本研究针对丹酚酸生物合成途径三个家族关键催化酶进行了更为详尽的研究,明确了生物学功能。本课题重新绘制了丹酚酸成分生物合成途径,将为今后丹酚酸类成分合成生物学研究提供更为可靠的元件,为基于关键酶的代谢工程策略提供潜在靶标,同时为唇形科植物迷迭香酸的合成途径研究提供更为丰富的理论基础。
陈鑫洁[5]（2021）在《黄芩素生物合成途径在毕赤酵母中的异源重构》文中认为黄芩是一种被广泛应用于治疗癌症、肿瘤、呼吸道感染、高血压、出血等疾病的中药材。黄芩中富含多种黄酮类化合物,其根部的特征黄酮成分,如黄芩素、黄芩苷等,是它能够发挥药理活性的主要原因。野生黄芩随着市场需求的增大而受到严重损害。栽种黄芩质量水平不一,化学合成方法因有毒或极端条件难以满足医药生产及使用需求。合成生物学的迅速发展使得在异源宿主中合成各种天然来源的高附加值化合物成为可能。本课题拟在毕赤酵母细胞中搭建以L-苯丙氨酸为前体的黄芩素生物合成途径,并对前体L-苯丙氨酸的毕赤酵母内源合成途径进行优化,对减弱中间体肉桂酸对宿主细胞的抑制作用进行探究,为黄芩素在新底盘细胞中的异源合成及过程研究提供新策略。首先,本课题将黄芩来源的辅酶A连接酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、黄酮合成酶、黄酮-6-羟化酶与拟南芥来源的P450还原酶在毕赤酵母中异源表达,成功以肉桂酸作为底物合成了黄芩素。同时,由于肉桂酸是一种抑菌性弱酸,在培养基中过量存在时会抑制酵母菌株的生长,通过pH控制确定了肉桂酸的酸根离子形式对菌株生长的影响远小于其分子形式。进一步,分析甲醇、乙醇、葡萄糖为碳源时肉桂酸对宿主的抑制效果,结果表明在乙醇和甲醇条件下毕赤酵母生长较为正常。而乙醇作为碳源时,还可补充合成途径前体丙二酰辅酶A,因此被作为优选碳源。其次,黄芩来源的苯丙氨酸解氨酶未能催化L-苯丙氨酸转化为中间体肉桂酸,本课题以其序列为基础,在NCBI数据库中BLAST并筛选到其他五种来源的苯丙氨酸解氨酶,分别采用组成型启动子PGAP及乙醇诱导型转录信号放大装置（ESAD）调控其表达,最终成功合成了肉桂酸。其中,使用PGAP时菌株在葡萄糖碳源下可产生130 mg/L肉桂酸,在乙醇碳源下可产生230 mg/L肉桂酸,而使用ESAD时菌株在乙醇碳源下可产生400mg/L肉桂酸。将苯丙氨酸解氨酶整合到先前构建的黄芩素生产菌株中,成功实现了L-苯丙氨酸到黄芩素的异源合成。最后,由于L-苯丙氨酸的合成在天然微生物体内受到严格的调控,本课题在肉桂酸工程菌中过表达了途径中关键酶的反馈抑制不敏感突变体,对其内源合成途径进行了表达优化,优化后的肉桂酸工程菌能够利用基础碳源从头合成肉桂酸,且与外源添加足量L-苯丙氨酸时的优化前菌株的肉桂酸产量相当。综上,本课题成功在毕赤酵母中搭建了黄芩素的生物合成途径,并通过多种手段缓解了肉桂酸对毕赤酵母宿主生长的抑制作用,同时在毕赤酵母中优化改造了内源前体L-苯丙氨酸生物合成途径,为黄芩素以及其他黄酮类化合物在毕赤酵母中的从头合成奠定了基础。
吴文妤[6]（2021）在《植物乳杆菌YM-4-3苯乳酸合成代谢调控机制及相关基因的功能研究》文中研究表明苯乳酸（phenyllactic acid,PLA）是一种广泛存在于自然界中的小分子天然有机酸。苯乳酸对细菌和真菌具有广谱抑制性,且活性强于一些常用化学防腐剂,有望成为一种安全无毒的新型生物防腐剂。目前PLA的生物合成研究主要集中在大肠杆菌中,乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）中鲜有报道。由于大肠杆菌为条件致病菌,且易受噬菌体污染,工业生产中有一定局限。另外,苯乳酸对大肠杆菌具有很强抑制效果,在大肠杆菌中进一步提高苯乳酸产量将面临挑战。乳酸菌是产生苯乳酸的天然宿主,具有产生大量苯乳酸潜力。为此,亟需系统、深入研究乳酸菌苯乳酸的生物合成途径及调控机制,为建立高产菌株提供理论支撑。本研究以4株PLA产量不同的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为研究对象,通过基因组、转录组、代谢组分析植物乳杆菌PLA合成代谢调控机制;对L.plantarum YM-4-3 PLA合成相关的差异基因,利用同源重组进行基因敲除,通过分析在不同成分优化培养基中PLA产量、产酸及生长能力变化,确定差异基因在PLA合成中的重要性;以两个PLA合成相关差异基因丝氨酸乙酰基转移酶Cys E和假定蛋白Hpp4基因的敲除株为对象,转录组测序分析进一步揭示Cys E和Hpp4基因的功能。主要研究结果如下:1.比较基因组分析发现S1具有完整的PLA从头合成路径,YM-4-3中缺乏预苯酸脱水酶基因phe A。在4个菌株中均存在完整的PLA合成核心路径,包括4个芳香族氨基酸氨基转移酶和5个乳酸脱氢酶基因,且具有较高的同源性;2.通过转录组、代谢组测序,对培养基优化后PLA高产的YM-4-3（YM-4-3y）、未优化的YM-4-3和低产PLA菌株S1两两比较分析发现,S1具有较弱的从头合成路径归因于Phe、Tyr、Trp底物反馈抑制,且核心路径也并未得到加强导致PLA低产。而YM-4-3由于不具有完整的从头合成路径,主要以核心路径为主合成PLA,并通过辅助路径中心碳代谢的增强,削弱氨基酸及其衍生物的合成介导PLA高产;3.对YM-4-3y中12个特有差异基因进行敲除,获得7个敲除菌株。7个菌株在MRS培养基中生长和产酸均无明显差异。其中ΔCys E在优化培养基中PLA产量降低51.3%,同时其细胞干重也较野生型菌株减少50%,但在MRS培养基中均不存在这些现象;推测优化培养基中某一成分介导Cys E基因的激活,影响细胞生长。电镜扫描结果显示大部分ΔCys E菌株细胞呈团粘连在一起,出现少部分细胞破裂,内容物外泄,细胞皱缩的现象,推测Cys E基因与细胞膜的形成相关。ΔHpp4菌株在优化培养基中发酵上清和单位细胞PLA的产量都有10%左右的上升,其生长和产酸方面的能力均与野生型无明显差异;4.对ΔCys E、ΔHpp4菌株转录组分析发现ΔCys E菌株下调差异基因在嘌呤代谢尤其是次黄嘌呤核苷酸合成代谢途径和脂肪酸生物合成途径中显着富集,上调差异基因在淀粉和蔗糖的代谢途径中富集。推测Cys E基因的缺失影响次黄嘌呤核苷酸合成代谢,导致细胞复制生殖减弱。脂肪酸生物合成的减弱与细胞膜的形成相关,而淀粉和蔗糖代谢途径中上调基因富集在合成6-磷酸-葡萄糖的过程中,可能是为了弥补脂肪酸的合成,从而减少脂肪酸合成不足对细胞膜形成带来的影响。Hpp4基因的缺失主要引起谷氨酸脱氢酶的低表达和丝氨酸D-Ala-D-Ala羧肽酶基因的显着上调,其中羧肽酶的上调整体上提高了细胞内酶的催化和转运活性,从而小幅度提升PLA的产量。
吴凡[7]（2021）在《无芒隐子草和白花草木樨全基因组及其关键性状相关功能基因研究》文中认为全基因组序列是生物的基本遗传资源,是研究基因功能和分子机制的基础。利用基因组序列获取全基因组范围的DNA标记（如SNP）,进而找到调控关键性状的基因应用于分子育种,能够缩短育种时间。超旱生植物无芒隐子草（Cleistogenes songorica）具有兼性授粉的二型花,保证它能够在极端条件下生存和繁殖。草木樨（Melilotus spp.）常被用作绿肥、牧草和药用植物,由于香豆素含量高,限制它作为优良牧草的应用。然而目前无芒隐子草二型花的功能基因及草木樨香豆素生物合成相关的关键酶基因尚未见报道。本研究以“腾格里”无芒隐子草和白花草木樨为材料进行全基因组测序,结合基因组、转录组、代谢组、BSA和重测序等技术研究关键性状相关功能基因,主要研究结果如下:1.获得“腾格里”无芒隐子草高质量的染色体水平的基因组。组装的Contig版本的基因组大小为540.12 Mb,Contig N50为21.28 Mb,其中528.52 Mb挂载到20条假染色体上且端粒均被组装出来。共预测到54,383个蛋白编码基因。无芒隐子草大概在19.2百万年前（Mya）发生四倍体化事件,根据无芒隐子草与水稻（Oryza sativa）的染色体进化关系,将20条染色体拆分为A、B亚基因组,其中B2与B5、B1与B8间发生了染色体重排。进化分析表明,无芒隐子草属于虎尾草亚科,和复活草的亲缘关系更近。扩张及保守基因家族显着富集在胁迫响应相关的代谢途径,包括脂肪酸延伸、苯丙酸生物合成以及淀粉和蔗糖代谢。2.构建无芒隐子草开花基因网络共包括83个基因家族的302个基因。鉴定出12个花发育相关的转录因子（TF）基因家族的168个成员与ABCDE模型基因（AMGs）具有表达相关性。通过靶点预测和表达分析推测mi R156ab-Cs SPL17-AMG的相互作用可能参与调控二型花的分化;Cs MYB219可能在干旱胁迫下调控闭花授粉的小花发育;mi R159-Cs MYB123-B类基因可能是二型花结构分化的重要调控因子。mi R172l特异靶向Cs AP2＿9可能调控闭花授粉,mi R172l和Cs AP2＿9分别过表达水稻,发现Cs AP2＿9过表达株系表现为内稃异常,浆片变小变薄;mi R172l过表达株系表现为花丝变长,花药数量减少,证明了mi R172l和Cs AP2＿9在浆片、花丝和花药发育中的作用。3.组装获得白花草木樨（2n=16）的Contig版本基因组大小为1.05 Gb,Contig N50为7.49 Mb,其中1.04 Gb被挂载到8条假染色体上。共预测到41,910个基因。进化分析表明,白花草木樨与蒺藜苜蓿亲缘关系最近,二者约在14.16 Mya分化。白花草木樨基因组中71.42%为重复序列,其中长末端重复（LTR）占基因组的54.99%,完整LTR在白花草木樨和蒺藜苜蓿分化之后大量插入（0.05～0.85Mya）,具有不同于其他三种豆科物种的插入模式,且相对年轻活性较强。4.对不同地理区域的94份草木樨种质进行全基因组重测序分析,鉴定到4,999,288个SNPs和606,387个In Dels。分析表明白花草木樨和黄花草木樨之间存在基因渗透,基因流向为白花草木樨流向黄花草木樨。连锁不平衡分析表明黄花草木樨的遗传多样性较大。白花草木樨和黄花草木樨在第四纪冰期（0.01-2 Mya）内约0.2 Mya经历了种群大小持续下降,LTR在该时间段内的大量插入可能有助于种群渡过逆境。选择清除分析鉴定到2个与花色相关的基因、5个与香豆素生物合成相关的基因。GWAS分析鉴定出2个与叶片蜡质生物合成有关的MAH1基因;同时鉴定出与细胞壁发育相关的XGT和XXT1基因。5.构建了草木樨香豆素生物合成通路并鉴定了通路上的13个基因家族的成员。结合白花草木樨近等基因系（NILs）的加权共表达分析和BSA（Bulked segregant analysis）分析鉴定出8个香豆素生物合成相关的候选基因。通过NILs代谢组分析鉴定出差异代谢物包括香豆酸、香豆酸糖苷和简单香豆素,推测BGLU（β-glucosidase）在香豆素生物合成中具有重要作用。鉴定出的BGLU基因簇可能调控香豆素的生物合成,通过大肠杆菌异源表达和白花草木樨过表达MaBGLU1基因,证明MaBGLU1酶能够水解东莨菪苷为东莨菪内酯,且BGLU1在NILs中的非同义变异导致了酶活性的差异。q RT-PCR分析表明,和对照草木樨相比过表达MaBGLU1阳性植株的MaBGLU1相对表达量明显增加。
孟帅帅[8]（2020）在《大肠杆菌生产L-色氨酸重组菌株的改造及发酵条件优化》文中研究说明L-色氨酸作为人和动物所必须的20种氨基酸之一,在人和动物的生长发育、生命活动和新陈代谢等方面起着关键性的作用。目前,随着合成生物学、系统生物学以及代谢工程的不断发展与进步,L-色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料等行业,利用微生物发酵生产L-色氨酸已经越来越受到重视。本研究以大肠杆菌菌株FJN010为出发菌株,利用代谢工程的技术手段构建高产的L-色氨酸生产菌株。主要研究内容如下:（1）以L-色氨酸生产菌株FJN010为出发菌株,L-色氨酸合成途径中的关键酶基因pckA和tktA为研究对象,采用外源质粒高效表达的方式和无缝克隆的技术对关键酶基因实施单个或双基因的串联表达,考察含有不同外源基因的菌株对L-色氨酸产量的影响。摇瓶发酵结果显示,共表达pckA和tktA基因的菌株FJN010/TE-3产L-色氨酸水平最高,可达3.71 g/L,较出发菌株FJN010产酸能力提高了39.0%,PckA和TktA酶活性分别提高了3.7倍和3.4倍。（2）以质粒pBV-pckA-pL-tktA为基础,继续引入邻氨基苯甲酸合酶基因trp ED。采用易错PCR技术对邻氨基苯甲酸合酶进行定向进化改造,构建能够抗L-色氨酸反馈抑制的菌株FJN010/TE-5(pBV-pckA-pL-tktA-pL-trp EDfbr)。结果显示,新获得的邻氨基苯甲酸合酶的突变酶其氨基酸序列中第465位半胱氨酸残基突变为了酪氨酸,菌株FJN010/TE-5产酸水平大幅提高,最终L-色氨酸产量可达4.80 g/L,相较于对照菌株FJN010/TE-3提高了29.4%,邻氨基苯甲酸合酶酶活性提高了4倍。（3）以菌株FJN010/TE-5为出发菌株,采用Red同源重组技术分别对丙氨酸转氨酶编码基因alaA、alaC及avtA进行单、双以及三基因敲除,考察不同丙氨酸转氨酶基因缺失后对L-色氨酸产量的影响。摇瓶结果显示,同时敲除丙氨酸转氨酶基因alaA和alaC的菌株FJN010/TE-9产L-色氨酸能力最高,可达6.08 g/L,较菌株FJN010/TE-5产酸提高了26.7%,且丙氨酸含量仅0.16 g/L,降低了91%。（4）在原培养基的基础上,以L-苯丙氨酸提取后的残液替代初始发酵培养基中的L-苯丙氨酸粉末,通过摇瓶及50 L罐发酵考察L-苯丙氨酸残液对菌株FJN010/TE-9的生长和产L-色氨酸水平的影响。摇瓶结果显示,发酵液中添加0.50 g/L的L-苯丙氨酸残液能够有效增加L-色氨酸的产量,可达7.40 g/L,菌体浓度也有所升高。而在50 L罐中添加一定量的L-苯丙氨酸残液,菌株FJN010/TE-9最终L-色氨酸积累量仅为20.01 g/L,这可能由于L-苯丙氨酸提取后的残液中含有过多有害物质抑制了菌体生长及产酸水平。（5）在原培养基的基础上,对菌株FJN010/TE-9的发酵条件及培养基配方进行优化,获得最适L-色氨酸发酵培养的培养条件和培养基配方。结果表明,优化后的培养基配方能够显着提升菌株的产酸能力。50 L罐补料分批发酵结果显示,菌株FJN010/TE-9产L-色氨酸水平可达49.30 g/L,较原始配方提高了17.7%。
门佳轩[9]（2020）在《大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建》文中研究表明L-苯丙氨酸作为一种食品化学品及药品的中间体,在食品、医药、化工等多个领域均有广泛应用。由于目前多数L-苯丙氨酸工程菌株携带质粒,导致发酵过程需要添加抗生素或诱导剂维持细胞生产,大幅增加了工业生产成本。因此,本实验在现有研究的基础上,通过代谢工程手段对野生大肠杆菌L-苯丙氨酸合成途径中的相关基因进行了基因组层面的改造,构建了一株无质粒的L-苯丙氨酸高产菌株。双功能酶（chorismate mutase/prephenate dehydratase,PheA）与 DAHP 合酶（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphte synthase,AroG）是L-苯丙氨酸合成途径中最关键的两个限速酶,受L-苯丙氨酸严格调控。为解除关键酶受到的反馈抑制,提高L-苯丙氨酸积累能力,本实验将缺失R区的pheA基因与转氨酶基因（aromatic-amino-acid transaminase,tyrB）串联成操纵子,由trc启动子控制,通过Crispr/Cas9技术将该操纵子分别在PHE1（为E.coli W3110）基因组上进行了单、双、三拷贝的整合,构建了 PHE2、PHE3及PHE4菌株。摇瓶结果显示,PHE2的L-苯丙氨酸产量由微量提升至6.1 g/L;PHE3的L-苯丙氨酸产量为8.8 g/L,较PHE2相比提高35.4%,PHE4的L-苯丙氨酸产量较PHE3相比下降25%。随后通过在PHE3的基因组中整合trc启动子控制的aroG点突变基因及双拷贝,构建了 PHE5和PHE6,摇瓶发酵结果显示,PHE5的L-苯丙氨酸产量为13.1 g/L,较PHE3相比提高了 46.9%;PHE6L-苯丙氨酸产量为12.8 g/L,较PHE5有所降低,表明关键酶反馈抑制的解除有利于L-苯丙氨酸的积累,适度强化解除反馈抑制的关键酶能够显着提高L-苯丙氨酸的产量。为减少上游代谢流下行的阻滞及有毒中间产物的积累,本实验依次对莽草酸途径中的aroC、aroA、aroL、aroE、aroD、aroB等六种基因的表达量进行不同程度的强化。摇瓶发酵结果显示,过表达aroA基因与aroD基因可有效增加L-苯丙氨酸的产量,其中 PHE8-2（gapC::ParoA-aroA）L-苯丙氨酸产量为 15.1 g/L,较 PHE5 提高 11.1%;PHE11-1（aroD::PBBaj23106-aroD）L-苯丙氨酸产量为19.3 g/L,较对照PHE8-2提高36.9%;其余四种基因的改造对L-苯丙氨酸的生产及菌体生长均未表现出正向效果,表明AroA与AroD为莽草酸途径的两种限速酶,可通过适度强化aroA与aroD基因的表达提高L-Phe的生产能力。通过敲除PHE11-1中的pykF基因构建了 PHE13,摇瓶结果显示PHE13L-苯丙氨酸产量为23.7 g/L,较PHE11-1提高24.1%,且菌体生长并未受到影响,表明pykF基因的敲除能够增加PEP供应,有利于L-苯丙氨酸的合成。随后向PHE13中引入了不同强度启动子控制的pps基因与tktA基因,结果显示,强化两种基因的表达后L-苯丙氨酸产量较PHE13呈不同程度的降低,表明敲除pykF基因后过表达pps基因与tktA基因对提高L-苯丙氨酸产量意义不大。PheP于AroP是大肠杆菌中的两种L-苯丙氨酸转运蛋白,负责将胞外L-苯丙氨酸转运至胞内供应菌体生长所需。本研究通过在PHE13上分别敲除pheP基因与aroP基因构建了 PHE16和PHE17,摇瓶发酵结果表明,PHE16L-苯丙氨酸产量为18.1 g/L,较PHE13降低19.9%;PHE17L-苯丙氨酸产量为19.8 g/L,较PHE13下降16.1%,且菌体量也有一定下降,表明pheP基因与aroP基因的敲除不利于L-苯丙氨酸的积累。利用PHE13进行5 L发酵罐分批补料发酵实验,结果显示,发酵48 h L-苯丙氨酸产量达81.8 g/L,平均生产强度达1.7 g/L/h,较文献报道最高产量（72.9 g/L,1.4 g/L/h）提高12.2%及21.4%,糖酸转化率为24%,具有良好的工业化潜力。
朱敏[10]（2020）在《玫瑰L-苯丙氨酸生物合成关键基因的克隆与功能验证》文中提出玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是世界上名贵的天然香料植物,由其花朵提取的玫瑰精油有“液体黄金”的美誉,深受市场欢迎。2-苯乙醇是玫瑰精油的主要成分之一,L-苯丙氨酸是合成2-苯乙醇的底物,若能通过基因工程手段提高玫瑰中L-苯丙氨酸的含量,进而促进2-苯乙醇的合成,提高玫瑰精油的产量和品质,具有重要的理论意义和实践价值。本文在实验室前期研究的基础上,克隆获得了与玫瑰L-苯丙氨酸合成相关的RrDHQ/SDH、RrCM1、RrCM2基因和R2R3-MYB家族的两个转录因子RrODO1和RrMYB114,分析了其时空表达特性,并尝试将这些基因转入模式植物矮牵牛中验证其功能,旨在挖掘调控玫瑰L-苯丙氨酸代谢的关键基因,为今后开展“高油”玫瑰分子育种提供优异基因资源。主要研究结果如下:1、以‘平阴一号’玫瑰为试验材料,克隆获得了 L-苯丙氨酸合成通路上的关键酶基因RDHQ/SDH、RrCM1和RrCM2,并克隆了两个调控苯丙素类合成途径的转录因子RrODO1和RrMYB114。其中RrDHQ/SDH基因编码区ORF（1518bp）,共编码506个氨基酸;RrCM1基因编码区ORF（633bp）,共编码210个氨基酸;RrCM2基因编码区ORF（801bp）,共编码266个氨基酸;RrODO1基因编码区ORF（837bp）,共编码278个氨基酸;RrMYB114基因全长898bp,具有起始密码子、完整的开放阅读框（732bp）、终止密码子、共编码244个氨基酸。2、以花中2-苯乙醇含量存在明显差异的‘紫枝玫瑰’及其芽变品种‘白紫枝玫瑰’为试材,分析了RrDHQ/SDH、RrCM1、RrCM2、RrODO1和RrMYB114基因在玫瑰不同花发育时期及花器官不同部位中的时空表达特性。结果表明:（1）随着花朵的开放,‘白紫枝玫瑰’中RrDHQ/SDH基因总体上显着上调表达,RrCM1总体上显着下调。转录因子表现为在特定时期诱导表达的模式,RrODO1仅在初开期显着上调表达,可能和L-苯丙氨酸合成前体大量积累有关,RrMYB114在半开期和盛开期上调表达,可能是2-苯乙醇前体竞争的调节因子;在‘紫枝玫瑰’中,结构基因RrDHQ/SDH和RrCM1在衰败期显着上调表达,与2-苯乙醇含量高峰期一致,而RrCM2在衰败期显着下调。转录因子RrODO1在半开期上调表达,同样可能和L-苯丙氨酸合成前体积累有关,而RrMYB114总体上呈下调表达趋势;（2）在花器官不同部位的基因表达模式中,RrCM1表达具有强烈的组织特异性,主要在花瓣中表达;RrODO1表达具有较强的组织特异性,仅在‘白紫枝玫瑰’的花托和‘紫枝玫瑰’的雌蕊中高表达;RrMYB114表达具有一定的组织特异性,在花萼和雄蕊中丰度极低,在花柄和雌蕊丰度相对较高;RrCM2在‘白紫枝玫瑰’花柄和雄蕊中不表达,其余部位均有表达,其组织特异性与RrCM1明显不同;RrDHQ/SDH在各部位均有一定表达,在‘白紫枝玫瑰’花柄中丰度较高。3、构建了玫瑰L-苯丙氨酸合成相关RrDHQ/SDH、RrCM1、RrCM2、RrODO1和RrMYB114基因的超表达载体,采用农杆菌介导法的叶盘转化法转入矮牵牛,经GUS染色验证,得到了转RrDHQ/SDH、RrCM1、RrCM2、RrODO1基因的矮牵牛愈伤组织和转RrMYB114基因的矮牵牛植株。以野生型矮牵牛植株为对照,对转RrMYB114基因的矮牵牛植株进行表型观察发现,转RrMYB114基因的矮牵牛植株形态和花朵尺寸均小于对照植株;GC-MS检测转RrMYB114基因矮牵牛植株的花香成分发现,转基因矮牵牛主要芳香物质的含量高于野生型植株,尤其是苯类/苯丙素类芳香化合物变化较为显着,转RrMYB114基因植株中2-苯乙醇的含量是野生型矮牵牛植株的10倍左右。
二、大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达（论文提纲范文）
（1）基于比较转录组学分析代谢改造粘质沙雷氏菌JNB5-1高效合成灵菌红素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 灵菌红素概述 |
| 1.1.1 灵菌红素 |
| 1.1.2 灵菌红素合成途径 |
| 1.1.3 灵菌红素合成的基因调控 |
| 1.2 RNA测序(RNA-seq) |
| 1.2.1 RNA-seq测序发展 |
| 1.2.2 RNA-seq建库和测序 |
| 1.2.3 RNA-seq数据分析 |
| 1.3 聚腺苷酸化 |
| 1.3.1 聚腺苷酸化概述 |
| 1.3.2 聚腺苷酸化相关酶 |
| 1.3.3 聚腺苷酸化在RNA代谢和基因表达中的作用 |
| 1.4 蛋白质翻译后修饰 |
| 1.4.1 蛋白质稳定性概述 |
| 1.4.2 二硫键工程提高蛋白质稳定性 |
| 1.4.3 蛋白质磷酸化 |
| 1.5 课题的研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 基于比较转录组学分析初步解析不同温度下粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的差异 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 灵菌红素产量测定 |
| 2.2.6 转录组取样 |
| 2.2.7 提取总RNA |
| 2.2.8 文库制备和转录组测序 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 基因表达模式分析 |
| 2.2.11 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 转录组样本制备 |
| 2.3.2 RNA样品检测 |
| 2.3.3 转录组测序总体分析 |
| 2.3.4 qPCR验证 |
| 2.3.5 基因表达模式分析 |
| 2.3.6 温度差异分析 |
| 2.3.7 温度对基因转录的影响 |
| 2.3.8 群体感应参与灵菌红素合成 |
| 2.3.9 sRNA响应温度刺激参与灵菌红素合成 |
| 2.3.10 双组分调控系统参与灵菌红素合成 |
| 2.3.11 涉及灵菌红素生物学功能的相关因子 |
| 2.3.12 氨基酸代谢途径响应温度变化参与灵菌红素合成 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 设计多聚核苷酸片段提高pig基因簇基因mRNA稳定性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 PigF克隆表达,制备和纯化 |
| 3.2.6 PigF酶活性测定 |
| 3.2.7 温度对氧甲基转移酶(PigF)合成及酶活性的影响 |
| 3.2.8 粘质沙雷氏菌pig F敲除菌构建 |
| 3.2.9 PNF的筛选 |
| 3.2.10 mRNA半衰期测定 |
| 3.2.11 粘质沙雷氏菌敲入菌株构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 pig基因簇基因转录水平受温度影响 |
| 3.3.2 温度对氧甲基转移酶(PigF)的影响 |
| 3.3.3 设计PNF |
| 3.3.4 PNF提高gfp基因mRNA稳定性 |
| 3.3.5 PNF提高mRNA半衰期 |
| 3.3.6 引入PNF提高PigF基因转录和表达水平 |
| 3.3.7 利用PNF在 JNB5-1 中重构pig基因簇 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 引入二硫键提高氧甲基转移酶稳定性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 PigF突变酶的构建,制备和纯化 |
| 4.2.6 PigF及其突变酶热稳定性研究 |
| 4.2.7 验证二硫键的形成 |
| 4.2.8 PigF及其突变体酶动力学参数研究 |
| 4.2.9 结构和分子动力学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 设计PigF二硫键引入位点 |
| 4.3.2 PigF突变体酶二硫键验证 |
| 4.3.3 引入二硫键提高了PigF突变体酶热稳定性 |
| 4.3.4 PigF及突变体酶酶动力学参数研究 |
| 4.3.5 PigF及其突变体酶结构分析 |
| 4.3.6 PigF突变体酶分子动力学模拟 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 cpx系统负转录调控PG生物合成 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 粘质沙雷氏菌cpxR敲除菌构建 |
| 5.2.6 测量pig基因簇的启动子 |
| 5.2.7 CpxR、CpxR_(D51A)及Cpx A克隆表达,制备和纯化 |
| 5.2.8 氯霉素乙酰转移酶(CAT)和GFP荧光实验 |
| 5.2.9 电泳迁移率实验 |
| 5.2.10 细菌双杂交实验 |
| 5.2.11 Pull down实验 |
| 5.2.12 Western blot |
| 5.2.13 体外磷酸化验证 |
| 5.2.14 灵菌红素产量测定 |
| 5.2.15 实时荧光定量PCR |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 cpx系统转录水平响应JNB5-1 的培养温度变化而变化 |
| 5.3.2 cpxR基因插入失活提高了PG的产量 |
| 5.3.3 cpxR基因插入失活提高了PG合成相关途径基因的转录水平 |
| 5.3.4 CpxR结合pig基因簇启动子 |
| 5.3.5 cpx系统通过磷酸化影响PG产量 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 组合代谢改造粘质沙雷氏菌高效合成灵菌红素 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要仪器 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 菌株、质粒及引物 |
| 6.2.4 培养基 |
| 6.2.5 粘质沙雷氏菌敲入菌株构建 |
| 6.2.6 摇瓶发酵测定灵菌红素产量 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 引入二硫键提高PigF稳定性促进PG产量 |
| 6.3.2 外源添加前体物质促进PG产量 |
| 6.3.3 重组PG合成代谢流促进PG产量 |
| 6.3.4 重组菌JNB5-1/S4 发酵合成PG |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表的论文与专利 |
| 附录 II:转录组差异基因 |
（2）重组大肠杆菌全细胞催化合成苯乳酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苯乳酸概述 |
| 1.1.1 苯乳酸简介 |
| 1.1.2 苯乳酸性质 |
| 1.1.3 苯乳酸功能 |
| 1.1.4 苯乳酸的应用 |
| 1.2 苯乳酸的合成方法 |
| 1.2.1 化学法制备苯乳酸 |
| 1.2.2 生物合成方法制备苯乳酸 |
| 1.3 苯乳酸合成途径中的酶 |
| 1.3.1 转氨反应 |
| 1.3.2 还原反应 |
| 1.4 NADH辅酶再生系统 |
| 1.4.1 葡萄糖脱氢酶 |
| 1.4.2 甲酸脱氢酶 |
| 1.5 本课题的立题和主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.1.3 培养基成分 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒提取 |
| 2.2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.3 重组质粒和重组菌构建 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.2.5 关键酶的纯化及酶活测定 |
| 2.2.6 苯乳酸催化体系的构建 |
| 2.2.7 底物、产物及中间产物浓度测定方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 L-氨基酸脱氨酶基因laad的克隆表达 |
| 3.1.1 重组质粒 pET28a-laad 的构建 |
| 3.1.2 重组质粒 pET28a-laad 的转化和诱导表达 |
| 3.1.3 LAAD的酶学性质 |
| 3.2 不同来源乳酸脱氢酶和苯丙酮酸还原酶的筛选及克隆表达 |
| 3.2.1 重组质粒 pET28a-ldh 和 pET28a-lappr 的构建 |
| 3.2.2 重组质粒pET-28a-ldh和 pET-28a-lappr的转化和诱导表达 |
| 3.2.3 最优还原酶的选择 |
| 3.2.4 LaPPR的酶学性质 |
| 3.3 辅酶循环用酶的筛选及自循环体系的构建 |
| 3.3.1 人工添加辅酶NADH对催化反应的影响 |
| 3.3.2 GDH与 FDH的克隆表达 |
| 3.3.3 GDH和 FDH的筛选比较 |
| 3.4 构建辅酶自循环体系一步法合成L-苯乳酸 |
| 3.4.1 重组菌的构建及表达分析 |
| 3.4.2 LaPPR表达量的调节与优化 |
| 3.4.3 LaPPR和 GDH的酶量配比优化 |
| 3.4.4 GDH的拷贝数增加 |
| 3.5 重组菌的构建 |
| 3.5.1 E. coli BL21/p ET28a-laad-lappr-gdh-gdh 重组菌构建及酶表达分析 |
| 3.5.2 苯乳酸多酶级联体系转化条件的优化 |
| 3.5.3 苯乳酸转化放大 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 β-苯乙醇概述 |
| 1.1.2 β-苯乙醇的规模化合成 |
| 1.1.3 酵母合成β-苯乙醇 |
| 1.2 酿酒酵母的莽草酸途径及其调控机制 |
| 1.2.1 莽草酸合成途径及其调节 |
| 1.2.2 β-苯乙醇合成途径及相关调控 |
| 1.2.3 利用莽草酸途径合成芳香族化合物 |
| 1.3 酿酒酵母的艾氏合成途径及其调控机制 |
| 1.3.1 可逆的L-苯丙氨酸转氨酶 |
| 1.3.2 酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶家族及其相互作用 |
| 1.3.3 艾氏途径的脱氢反应 |
| 1.3.4 艾氏途径相关的其它重要反应 |
| 1.3.5 利用艾氏途径产β-苯乙醇 |
| 1.4 β-苯乙醇对酿酒酵母的抑制作用与应对策略 |
| 1.5 本论文主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 |
| 1.5.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 以葡萄糖为前体合成芳香醇的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基与培养条件 |
| 2.2.3 实验仪器与药品 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 酶活力与NADP~+/NADPH测定方法 |
| 2.2.6 分析方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 莽草酸途径中反馈抑制的解除 |
| 2.3.2 酿酒酵母五功能酶Aro1 催化反应的分步分析 |
| 2.3.3 芳香醇合成支路的弱化与脱羧酶的表达 |
| 2.3.4 改善莽草酸途径前体PEP和E4P的供应 |
| 2.3.5 基于莽草酸途径的芳香醇合成策略的初步优化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 以L-苯丙氨酸为前体合成β-苯乙醇的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基与培养条件 |
| 3.2.3 实验仪器与药品 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 基因表达水平验证 |
| 3.2.6 分析方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酿酒酵母合成β-苯乙醇培养条件的初步优化 |
| 3.3.2 L-苯丙氨酸转氨酶的功能研究与筛选表达 |
| 3.3.3 不同来源苯丙酮酸脱羧酶的表达 |
| 3.3.4 艾氏途径相关酶在酿酒酵母中的融合表达 |
| 3.3.5 氨基受体的循环利用 |
| 3.3.6 丙酮酸脱羧酶基因PDC5 缺失促进β-苯乙醇的合成 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于转录组学分析基因PDC5 的缺失对酿酒酵母β-苯乙醇合成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 |
| 4.2.3 实验仪器与药品 |
| 4.2.4 酵母转录组测序及比较基因组学分析 |
| 4.2.5 基因表达水平测定 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同培养基中PDC5 的缺失对酿酒酵母合成β-苯乙醇的影响 |
| 4.3.2 基于转录组学解析PDC5 的缺失对β-苯乙醇合成的影响 |
| 4.3.3 突变株RM22 中促进β-苯乙醇合成的关键基因的挖掘与验证 |
| 4.3.4 突变株RM22 中促进β-苯乙醇合成的作用机制解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 适应性进化高产β-苯乙醇突变株的比较基因组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 实验仪器与药品 |
| 5.2.4 适应性进化方法 |
| 5.2.5 酵母重测序及比较基因组学分析 |
| 5.2.6 关键基因过表达菌株的构建 |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 酿酒酵母耐β-苯乙醇适应性进化菌株的筛选 |
| 5.3.2 适应性进化菌株AD032 与对照菌株WT-A的重测序与比较基因组学分析 |
| 5.3.3 部分关键基因对酵母合成β-苯乙醇的影响 |
| 5.3.4 基于代谢调控改造的高产β-苯乙醇菌株的构建 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 异源途径基因优化后的序列 |
| 附录Ⅱ 本研究所用引物 |
| 附录Ⅲ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）丹酚酸生物合成途径关键催化酶的解析及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 专题综述 药用植物天然产物生物合成途径及关键催化酶的研究策略 |
| 第一部分:丹参迷迭香酸合成酶基因功能研究 |
| 一、丹参迷迭香酸合成酶筛选、克隆和生物信息学分析 |
| 二、丹参迷迭香酸合成酶的催化机制研究 |
| 三、Sm RAS10 的体内功能研究 |
| 四、SmRAS10 的表达特征分析 |
| 五、SmRAS10 研究总结 |
| 第二部分:丹参细胞色素P450氧化酶 98A亚家族基因功能的研究 |
| 一、丹参CYP98A氧化酶家族筛选和生物信息学分析 |
| 二、丹参CYP98A家族氧化酶的催化机制分析 |
| 三、丹参CYP98A家族氧化酶的体内功能研究 |
| 四、丹参CYP98A家族氧化酶的表达特征分析 |
| 五、丹参CYP98A家族氧化酶研究总结 |
| 第三部分:丹参漆酶家族基因功能的研究 |
| 一、丹参漆酶Sm LAC7、Sm LAC20、Sm LAC28 的催化机制研究 |
| 二、丹参漆酶的体内功能研究 |
| 三、丹参漆酶家族的表达特征分析 |
| 四、丹参漆酶研究总结 |
| 第四部分:课题总结与展望 |
| 一、研究总结 |
| 二、特色与创新点 |
| 三、后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 研究生在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）黄芩素生物合成途径在毕赤酵母中的异源重构（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 名词缩写对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 黄酮类化合物 |
| 1.1.1 黄酮类化合物 |
| 1.1.2 黄芩 |
| 1.2 黄芩素的生物合成 |
| 1.2.1 黄芩素的生物合成途径 |
| 1.2.2 黄芩素的生物合成现状 |
| 1.3 L-苯丙氨酸的生物合成 |
| 1.3.1 L-苯丙氨酸 |
| 1.3.2 L-苯丙氨酸生物合成途径 |
| 1.3.3 L-苯丙氨酸生物合成途径优化 |
| 1.4 毕赤酵母 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4.2 毕赤酵母的应用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第2章 肉桂酸为底物在毕赤酵母中异源合成黄芩素 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基及培养方法 |
| 2.2.3 主要分子生物学试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 黄芩素生物合成途径中有关基因的序列 |
| 2.3.2 DNA序列扩增及组装 |
| 2.3.3 大肠杆菌的感受态制备及转化 |
| 2.3.4 毕赤酵母的感受态制备与转化 |
| 2.3.5 毕赤酵母基因组的提取 |
| 2.3.6 毕赤酵母菌株摇瓶水平发酵实验 |
| 2.3.7 产物萃取及检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 表达质粒pDAg2-4CL-CHS2的构建 |
| 2.4.2 表达质粒pDTg1-CHI-FNSII-1的构建 |
| 2.4.3 表达质粒GAP-F6H-GAP-AtCPR1的构建 |
| 2.4.4 毕赤酵母重组菌株Δku＿4CCFFC的构建 |
| 2.4.5 黄芩素在毕赤酵母中的异源合成 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 毕赤酵母对肉桂酸耐受能力的改善 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 毕赤酵母在24孔板中的生长验证 |
| 3.3.2 激酶缺失株的活化和点板培养 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 肉桂酸的外源添加对毕赤酵母生长的影响 |
| 3.4.2 pH对毕赤酵母肉桂酸耐受性的影响 |
| 3.4.3 激酶缺失文库的筛选 |
| 3.4.4 麦角固醇的添加对酵母菌株肉桂酸耐受能力的影响 |
| 3.4.5 不同碳源对酵母菌株肉桂酸耐受能力的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 苯丙氨酸解氨酶筛选及用于黄芩素合成途径组装 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 不同来源PAL的基因序列信息 |
| 4.3.2 以P_(GAP)为启动子的不同pal的质粒获得 |
| 4.3.3 毕赤酵母的摇瓶水平发酵及产物检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 乙醇诱导型启动子表达不同pal的质粒构建 |
| 4.4.2 肉桂酸在毕赤酵母菌株中的异源合成 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 毕赤酵母胞内L-苯丙氨酸合成途径的优化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验菌株 |
| 5.2.2 培养基及培养条件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 不同碳源条件下肉桂酸在毕赤酵母中的从头合成 |
| 5.4.2 工程菌P.p/ESAD-Rg在不同浓度前体条件下的摇瓶发酵 |
| 5.4.3 毕赤酵母内源合成L-苯丙氨酸的优化 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论、创新点与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文与申请的专利 |
| 附录1 本研究所用质粒 |
| 附录2 本研究所用菌株 |
（6）植物乳杆菌YM-4-3苯乳酸合成代谢调控机制及相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苯乳酸简介 |
| 1.1.1 苯乳酸的发现 |
| 1.1.2 苯乳酸的应用 |
| 1.1.3 产苯乳酸的微生物 |
| 1.2 苯乳酸的生物合成途径 |
| 1.2.1 苯乳酸的核心合成途径 |
| 1.2.2 从头合成途径 |
| 1.2.3 苯乳酸生物合成中的关键酶 |
| 1.3 苯乳酸的研究现状及不足 |
| 1.3.1 研究现状 |
| 1.3.2 乳酸菌在苯乳酸方面的研究概况 |
| 1.3.3 存在的问题 |
| 1.4 转录组、代谢组在揭示微生物合成代谢调控机制方面的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 第二章 植物乳杆菌高产苯乳酸的多组学分析 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与培养基 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物乳杆菌S1基因组提取及测序 |
| 2.2.2 转录组测序及分析 |
| 2.2.3 代谢组样品处理及检测方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同植物乳杆菌苯乳酸产量 |
| 2.3.2 植物乳杆菌S1基因组与比较基因组分析 |
| 2.3.3 转录组测序与差异基因分析 |
| 2.3.4 代谢组分析 |
| 2.3.5 转录组和代谢组关联分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 YM-4-3苯乳酸合成差异基因敲除及性状鉴定 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.3 实验试剂及仪器 |
| 3.2.4 培养基及试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3.1 差异基因同源臂的克隆与测序 |
| 3.3.2 敲除载体的构建 |
| 3.3.3 敲除子的电转与筛选 |
| 3.3.4 HPLC检测敲除菌株在不同单因素优化培养基中PLA产量 |
| 3.3.5 敲除菌株生长能力测定及细胞形态检测 |
| 3.3.6 基因的功能预测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲除载体构建验证 |
| 3.3.2 敲除载体成功导入YM-4-3 |
| 3.3.3 敲除载整合至基因组 |
| 3.3.4 敲除子验证 |
| 3.3.5 高效液相色谱分析 |
| 3.3.6 敲除菌株PLA产量测定 |
| 3.3.7 敲除菌株的动态生长监测 |
| 3.3.8 敲除菌株胞形态学观察 |
| 3.3.9 丝氨酸转移酶基因的跨膜结构域预测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 植物乳杆菌YM-4-3 CYSE、HPP4基因敲除菌株转录组分析 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与培养基 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 测序情况 |
| 4.3.2 样本间相关性评估 |
| 4.3.3 差异表达基因分析 |
| 4.3.4 L8_O_vs_Cys E_O差异表达基因GO分析 |
| 4.3.5 L8_O_vs_Cys E_O差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.3.6 L8_O_vs_Hpp4_O差异基因分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表论文目录 |
（7）无芒隐子草和白花草木樨全基因组及其关键性状相关功能基因研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 国内外研究进展 |
| 2.1 草类植物基因组研究进展 |
| 2.1.1 草类模式植物基因组研究及应用 |
| 2.1.2 草类植物起源与进化 |
| 2.1.3 比较基因组学分析 |
| 2.1.4 草类植物关键性状研究 |
| 2.2 无芒隐子草研究进展 |
| 2.2.1 二型性花形态及分子研究 |
| 2.2.2 分子标记开发 |
| 2.2.3 抗逆生理及胁迫转录组研究 |
| 2.2.4 功能基因挖掘与利用 |
| 2.3 草木樨研究进展 |
| 2.3.1 草木樨系统进化和遗传多样性研究 |
| 2.3.2 白花草木樨和黄花草木樨的表型和遗传变异 |
| 2.3.3 低香豆素草木樨种质资源创制 |
| 2.3.4 草木樨转录组及小RNA研究 |
| 2.4 研究目的意义及技术路线 |
| 2.4.1 研究的目的及意义 |
| 2.4.2 研究的技术路线 |
| 第三章 无芒隐子草全基因组及比较基因组学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 样品采集与Illumina和 PacBio建库、测序、质控 |
| 3.2.2 基因组大小评估及组装 |
| 3.2.3 Hi-C辅助基因组组装及基因组组装质量评估 |
| 3.2.4 基因组结构及功能注释 |
| 3.2.5 亚组区分及全基因组复制 |
| 3.2.6 系统进化与物种分歧时间估算 |
| 3.2.7 转录组测序及分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 高质量无芒隐子草基因组图谱 |
| 3.3.2 基因组结构和功能注释 |
| 3.3.3 异源四倍体无芒隐子草 |
| 3.3.4 无芒隐子草的四倍体化及与近缘种的系统进化 |
| 3.3.5 基因家族聚类及扩张收缩 |
| 3.3.6 无芒隐子草无显着的亚组表达优势 |
| 3.3.7 无芒隐子草基因通过转录变化响应干旱胁迫 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 无芒隐子草二型性花发育的调控网络分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 花发育调控网络构建及基因鉴定 |
| 4.2.2 开花基因共表达网络分析 |
| 4.2.3 ABCDE模型基因鉴定及qRT-PCR分析 |
| 4.2.4 闭花基因过表达水稻 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 花发育调控网络 |
| 4.3.2 CH和 CL小花的ABCDE模型基因 |
| 4.3.3 花发育相关转录因子与AMGs具有共表达分析关系 |
| 4.3.4 miRNA及其靶基因调控花发育 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 草木樨全基因组及比较基因组学分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 样品采集与Illumina和 PacBio建库测序 |
| 5.2.2 基因组组装与组装质量评估 |
| 5.2.3 Hi-C建库、测序、质控及辅助基因组组装 |
| 5.2.4 基因组结构和功能注释 |
| 5.2.5 比较基因组学分析 |
| 5.2.6 LTR逆转录转座子的比较分析 |
| 5.2.7 转录组测序及分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 白花草木樨基因组图谱 |
| 5.3.2 比较基因组和系统进化 |
| 5.3.3 基因家族扩张收缩 |
| 5.3.4 重复序列注释与进化 |
| 5.3.5 草木樨干旱适应性 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 草木樨群体进化及GWAS分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 草木樨种质间的SNPs/InDels检测 |
| 6.2.2 系统发育、群体结构和遗传多样性分析 |
| 6.2.3 连锁不平衡衰减、基因流和历史群体大小分析 |
| 6.2.4 全基因组选择清除和GWAS分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 群体结构 |
| 6.3.2 白花流向黄花草木樨的基因渗透 |
| 6.3.3 适应性进化 |
| 6.3.4 农艺性状的GWAS |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 香豆素生物合成候选基因鉴定及功能验证 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 NILs代谢组和BSA分析 |
| 7.2.2 香豆素生物合成相关基因家族鉴定及分析 |
| 7.2.3 MaBGLU1 基因大肠杆菌异源表达及底物饲喂 |
| 7.2.4 MaBGLU1 基因亚细胞定位及过表达草木樨 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 香豆素生物合成通路 |
| 7.3.2 香豆素生物合成相关候选基因 |
| 7.3.3 发现6 个BGLU串联重复的基因簇 |
| 7.3.4 MaBGLU1 酶的功能确认 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 结论与创新点 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）大肠杆菌生产L-色氨酸重组菌株的改造及发酵条件优化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 L-色氨酸的基本概述 |
| 1.1 L-色氨酸的理化性质 |
| 1.2 L-色氨酸的应用 |
| 1.3 L-色氨酸的生产方法 |
| 第二节 大肠杆菌生产L-色氨酸的合成途径及调控机制 |
| 2.1 大肠杆菌生产L-色氨酸的主要合成途径 |
| 2.2 大肠杆菌生产L-色氨酸调控机制 |
| 第三节 大肠杆菌生产L-色氨酸的育种思路 |
| 3.1 解除关键酶的反馈抑制作用 |
| 3.2 阻断支路代谢 |
| 3.3 提高前体物的水平 |
| 3.4 降低副产物的积累 |
| 3.5 转运途径的改造 |
| 3.6 阻断L-色氨酸的降解途径 |
| 第四节 论文的研究内容及意义 |
| 4.1 本论文的研究意义 |
| 4.2 本论文的研究内容 |
| 第二章 关键酶基因pckA和 tktA的共表达对L-色氨酸合成的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 pPA、pTA及pPT重组表达载体的构建 |
| 2.2 pPA、pTA及pPT重组表达载体PCR验证 |
| 2.3 PckA和TktA酶活性检测 |
| 2.4 重组菌株摇瓶发酵结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第三章 邻氨基苯甲酸合酶的改造对L-色氨酸合成的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 pPTT及突变重组载体的构建 |
| 2.2 pPTT重组载体PCR扩增验证 |
| 2.3 耐高浓度色氨酸类似物突变菌株的筛选 |
| 2.4 高产L-色氨酸突变菌株的筛选 |
| 2.5 邻氨基苯甲酸合酶突变位点分析与结构模拟 |
| 2.6 邻氨基苯甲酸合成酶酶活性测定结果 |
| 2.7 重组菌株摇瓶发酵结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第四章 丙氨酸转氨酶的修饰对L-色氨酸合成的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 基因alaA、alaC和avtA与抗性基因的交换 |
| 2.2 L-丙氨酸转氨酶各基因缺失菌株的构建 |
| 2.3 L-丙氨酸转氨酶各单基因敲除后摇瓶发酵验证结果 |
| 2.4 L-丙氨酸转氨酶各双基因及全部敲除后摇瓶发酵验证结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第五章 摇瓶发酵条件及培养基优化 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 质粒稳定性检测 |
| 2.2 L-苯丙氨酸残液替代L-苯丙氨酸粉末效果 |
| 2.3 发酵条件优化 |
| 2.4 发酵培养基的优化 |
| 2.5 50L罐补料分批发酵验证 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 基因符号说明 |
| 1 前言 |
| 1.1 L-苯丙氨酸简介 |
| 1.1.1 L苯丙氨酸的性质 |
| 1.1.2 L-苯丙氨酸的应用 |
| 1.2 L-苯丙氨酸的生产方法与研究进展 |
| 1.3 L-苯丙氨酸的生物合成途径及代谢调控 |
| 1.4 代谢工程育种策略 |
| 1.4.1 去除关键酶反馈抑制,强化关键酶表达 |
| 1.4.2 优化莽草酸途径通量 |
| 1.4.3 增加前体物供应 |
| 1.4.4 改造L-苯丙氨酸转运系统 |
| 1.5 Crispr/Cas9编辑技术在大肠杆菌中的应用 |
| 1.6 立题背景和研究内容 |
| 1.6.1 立题背景 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 本论文的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及引物 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 常用溶液的配制 |
| 2.2.4 培养基配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分子生物学操作方法 |
| 2.3.2 感受态的制备及转化 |
| 2.4 大肠杆菌的Crispr/Cas9基因编辑方法 |
| 2.4.1 pGR/B质粒构建 |
| 2.4.2 DNA重组片段的制备 |
| 2.4.3 质粒和重组DNA片段的电转化 |
| 2.4.4 大片段DNA整合的方法 |
| 2.5 大肠杆菌发酵培养方法及发酵液分析测定方法 |
| 2.5.1 摇瓶发酵培养 |
| 2.5.2 发酵罐分批补料发酵 |
| 2.5.3 pH的测定 |
| 2.5.4 菌体生物量的测定 |
| 2.5.5 葡萄糖浓度测定 |
| 2.5.6 HPLC测定发酵液中L-苯丙氨酸浓度 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 大肠杆菌L-苯丙氨酸分支途径的改造 |
| 3.1.1 pheA-tyrB基因的整合 |
| 3.1.2 摇瓶发酵验证pheA-tyrB整合效果 |
| 3.1.3 pheA-tyrB基因双拷贝及三拷贝的整合 |
| 3.1.4 不同pheA-tyrB基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.2 关键酶基因aroG的改造 |
| 3.2.1 aroG点突变基因的整合 |
| 3.2.2 摇瓶发酵验证aroG改造效果 |
| 3.2.3 不同aroG基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3 优化莽草酸途径代谢通量 |
| 3.3.1 不同aroC基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.2 不同aroA基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.3 不同aroL基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.4 不同aroE基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.5 不同aroD基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.6 不同aroB基因表达水平对L苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.3.7 莽草酸途径的改造对L-苯丙氨酸产量影响的讨论 |
| 3.4 增加前体物供应 |
| 3.4.1 pykF基因的敲除 |
| 3.4.2 不同pps基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.4.3 不同tktA基因表达水平对L-苯丙氨酸合成的影响 |
| 3.5 转运蛋白的改造 |
| 3.5.1 pheP基因的敲除 |
| 3.5.2 aroP基因的敲除 |
| 3.6 L-苯丙氨酸工程菌株E.coli PHE13的5L发酵罐验证 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（10）玫瑰L-苯丙氨酸生物合成关键基因的克隆与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 玫瑰的价值 |
| 1.2.1 观赏价值 |
| 1.2.2 食用价值 |
| 1.2.3 药用价值 |
| 1.2.4 经济价值 |
| 1.3 植物花香研究进展 |
| 1.3.1 植物花香成分的合成途径 |
| 1.3.2 植物L-苯丙氨酸合成途径中的重要基因 |
| 1.4 L-苯丙氨酸的合成 |
| 1.4.1 化学合成法 |
| 1.4.2 物理提取法 |
| 1.4.3 酶促合成法 |
| 1.4.4 微生物发酵法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 玫瑰L-苯丙氨酸合成关键基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 生化试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 基因克隆 |
| 2.2.3 序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 玫瑰L-苯丙氨酸生物合成关键转录因子的克隆 |
| 2.3.2 玫瑰L-苯丙氨酸生物合成关键结构基因的克隆 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 玫瑰L-苯丙氨酸合成关键基因的时空表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 反转录反应 |
| 3.2.4 RT-PCR反应 |
| 3.2.5 qPCR反应 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 玫瑰花不同发育时期L苯丙氨酸合成关键基因的表达模式分析 |
| 3.3.2 玫瑰花器官不同部位L-苯丙氨酸合成关键基因的表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 玫瑰L-苯丙氨酸合成关键基因转化矮牵牛及功能验证 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 常用试剂的配制 |
| 4.1.5 常用培养基的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 L-苯丙氨酸合成关键基因过表达载体构建 |
| 4.2.2 矮牵牛的遗传转化 |
| 4.2.3 转基因矮牵牛的鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因过表达载体构建 |
| 4.3.2 矮牵牛的遗传转化 |
| 4.3.3 转基因矮牵牛的鉴定与观测 |
| 4.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达（论文参考文献）
- [1]基于比较转录组学分析代谢改造粘质沙雷氏菌JNB5-1高效合成灵菌红素[D]. 孙杨. 江南大学, 2021(01)
- [2]重组大肠杆菌全细胞催化合成苯乳酸[D]. 邵宇. 江南大学, 2021(01)
- [3]代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇[D]. 朱灵桓. 江南大学, 2021(01)
- [4]丹酚酸生物合成途径关键催化酶的解析及功能研究[D]. 周正. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [5]黄芩素生物合成途径在毕赤酵母中的异源重构[D]. 陈鑫洁. 华东理工大学, 2021(08)
- [6]植物乳杆菌YM-4-3苯乳酸合成代谢调控机制及相关基因的功能研究[D]. 吴文妤. 昆明理工大学, 2021(02)
- [7]无芒隐子草和白花草木樨全基因组及其关键性状相关功能基因研究[D]. 吴凡. 兰州大学, 2021
- [8]大肠杆菌生产L-色氨酸重组菌株的改造及发酵条件优化[D]. 孟帅帅. 福建师范大学, 2020(12)
- [9]大肠杆菌L-苯丙氨酸工程菌株的构建[D]. 门佳轩. 天津科技大学, 2020(08)
- [10]玫瑰L-苯丙氨酸生物合成关键基因的克隆与功能验证[D]. 朱敏. 扬州大学, 2020(04)