潘延云[1]2003年在《花粉PLC活性检测、cDNA克隆及功能分析》文中认为我室前期药理学实验证明外源纯化的钙调素可促进花粉萌发和生长，位于质膜内侧的异叁聚体G蛋白对该过程也有调节作用。在这个过程中，细胞外钙调素可能是异叁聚体G蛋白参与调控的质膜外信号之一，而G蛋白跨膜传递了这一信号。细胞外钙调素信号转导的工作模型初步建立(马力耕和孙大业，2000)。支持这一模型的还有我室的有关肌醇磷脂系统的大量药理学实验(马力耕等，1998)以及采用显微注射(Microinjection)技术和激光共聚焦技术等得到的大量数据(王昕等，2000；尚忠林等，2001)。这些结果均表明，磷脂酶C信号系统也可能参与了花粉管伸长过程的调节，并且可能由G蛋白介导参与了细胞外CaM的跨膜信号转导过程。 为了给上述信号转导过程提供进一步的证据，本文以百合花粉为材料，从PLC活性的测定、PLC基因的克隆及其与花粉萌发的关系、以及PLC活性被G蛋白和CaM调控等方面，为肌醇磷脂系统参与花粉萌发和细胞外钙调素的信号转导过程进一步提供了分子生物学和生物化学的证据。本文还利用PLC相关突变体及其超表达转基因拟南芥为材料，进一步检测了PLC基因突变和超表达对花粉的萌发和花粉管生长的影响，从分子水平上提供了PLC参与花粉萌发和生长的直接证据。 实验中，利用[~3H]PIP_2和花粉原生质体共同孵育的体系，检测出了百合花粉细胞具有依赖PIP_2的PLC活性；利用该体系还检测出外源钙调素可促进PLC的活性，其中10~(-9)M的钙调素可使PLC的活性提高叁倍；异叁聚体G蛋白的激活剂CTX可以激活PLC的活性，而其抑制剂PTX可明显抑制PLC活性；外源钙调素的这种作用可以被PTX抑制；而PLC抑制剂U-73122抑制CTX对PLC的激活效应。利用confocal技术检测了PLC对花粉细胞游离钙离子的影响，观察到U-73122抑制细胞质游离钙离子水平的升高和钙震荡。上述结果表明，在花粉体系中，PLC-IP_3-Ca~(2+)做为G蛋白的下游组分，参与了G蛋白介导的胞外CaM的信号传递途径。 本文首次从百合花粉中克隆了两个PLC基因(LdPLC1和LdPLC2)。序列分析表明，两条cDNA都含有构成催化中心的X、Y结构域和C端C2调节域，但N末端的EF手形结构较其他植物PLC有差异。Northern和RT-PCR分析，发现随着花粉的萌发，LdPLC2的转录活性提高，而LdPLC1博士学位论文在萌发前后的转录水平没有变化，推测至少LdpLCZ参与了对花粉萌发的调控。本文还利用酵母双杂交体系检验了PLC与G蛋白各亚基的相互作用，发现LdPLCI与GQ和GY的杂交结果为阴性，与Gp亚基可发生相互作用;LdPLCZ与Gp弱相互作用，与其他亚基没有作用。上述结果表明在G蛋白和PLC的相互作用中，p亚基可能起调节作用。百合花粉PLC的克隆及分析为PLC存在并参与花粉萌发和生长提供了分子水平的证据，也使胞外CaM的信号及传递假说开始有分子生物学方面的依据。 本文最后还构建了拟南芥PLC的双元载体，经遗传转化得到了PLC超表达拟南芥。以超表达体和该基因的相关突变体为材料，检测了PLC基因突变和超表达对花粉萌发和花粉管伸长的影响，结果表明，与野生型相比，PLC基因突变和超表达植株的花粉萌发率和生长速度均有显着性差异存在。该文还对拟南芥不同亚型PLC之间的相互关系做了初步探索，发现PLC同工酶之间在转录表达上可能存在着彼此的相互作用。上述结果进一步为PLC调控植物花粉萌发提供了分子水平的证据。
隋镇华[2]2007年在《玉米磷脂酰肌醇信号途径部分基因的cDNA克隆及表达分析》文中指出磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)是真核细胞中主要的磷脂组分，磷脂酰肌醇途径(PI pathway)在植物的生长、发育和感受刺激并对之应答的过程中发挥十分重要的作用。其主要路线为：磷脂酰肌醇合成酶(phosphatidylinositol synthase，PIS)以CDP-DG(CDP-diacylglycerol)和游离的myo-肌醇(myo—inositol)为底物，生成PI；PI在一系列激酶的作用下生成磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP_2)；在磷脂酶C(phospholipase C，PLC)催化下，PIP_2水解生成二酯酰甘油(diacylglycerol，DAG)和叁磷酸肌醇(trisphosphate inositol，IP_3)；IP_3可以在激酶或磷酸酶作用下，生成磷酸化程度不同的肌醇分子，并可生成自由myo-肌醇参与下一轮信号反应；DAG被二酯酰甘油激酶(diacylglycerol kinase，DGK)磷酸化生成磷脂酸(phosphatidic acid，PA)，PA可被磷酸化为焦磷酸二酯酰甘油(diacylglycerol pyrophosphate，DGPP)，经过一系列反应后生成CDP-DG，进入下一轮循环。本工作以玉米优良自交系90110为材料，利用水稻、拟南芥中已知PI pathway相关的基因序列检索玉米核酸序列数据库，根据所得的序列设计引物，通过RACE或电子克隆与PCR相结合等方法分别获得了可能编码ZmPIS2、ZmPLC2、ZmDGK1、ZmDGK2、ZmDGK3、ZmPLA2-1、ZmPLA2-2等基因的包含完整开放读码框(opening reading frame，ORF)的cDNA序列及ZmPLC3基因的部分cDNA序列，将其在GenBank中进行注册并分析了各cDNA包含的序列信息。将获得的cDNA序列在PlantGDB中进行BLAST，检索得到了ZmPIS、ZmPIS2、ZmPLC、ZmPLC2、ZmPLC3、ZmDGK1、ZmDGK2的部分或全部启动子序列。利用PLACE在线软件进行分析发现这些启动子序列中包含多种与冷、旱和激素相关的顺式作用元件。我们根据PIS家族(ZmPIS，ZmPIS2)，PLC家族(ZmPLC，ZmPLC2，ZmPLC3)，DGK家族(ZmDGK1，ZmDGK2，ZmDGK3)及ZmPLD的cDNA序列3’端或非保守区设计引物。采用RT-PCR方法对以上基因在不同器官(根、茎、叶、雄穗、雌穗)中的表达水平进行了半定量分析，结果发现各基因在不同器官中的表达模式不同：用Real-time RT-PCR的方法分析冷、旱等非生物胁迫和脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA3)等激素处理下这些基因的表达水平，结果表明PI途径中的不同基因家族以及每个家族的不同基因成员对不同刺激应答模式不同。这提示我们PI途径各成员细胞主要的生理途径中可能具有重要或不同的生理功能。为了分析基因的生理功能，本实验已经分别将ZmPIS2、ZmPLC2、ZmDGK1、ZmDGK2、ZmDGK3、ZmPLA2-1基因重组到植物表达载体。这为利用转基因技术分析基因的功能打下了良好的基础。
王蕾[3]2011年在《烟草磷脂酶C基因的表达模式和过表达NtPLC4转基因烟草提高抗病性研究》文中指出磷酸肌醇信号途径在高等植物的生长、发育及对环境胁迫反应中发挥重要作用。磷脂酶C (phospholipase C, PLC)是磷酸肌醇信号途径中的关键酶。细胞外信号通过细胞膜受体激活磷酸肌醇特异的PLC (Phosphoinositide-specific phospholipase C, PI-PLC),PLC通过催化磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸( phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate, PIP_2 )水解产生二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)和叁磷酸肌醇( trisphosphate inositol, IP_3 )。在植物中,DAG在二酯酰甘油激酶(diacylglycerol kinase, DGK)的作用下快速转变为磷脂酸(phosphatidic acid, PA)。IP_3和PA作为植物细胞中重要的次级信使,在植物对生物及非生物胁迫反应中起重要作用。烟草作为重要的经济作物,在种植过程中经常遇到盐害、干旱、病原菌侵染等逆境胁迫,严重影响着烟草的生长发育。本实验室前期研究表明烟草PLC参与了细胞死亡和防卫反应。烟草基因组中至少有4个PLC基因,本实验以烟草悬浮细胞及烟草植株为试材,通过Real Time-PCR的定量分析测定了烟草4个PLC基因在不同的器官、胁迫和病菌侵染下的表达模式;利用特异性引物克隆获得烟草NtPLC4基因的全序列,构建其正反义植物表达载体,通过NtPLC4过表达和抑制表达的转基因烟草研究了该基因在烟草抗病中的作用。所得结果如下:1.为了研究烟草PLC在烟草不同组织器官和不同胁迫条件下的表达特征,采用实时荧光PCR(Real Time-PCR)方法测定了烟草4个PLC基因的表达强度。结果显示:在烟草的根、茎、叶、花四个组织中4个PLC基因,表达水平有差别,不同的PLC基因在同一个组织中的表达量有明显的差异,同一种PLC基因在不同的组织中的表达量也不同。其中,NtPLC1在根、茎、叶、花四种组织中的相对表达量均比较低,而在茎中的表达量较高;NtPLC2在叶部有高水平表达;NtPLC3在花和茎部的表达量高于叶和根;NtPLC4在根部的表达量最高,茎和叶中次之,花中的表达量最低。不同的外界条件,如盐胁迫、脱落酸、病菌侵染和低温等处理烟草悬浮细胞,4个PLC基因的表达水平也具有不同的表达特征,200 mmol/L的NaCl处理时NtPLC1的表达量是对照的5倍,NtPLC3是对照的4.4倍;用不同浓度的脱落酸处理24 h,NtPLC1和NtPLC3随着ABA浓度的增加表达量呈现升高趋势;烟草黒胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)孢子悬浮液(终浓度为4×10~4孢子/mL)处理烟草悬浮细胞后,随着时间的推移NtPLC3的表达量明显呈升高的趋势,24 h时是对照的6.1倍;用蛋白激发子ParA1处理后,随着时间的推移NtPLC4的表达增强,30 min时达到最高峰,表达量是对照的3.8倍,之后水平开始回落。这些结果说明烟草4个PLC基因可能具有不同的功能分化,并且NtPLC3和NtPLC4受胁迫和病原菌诱导尤其明显,初步说明这两个基因参与了烟草的抗病过程和防卫反应。2.为了研究烟草NtPLC4基因的抗病功能,将NtPLC4的编码区正向和反向基因克隆到植物表达载体pROKⅡ的35S启动子之后,构建其正义和反义植物表达载体。通过冻融法将其导入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞,用烟草栽培品种NC89为转基因材料,通过农杆菌介导的转基因策略获得了转NtPLC4基因的烟草植株。对转基因烟草植株进行PCR鉴定,共获得NtPLC4过量表达的烟草植株50棵,NtPLC4抑制表达的植株76棵。3.在幼苗生长阶段,转基因烟草与野生型相比生长表型无明显差异。采用离体叶片接种的方法,对NtPLC4基因过量表达和抑制表达的转基因植株接种烟草赤星病菌(Alternaria longipes)强毒株TBA003,结果表明NtPLC4过量表达的烟草植株抗病性显着提高。Real Time-PCR检测显示,转基因烟草NtPLC4基因的表达量与抗病性是一致的。
张红建[4]2014年在《小麦胁迫应答基因TaCHP和TaDSU的功能研究》文中进行了进一步梳理盐旱等非生物胁迫条件,植物通过磷脂等众多信号通路组成的胁迫应答网络产生应答反应。动物中甘油二酯(DAG)是重要的磷脂分子之一,但植物中还没发现其靶信号蛋白,因而DAG在植物中的调控机制还不清楚。胁迫应答涉及到大量蛋白质的修饰化改变,其中SUMO化能够稳定蛋白质。SUMO化是动态可逆的过程,但是去SUMO化在胁迫应答中的功能研究较少。小麦是重要的粮食作物,但它属于甜土植物,抗逆能力较差,愈发严重的盐旱逆境严重影响了作物产量,因而有必要挖掘抗逆相关基因、培育抗逆小麦品种。本实验室利用不对称体细胞杂交渐渗技术选育了小麦渐渗系耐盐抗旱新品种山融3号(SR3),它是亲本普通小麦济南177(JN177)的近等基因系,是挖掘抗逆相关基因的优良材料。本实验室前期鉴定了一个可能参与磷脂通路的小麦耐盐相关基因TaCHP.本实验室一方面分析了TaCHP与磷脂通路的相关性,另一方面克隆了一个催化蛋白质去SUMO化的SUMO蛋白酶基因TaDSU,初步分析了它在植物抗逆中的作用和生理基础。1.小麦耐盐基因TaCHP与磷脂通路的相关系分析TaCHP含有叁个能与DAG特异性结合的C1结构域,具有转录激活活性,定位于细胞膜、细胞质和细胞核,与动物中DAG结合蛋白蛋白激酶D相似,因此推测TaCHP可能是DAG结合蛋白,通过调控磷脂途径提高耐盐能力。本论文发现,与野生型相比,TaCHP过表达系中催化DAG合成的PLC和NPC及催化DAG转化为PA的DGK基因家族部分成员的转录水平在正常条件下及NaCl、H2O2或ABA处理后发生显着变化,而且各条件下发生变化的基因也不一样。这一结果表明TaCHP使磷脂信号通路活性发生了改变。洋葱表皮瞬时表达实验显示,利用PLC抑制抑制DAG合成时,TaCHP在细胞膜中分布增强,暗示TaCHP可能通过结合DAG被招募到细胞膜上。但是Fat western blot分析显示,TaCHP在体外不能与16碳DAG结合,推测TaCHP结合DAG存在特异性,可能结合某些其他长度碳链DAG。TaCHP不影响16碳DAG和16碳PA对植株生长的影响。利用PLC抑制剂抑制DAG合成时,植株生长受阻,而TaCHP过表达株系受阻程度较小；利用DGK抑制剂抑制DAG转化为PA时,植株侧根发育被抑制,而TaCHP过表达能延缓这种效应。但是利用PLD抑制剂抑制PA合成时,野生型和TaCHP过表达株系的变化相同,两者间无明显差异。这一结果显示,TaCHP能特异性参与DAG合成和代谢受阻对生长发育的影响。外源16碳DAG或16碳PA存在时,TaCHP过表达系植株对NaCl的耐受性提高,主根比野生型长。但是PLC抑制剂处理及其与DAG共处理后,野生型和TaCHP过表达系对NaCl的耐受性无显着差异。同样,DGK抑制剂处理及其与DAG共处理后,TaCHP过表达系对NaC1的耐受性也与野生型相似。这些结果显示,DAG可能通过转化为PA提高TaCHP的耐盐性。2.小麦去SUMO化蛋白酶基因TaDSU的功能分析通过基因芯片筛选,发现一个注释为ULP的非生物胁迫应答型探针,据此克隆了一个小麦去SUMO蛋白酶基因TaDSU。NaCl、甘露醇和ABA处理后,TaDSU表达发生了显着变化,而且其变化模式在SR3和JN177间存在差异。TaDSU与小麦A基因组祖先种乌拉尔图小麦中一个同源基因的一致性最高,表明它来源于乌拉尔图小麦。TaDSU可能定位于5AL上,而5AL上包含SR3耐盐主效QTL。为了验证TaDSU的生理功能,我们构建了TaDSU过表达株系。结果发现,TaDSU过表达不影响拟南芥的生长发育,但增强了拟南芥的耐盐、抗渗透胁迫和抗旱能力,而减低对ABA的敏感性。TaDSU过表达降低了非生物胁迫应答通路相关基因的表达,而提高了NaCl胁迫下的K+含量和K+/Na+比。与野生型相比,TaDSU过表达株系在正常条件下ROS含量降低,而干旱条件下ROS含量提高。结果初步表明,TaDSU通过调控离子平衡和氧化还原平衡提高抗逆能力。
黄洁, 刘晓华, 管洁, 吕英民[5]2012年在《百合分子育种研究进展》文中认为从百合基因克隆(包括减数分裂基因、花发育基因、花色基因、花粉发育基因以及抗性相关基因),再生体系建立(包括不定芽再生系统、原生质体再生系统、体细胞胚再生系统、愈伤组织再生系统),外源基因转化方法(包括农杆菌介导的遗传转化、DNA直接导入系统的基因转化、花粉管通道法)及转基因应用等方面,介绍近年来国内外百合分子育种的研究进展,并讨论了百合分子育种研究中存在的问题和应用前景。
潘延云, 朱正歌, 孙大业[6]2005年在《植物磷脂酶C及其参与的信号途径》文中研究指明就植物磷脂酶C(PLC)的结构特征、基因克隆和其在介导植物对外界刺激应答反应的信号转导过程中的作用等研究进展做了介绍。
李银花[7]2013年在《茶树中甲基化EGCG的分离纯化与相关基因的克隆及其表达研究》文中进行了进一步梳理EGCG是茶树中具有重要生理功能的次级代谢产物。(-)-表没食子儿茶素-3-0(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG3"Me)和(-)-表没食子儿茶素-3-O(4-O-甲基)没食子酸酯(EGCG4"Me)作为EGCG甲基化衍生物,研究表明其具有高效的抗过敏功能,尤其是抗花粉过敏表现出的优势引起了日本产业界的高度重视,也掀起了研究甲基化EGCG的热潮。花粉症在一些国家发病率较高,日本发病率超过1/3。目前治疗过敏性疾病的药物多为化学合成药,尚未发现有比茶叶中的EGCG3"Me和EGCG4"Me对过敏,尤其是花粉症过敏更显着功效的纯植物药品,国际医药与保健品行业均认为甲基化EGCG非常有可能发展为一个独立茶树品种,成为新的儿茶素经济增长点而为社会带来巨额财富。本论文立足于上述研究背景,以富含甲基化EGCG的茶树资源为材料,研究了茶树中甲基化EGCG的分析检测方法,分离纯化技术及其化学合成方法,全长克隆和分析了甲基化EGCG生物合成相关基因,并采用原核表达和体外酶试验对候选基因进行了功能验证,为茶树甲基化EGCG生物合成的调控及甲基化EGCG高效利用提供了有价值的理论依据与技术基础。主要研究结果如下：建立了同时测定茶叶中8种儿茶素(EGC、DL-C、EC、EGCG、 GCG、EGCG3"Me、 EGCG4"Ne、ECG)、3种生物碱(茶碱、可可碱、咖啡碱)和没食子酸的高效液相色谱方法。色谱条件如下：采用C18色谱柱；流动相为磷酸缓冲液-乙腈溶液,梯度洗脱；波长278nm；流速1.0mL/min;柱温30℃。该方法除了可以测定两种甲基化EGCG外,还能检测茶叶中其他成分,对茶树资源的筛选、茶叶甲基化EGCG的分离纯化等提供了强有力的分析工具。采用柱色谱和反相高效制备液相色谱相结合的方法从茶叶中分离制备两种甲基化EGCG (EGCG4"Me和EGCG3"Me)。用含水的乙酸乙酯为溶剂提取茶叶,粗提液浓缩后经HP-20柱色谱分离,以不同浓度的酒精为洗脱剂,收集80%酒精洗脱组分再经制备液相色谱分离,以水和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离两种甲基化EGCG单体。经紫外光谱、质谱、核磁共振分析以及与文献比对,确定两种甲基化EGCG分别为EGCG4"Me和EGCG3"Me,纯度在98%以上。以硫酸二甲酯为甲基化试剂、EGCG为底物、丙酮为溶剂,采用化学方法合成甲基化EGCG。利用制备型高效液相色谱和超临界流体色谱对合成的粗产物进行分离,得到3种甲基化EGCG单体。经紫外光谱、核磁共振、质谱分析以及与文献比对,确定3种甲基化EGCG分别为EGCG4"Me、3',4"-di-O-methyl-EGCG、4',4"-di-O-methyl-EGCG,且EGCG4"Me为主要产物。所制备的3种甲基化EGCG的纯度在98%以上。利用SMART RACE技术成功克隆了甲基化EGCG合成酶(CsCOMT)的全长cDNA序列。CsCOMT基因的cDNA全长1040bp,ORF为738bp编码245个氨基酸。经过相关的生物信息学分析,CsCOMT氨基酸残基数为245,理论等电点PI5.39,分子量27553.6(Da),属于亲水性蛋白,CsCOMT蛋白氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构,存在跨膜结构域,属于跨膜蛋白,其磷酸化位点有5个,非均匀的分布在整个多肽链中。克隆甲基化EGCG合成酶基因的全长cDNA,对于改良茶树品种资源具有良好的现实意义。采用原核表达和体外酶试验法,对甲基化EGCG合成酶基因功能进行了初步验证。采用中间质粒pMD18-CsCOMT,成功构建了茶树CsCOMT蛋白的重组质粒pET-28a-CsC0MT,并转入表达载体BL21,经IPTG诱导实现了重组蛋白的表达,表达蛋白的分子量大约为28kD,其分子量与预测的一致。以EGCG为底物,利用纯化的重组蛋白进行体外酶促试验,经HPLC分析检测,成功诱导出甲基化EGCG。采用相对定量的分析方法,分析了同一茶树品种—芽二叶及第叁、四叶、不同品种同一时期、同一品种不同采摘时期中的CsCOMT基因表达量。
韩青[8]2016年在《漾濞大泡核桃JsPRP1基因的克隆及功能分析》文中认为本研究基于对漾濞大泡核桃(Juglans sigillata,Dode)受胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)侵染前后转录组测序产生的差异表达基因,根据编码富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP)的EST序列,通过快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从漾濞大泡核桃中克隆获得一个新的PRP基因JsPRP1,并对其进行生物信息学分析。采用荧光定量PCR (quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR)技术分析JSPRP1在漾濞大泡核桃叶片中的表达特性。构建JsPRP1基因的原核表达载体,诱导表达并纯化目的蛋白,检测重组目的蛋白的抗真菌活性。构建pBIN m-gfp5-ER-JsPRP1载体并转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefacies)EHA105中,通过农杆菌介导侵染洋葱表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下,借助绿色荧光蛋白信号确定JsPRP1的亚细胞定位。同时将JSPRP1转入烟草(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi)中异源超表达,研究JsPRP1的功能。本论文的研究工作及得到的主要结果如下：1.克隆获得JsPRP1的全长cDNA和基因序列,并对其进行一系列的生物信息学分析。JSPRP1全长815 bp,编码一个具有135个氨基酸的蛋白质,序列比对结果显示JsPRP1属于PRP家族。叁维结构预测显示JsPRP1蛋白由4个α-螺旋和不规则卷曲组成。4个α-螺旋纵横交错,形成一个空穴。2.qRT-PCR结果显示,接种胶孢炭疽菌后,漾濞大泡核桃叶片中JsPRP1的转录水平逐渐上升,48 h达到最高。茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理6h和24 h时,JsPRP1表达量急剧增高。水杨酸(salicylic acid,SA)、乙烯(ethylene, ETH)和H202处理48 h可以大幅提高漾濞大泡核桃叶中JSPRP1的转录水平。3.构建JsPRP1的原核表达载体pET-32(a)-JsPRP1并转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)诱导表达后,利用Ni-NTA柱进行融合蛋白的纯化。平板抑菌活性分析结果表明纯化所得JsPRP1融合蛋白对串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)、胶孢炭疽菌、葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)和茄腐镰刀菌(fusarium solani)等几种真菌表现出了不同程度的抗性。4.将融合基因表达载体pBIN m-gfp5-ER-JsPRP1转入根癌农杆菌EHA105中,侵染洋葱内表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察目标蛋白在细胞内的定位情况。结果显示,JsPRP1是定位在细胞壁上的蛋白质。5.构建JsPRP1植物超表达载体pCAMBIA2300S-JsPRP1转入烟草中过表达,并培育获得T2代转基因烟草。qRT-PCR分析结果表明,JsPRP1在转基因烟草中稳定地表达。与野生型相比,JSPRP1转基因烟草T2代植株对干旱和镉胁迫及胶孢炭疽菌侵染的抗性都大大增强。相应的,干旱和镉胁迫处理后转基因烟草叶片内H2O2水平也显着低于野生型烟草。以上结果表明,JsPRP1为一个新的漾濞大泡核桃PRP基因,其表达受外源信号分子处理和胶孢炭疽菌侵染的诱导,所编码的蛋白具有抗真菌活性。JsPRP1是定位在细胞壁上的蛋白质。JSPRP1过表达可提高转基因烟草对干旱和重金属镉胁迫以及胶孢炭疽菌侵染的抗性。因此,作为一个抗逆候选功能基因,JsPRP1可用于基因工程技术提高植物的抗逆能力。
杨丽[9]2006年在《百合查尔酮合成酶基因（CHS）及其启动子的克隆与分析》文中认为百合是世界五大切花之一,花朵硕大,花色各异,花姿优雅,倍受人们的青睐。但是,百合随着花朵的开放而迅速衰老,如何延长花朵的寿命已成为近年来科学家们研究的主要课题之一。在百合切花衰老机理研究的基础上,通过构建百合ACC氧化酶基因的RNA干扰载体,将其转入百合中表达,将会明显达到延缓其衰老的目的。本研究旨在得到百合花器官中特异、高效表达的启动子,为载体构建提供有效的调控元件,使外源基因只在花中特异表达,达到时空特异表达的目的。本研究取得的主要结果如下:1.获得百合查尔酮合成酶基因(CHS)的cDNA片段以东方百合‘sobonne’为材料,提取花瓣组织RNA,根据Genbank已发表的查尔酮合成酶基因(CHS)的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR获得了约900bp的目的片段,经克隆测序,该试验片段长873bp,与已发表的百合中CHS基因的同源性达到91%以上,说明克隆的片段属于查尔酮合成酶基因。该序列已在GenBank上登陆,登陆号为:DQ471950。2.获得了百合查尔酮合成酶基因(CHS)的DNA全长序列在获得CHS cDNA序列的基础上,重新设计CHS基因的引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得了大约1300bp的目的片段,经克隆测序后表明,该片段长1307bp,与已得到的cDNA序列对比分析,CHS基因DNA序列包含两个外显子和1个内含子。该序列已在GenBank上登陆,登陆号为:DQ471951。3.获得了百合查尔酮合成酶基因(CHS)上游调控区本研究比较应用了接头连接PCR和Uneven PCR两种染色体步移方法对CHS基因的上游序列进行克隆。结果表明,通过接头连接PCR,结合应用了巢式PCR,降落PCR,热启动PCR和两步PCR的特点,克隆了约898bp的百合CHS基因的上游调控序列。在启动子数据库Plant CARE中分析表明,该序列为一条未经报道的新序列,该序列具有花中专一性表达的基本保守区‘TACPyAT’,并且具备与转录起始有关的TATA盒,辅助转译的CAAT盒,G盒,CCAAT等基础启动子所具备的主要顺式作用元件。
林敬晶[10]2008年在《蜡梅凝集素基因Cplectin在百合中的表达及抗虫性初步鉴定》文中进行了进一步梳理本文以麝香百合(Lilium longiflorum Tbunb)“素雅”(White-Elegance)和“晶体”(Gelria)作为供试材料,通过外植体的再生,抗生素筛选条件及农杆菌介导遗传转化条件的优化,建立了百合的高频再生及遗传转化体系。用农杆菌介导法将蜡梅凝集素基因Cplectin转入百合中,并对转化植株进行了抗虫实验,主要研究结果如下:1.高频再生体系的建立(1)“素雅”鳞茎片的诱导分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L,分化率为91.7%;再生苗鳞茎片的不定芽分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L,分化率为90%;再生苗叶柄的诱导培养基为MS+NAA1mg/L,分化率为77.5%;生根培养基为1/2MS+NAA0.05 mg/L。(2)“晶体”鳞茎片的诱导分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L,分化率为88.3%;愈伤组织的分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,分化率为250%;胚性保持培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L;再生苗鳞茎片的不定芽分化培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L,分化率为87.5%;生根培养基为1/2MS+NAA0.05mg/L。2.遗传转化体系的建立(1)受体材料选择对于“素雅”这一品种再生苗鳞茎片和小叶柄分化率都比较高,但鳞茎片的组织对农杆菌的耐受能力强,且分化能力强,所以得到的抗性芽率高,而转化受体假阳性率也比较高,会增加后期检测的工作量;而再生苗叶柄的再生能力也比较强,且取材方便,多数直接能分化出幼苗,能够降低变异的发生频率,所以选择“素雅”再生苗叶柄作为受体材料。对于“晶体”这一品种来说,在鳞片再生过程中产生大量的疏松的浅黄色的胚性愈伤组织,多次继代后,仍保持良好的胚性及较强的生命力,接入分化培养基中能顺利分化出再生小植株。这对于遗传转化是非常有利的,所以选择“晶体”胚性愈伤组织作为受体材料。(2)抗生素浓度的确定根据卡那霉素(Kan)抗性筛选试验,确定了受体材料适宜的筛选浓度,以“素雅”的再生苗叶柄为受体材料,当卡那霉素的浓度为100mg/L时,叶柄的褐变率为97.5%,为亚致死浓度,所以Kan100mg/L适合作为叶柄的抗性筛选压;同理,以“晶体”的愈伤组织为受体材料时,当卡那霉素浓度为75mg/L时,愈伤组织褐变率为95%,所以Kan75mg/L适合作为愈伤组织的抗性筛选压。在生根培养基中,当Kan浓度为150mg/L时,以上两个品种的再生苗叶全部变黄,没有根生成,所以选用Kan150mg/L作为转化植株生根的筛选浓度。根据头孢霉素(Cef)抑菌试验,在头孢霉素浓度为250mg/L时,以上受体材料均有很好的抑菌效果,且不影响受体生长,所以选择为250mg/L作为抑菌浓度。(3)遗传转化条件的研究本试验对影响农杆菌转化效率的几个主要因素进行了研究,结果发现:取“素雅”的再生苗叶柄作为受体材料,预培养2d后,在OD_(600)值为0.6-0.8的农杆菌菌液的MS(无NH_4NO_3)重悬液中侵染10-12min,再共培养3d,可获得的较高瞬时表达率,为41.6%;“晶体”愈伤组织作为受体时,将经过2-3min创伤处理的愈伤组织,放在OD_(600)值为0.6-0.8的农杆菌菌液的MS重悬液中侵染8-10min。共培养3d,瞬时表达率较高,为43.3%。在以上研究的基础上,进一步研究发现,两种受体材料,在离心重悬的MS液(无NH_4NO_3)中加入100μmol/L乙酰丁香酮,在共培养基中也加入100μmol/L乙酰丁香酮时,瞬时表达率较不添加乙酰丁香酮时有大幅度提高。分别从41.6%和43.3%,提高到71.6%和75.0%。3.转化植株的获得通过筛选培养,获得卡那霉素抗性植株,对“素雅”86株抗性株和“晶体”93株抗性株进行GUS染色和PCR检测,初步鉴定凝集素基因Cplectin已经整合到两种百合中,其中各有21株和25株为阳性。转化率分别为24.4%和26.8%。4.抗虫性实验将阳性植株移栽后与未转基因植株的进行抗蚜虫试验,实验结果表明:这两个品种的转基因植株在抗虫性上明显高于对照的未转基因植株。
参考文献：
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[8]. 漾濞大泡核桃JsPRP1基因的克隆及功能分析[D]. 韩青. 昆明理工大学. 2016
[9]. 百合查尔酮合成酶基因（CHS）及其启动子的克隆与分析[D]. 杨丽. 西北农林科技大学. 2006
[10]. 蜡梅凝集素基因Cplectin在百合中的表达及抗虫性初步鉴定[D]. 林敬晶. 西南大学. 2008
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