1河北省中医院肿瘤二科 河北 石家庄050011 2河北医科大学第四医院科研中心 河北 石家庄050041 3河北医科大学研究生学院 河北 石家庄050017 4.河北省南宫市中医院内科 55750
河北省高层次人才资助项目，编号：B2012003007
摘 要：目的 观察小鼠食管癌前病变组织P16的表达及中药复方化浊润燥降气方的干预作用。方法：将130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组（简称“预防组”）、中药治疗组（简称“治疗组”），采用4-硝基喹啉-氧化物(4-NQO)制备小鼠食管癌前病变模型，采用流式细胞检测、免疫组织化学方法观察各组食管组织中P16的表达。结果：14周末食管癌前病变模型成功，24周末实验结束。24周末模型组小鼠P16表达水平与正常组相比明显升高（P＜0.05）；流式细胞检测示阳性对照组、预防组、治疗组分别与模型组相比，明显降低（P＜0.05）；预防组与阳性对照组无明显差异（p＞0.05）；预防组P16表达高于治疗组（P＜0.05）。免疫组织化学检测示阳性对照组与模型组相比无明显差异（P＞0.05）；预防组、治疗组分别与模型组及阳性对照组相比，明显降低（P＜0.05）；预防组P16表达低于治疗组（P＜0.05）。结论：小鼠食管癌前病变组织存在P16蛋白高表达，化浊润燥降气方能减轻食管癌前病变小鼠P16蛋白的表达。中药预防用药在免疫组化法检测中有一定优势，但在流式细胞检测中，预防用药未显示明显优势，P16作用机理有待于进一步研究。
关键词：食管癌前病变；化浊润燥降气方；4-硝基喹啉-氧化物；P16。
【中图分类号】R814.2【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0002-02
本实验通过建立小鼠食管鳞状上皮癌前病变动物模型，观察化浊润燥降气方对食管癌前病变模型小鼠P16蛋白表达的影响，探讨化浊润燥降气方的部分作用机理。
1实验材料
1.1 实验动物
选取清洁级健康SPF级C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周龄，体重17-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。
1.2 药物制备
1.2.1 造模药物4-NQO (购自Sigma公司)：将1g 4-NQO溶于50ml蒸馏水，配成浓度为2%的稀释液，4℃冰箱避光保存。使用时取0.5ml 2%原液加入100ml饮用水中，配成100μg/ml浓度。每100g小鼠每日用4-NQO 2500μg，即口服25ml含有4-NQO的饮用水。
1.2.2 阳性对照组药物ATRA（购自Sigma 公司）：使用时将30mg ATRA 溶于20ml稀释后的甲基纤维素中，每20g小鼠每次灌胃剂量为0.15mg，每周3次。
1.2.3 化浊润燥降气方 中药免煎颗粒化浊润燥降气方（药物组成：丹参、沙参、郁金、砂仁、荷叶、茯苓、浙贝母、藿香、佩兰、冬凌草、全蝎）。由河北省中医院药学部提供，每付中药生药含量131g，免煎颗粒为13.7g，小鼠用量与人用量的比例为0.0026:1，每20g小鼠服用0.2ml含有中药的水溶液。
1.3 主要试剂及仪器
羊抗p16多克隆抗体（Santa Cruz公司）；免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）；DAB显色剂（北京中杉金桥生物有限公司）；Epics-XLⅡ型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。
2实验方法
2.1动物分组及模型制备
采用随机分组的方法将130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组（简称“预防组”）、中药治疗组（简称“治疗组”），正常组、阳性对照组每组20只，其余每组30只。各组小鼠雌雄无明显差异，雌雄分笼。正常组常规饲养，不做特殊处理。其余110只小鼠，每日饮用100μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂养饲料。预防组在开始造模同时给予化浊润燥降气方灌胃，每周3次，剂量为20g小鼠服用0.2ml浓缩中药免煎颗粒。各组小鼠在给药期间每周测体重一次，根据体重调整给药剂量。14周末癌前病变模型成功。小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型组常规饲养；阳性对照组小鼠开始给予ATRA，剂量为每20g每次灌胃剂量为0.15mg，每周3次；预防组小鼠继续给予化浊润燥降气方灌胃，剂量如前；治疗组小鼠在模型制备成功时开始给予化浊润燥降气方灌胃，用量同预防组。24周末模型组5只小鼠食管上皮均有癌变，全部处死小鼠，取食管标本，进行各组指标检测。
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2.2流式细胞术测定各组小鼠p16的表达
制备单细胞悬液，取单细胞悬液1×106/ml 0.1ml，加入鼠抗人单克隆抗体工作液 0.1ml，室温孵育30分钟，加入PBS10ml洗涤一次，弃上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100ul，避光、室温孵育30分钟，加入PBS 10ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1ml经500目铜网过滤后上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，以x-mode值作为统计量进行多个样本均数比较的方差分析。
2.3免疫组织化学 免疫组织化学S-P法检测食管上皮组织p16的蛋白表达；
2.3.1步骤 将食管组织脱蜡和水化，PBS冲洗，滴加一抗，滴加生物素二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶-链霉卵白素工作液，室温孵育30分钟。DAB显色：蒸馏水洗，苏木素复染；透明；中性树脂50μl封片，室温保存。
2.3.2 免疫组化结果判断 采用HMIAS-2000高清晰度彩色分析系统。每组选6张切片，每张切片测10个区域，对每个区域进行平均光度值测定，然后对各组平均光度值进行统计分析。
2.4统计学处理
采用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计学处理。实验结果以均数±标准差(mean±S)表示，各组均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐时用SNK-q检验(Student-Newman-Keuls) 法作两两比较。P<0.05为明显差异；P>0.05为无明显差异。
3 结果
3.1各组食管组织p16流式细胞检测表达变化
结果表明，正常组p16 x-mode值为24.35±2.30；模型组为4.48±1.21，与正常组相比明显降低（P＜0.05）；阳性对照组、预防组、治疗组p16表达水平分别为15.03±1.36、16.70±2.12、12.42±1.74，三组分别与模型组相比，明显升高（P＜0.05）；预防组与阳性对照组相比无明显差别（P>0.05）；治疗组与阳性对照组相比，明显降低（P＜0.05）；预防组高于治疗组（P＜0.05） (Table 1；Fig.1 ) 。
2各组小鼠食管上皮组织中p16蛋白表达变化
免疫组化法检测结果显示，p16蛋白主要表达于细胞核和细胞浆，其细胞核和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。正常组p16的平均光度为0.206±0.025；模型组为0.137±0.021，与正常组相比明显降低（P＜0.05）；阳性对照组、预防组、治疗组p16的平均光度分别为0.191±0.014、0.176±0.016、0.182±0.032，三组分别与模型组相比，明显升高（P＜0.05）；预防组与阳性对照组及治疗组相比，明显降低（P＜0.05）；治疗组与阳性对照组相比无明显差异（P>0.05） (Table 1；Fig.2) 。
4 讨论
有研究表明，食管癌发生与其本身的基因改变相关。p16基因是1994年Kamb等[1]发现的继p53抑癌基因之后的又一种新型抑癌基因。p16基因的变异或其蛋白的失活会导致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F调节途径的失控，而使细胞过度增殖，导致肿瘤发生[2]。p16可与细胞周期蛋白D1竞争型结合CDK4抑制Rb蛋白的磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期[3]，从而抑制肿瘤发生。人类许多恶性肿瘤细胞系中都存在p16蛋白的高频率缺失[4]，p16基因的缺失与食管癌的发生、发展及预后有关[5-6]。
食管癌前病变属噎膈范畴。启膈散具有润燥降气、开郁化痰的作用，可以治疗噎膈轻症患者。化浊润燥降气方是在名方启膈散的基础上加化浊通络解毒之品藿香、 佩兰、冬凌草、天龙、全蝎而成，全方共奏化浊解毒、化痰解郁、通络散结之效。为探讨化浊润燥降气方对食管癌前病变小鼠食管组织p16的表达，本实验建立小鼠食管鳞状上皮癌前病变动物模型，在启膈散的基础上选取具有化浊解毒、润燥降气作用的免煎中药颗粒化浊润燥降气方作为研究对象，采用流式细胞技术、免疫组织化学方法，观察食管癌前病变小鼠食管组织p16的表达。结果表明，中药预防用药在免疫组化法检测中有一定优势，但在流式细胞检测中，预防用药未显示明显优势，P16作用机理有待于进一步研究。
参考文献
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论文作者:范焕芳1,单保恩通讯作者 黄茂1,王玲2,韩长辉3 刘
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/10/31
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