张莉[1]2004年在《针刺对大鼠脑缺血再灌注后线粒体损伤相关因素影响的研究》文中提出脑对缺血极为敏感,脑缺血再灌注损伤后,机体主动或被动地作出广泛的反应,构成了脑缺血再灌注损伤复杂的病理机制。由于脑缺血后存在着缺血时相改变,为在治疗时间窗内研究针对性干预,改善大脑功能提供了理论依据。由于缺血半暗区理论提出,使脑缺血再灌注损伤机制研究重点定位于脑组织出现不可逆之前。脑缺血再灌注损伤后的基本病理改变脑水肿及细胞凋亡,是各种因素相互作用和相互联系的结果。虽然线粒体功能恢复在缺血再灌注细胞复苏中必不可少,但线粒体在脑损伤一系列瀑布反应中起着非常关键作用,围绕着线粒体介导的脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的主要事件,脑缺血再灌注损伤病理上发生了一系列时间和空间的错综级联反应。脑缺血时,线粒体氧化磷酸化不能有效进行,ATP 生成减少而水解增多,细胞由于能量不足发生功能障碍,随着缺血时间延长,线粒体功能和结构受损,ATP 耗竭,细胞功能进一步损害。再灌注时,线粒体产生大量自由基,同时线粒体钙转运紊乱,发生永久性通透性改变,胞浆钙急剧升高,在 Bcl-2 家族、半胱天冬酶、细胞色素 C 等凋亡相关因子的作用下,导致细胞凋亡发生。脑缺血再灌注损伤可以诱导神经细胞再生,有内源性 NSC 激活现象,脑功能可以发生重建。神经元再生有分布和移行规律。神经生长因子和神经特异性蛋白等和神经再生关系密切。在众多的细胞因子中,神经营养因子在神经再生中具有重要作用。靶源性神经营养因子通过自分泌、旁分泌方式,转输作用于相应神经细胞,只有那些获得足够神经营养因子的神经元能够成活,否则就会死亡。脑缺血属于中医学中的中风病范畴。针刺治疗中风在我国已有数千年的临床验证,早在《黄帝内经》、《甲乙经》及《针灸大全》中即有记载。由于时间治疗窗的提出,针刺疗法已经从对缺血性中风后遗症和恢复期的治疗转到了对其急性期的治疗研究;针刺治疗脑缺血再灌注损伤是多途径、多因素综合作用的结果。针刺对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究涉及面较广,从对大鼠神经功能行为缺损的干预、脑组织的病理形态学的改变、脑功能代谢和脑微循环的改善到缺血性神经元凋亡信号转导的影响等方面都有所及。对针刺机理的研究已经不是仅限于器官和系统水平的整体分析,对针刺效应的研究已经在微观水平层面上逐渐开展。虽然针灸的脑保护作用机制还未十分明确,但很可能是通过激发机体的潜能,启动包括内源性抗缺血损伤的能力在内的多种调控机制,共同发挥抗损伤的脑保护作用。这种脑保护作用也可能促进了内源性神经干细胞参与病损的修复。本研究利用线拴法闭塞大鼠大脑中动脉造成局灶性脑缺血再灌注模型和在体外培养海马神经元模拟脑缺血再灌注损伤模型,进行了下列主要研究工作:① 从脑损伤后起关键作用的线粒体改变入手,分别观察线粒体膜电势变化、细胞内钙变化,以及与其密切相关的能说明体内自由基产生和清除状况的脑组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)动态变化。② 从与抗脑损伤有相应关系的神经再生营养角度,观察局灶性脑缺血再灌注损伤后神经生长相关肽(GAP-43)表达和血清转化生长因子(TGF-β)含量变化和二者的相关关系。③ 电<WP=4>中文摘要 - 2 -针曲池、足叁里、百会穴对脑组织中 MDA、GSH 动态变化的影响。电针对海马部位 GAP-43表达和血清 TGF-β含量变化的影响。④ 将电针曲池、足叁里、百会穴的正常大鼠和局灶性脑缺血再灌注模型大鼠的血清,加入到海马神经元模拟脑缺血再灌注损伤模型的培养液中,观察针刺血清对线粒体膜电势及细胞内钙的变化的影响。 本研究共分 4 部分进行: 1. 脑缺血再灌注损伤后行为学和病理形态学变化及针刺的影响:神经功能缺损是 MCAO大鼠重要表现体征。用单盲法在 MCAO 大鼠脑缺血再灌注后的 6h、24h、48h、72h 不用时间点内,对大鼠的相关行为表现进行评分。发现用大鼠神经功能评分方法结合 TTC 染色和 HE染色方法,可以作为大鼠局灶性脑缺血再灌注模型检测的方法之一。电针可以降低神经行为等级评分,说明电针能有效改变大鼠神经功能缺损。 2. 脑缺血再灌注损伤后 MDA 和 GSH 动态变化及针刺的影响:在脑缺血再灌注时自由基产生增加,自由基清除系统的功能低下导致脂质过氧化作用增强。自由基可以过度消耗抗氧化酶 GSH,并生成大量的脂质过氧化物代谢终产物丙二醛(MDA),介导神经元不可逆损伤。在 MCAO 大鼠脑缺血再灌注后的 6h、24h、48h、72h 不用时间点内,发现大鼠再灌注后,脑组织的 MDA 含量明显增加,24h 以后升高明显;GSH 的活性显着下降,在脑缺血再灌注6h 时最低。针刺有助于降低 MDA 水平和提高 GSH 活性,尤其对再灌注较长时相组作用明显。针刺可以降低 MDA 水平和提高 GSH 活性,因而说明抑制自由基生成、整合内源性抗氧化系统,促进自由基清除、抗脂质过氧化。 3. 脑缺血再灌注损伤后 GAP-43 和 TGF-β表达及针刺的影响:GAP-43 是神经元发育和可塑性的分子标志物。TGF-β可以作为脑损伤的标记。在用免疫组织化学染色和 ELISA 方法观察 MCAO 大鼠造模后 72h,损伤脑组织的生长相关蛋白 GAP-43、血清转移生长因子 TGF-?
宋颖[2]2007年在《电针对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠免疫炎症反应影响的实验研究》文中进行了进一步梳理研究目的脑血管病是临床常见病,其发病率高、预后较差,现已成为中老年人第一致残和前叁位致死原因,严重威胁着人类的健康,甚至生命。近年来,对其发病机制的研究已经有了较大的进展,尤其在缺血性脑血管病方面,大量的动物实验和临床观察资料表明,与脑缺血-再灌注有关的急性炎症反应促进了继发性脑损害的发展,缺血和再灌注早期产生的粘附分子和细胞因子构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础。因而通过各种途径抑制炎性因子的表达、减缓免疫炎症损伤的进程,进而减轻由于缺血-再灌注所带来到的脑组织后续损伤就成为我们目前研究的一大重点。研究方法本实验采用栓线法闭塞大鼠大脑中动脉,建立局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO模型),观察脑缺血再灌注6h、24h两个不同时间点缺血侧脑组织形态学改变和炎症反应情况,外周血和脑组织中IL-1β、ICAM-1含量的变化,以及电针“足叁里”、“百会”、“水沟”穴对以上各项指标的影响,以研究针刺疗法对于大鼠脑缺血-再灌注损伤不同时期点免疫紊乱的调节作用,并探讨针刺调节作用的相关作用和机制。(1)应用苏木精-伊红(HE)染色法观察缺血侧脑组织神经元缺血坏死情况,炎症免疫反应改变,炎性细胞黏附、浸润情况;(2)采用ELISA法检测外周血中IL-1β、sICAM-1的含量变化;(3)采用ELISA法检测缺血侧脑组织匀浆中IL-1β、ICAM-1的含量变化。研究结果(1)局灶性脑缺血再灌注早期(1-24h)缺血皮质出现神经元变性坏死和炎性细胞聚集、粘附及浸润,脑组织坏死范围和程度随着病程进展,炎症反应的继续而扩大加重。电针可降低炎性细胞粘附、浸润,减缓炎症免疫反应,减轻神经元坏死程度。(2)在脑缺血再灌注超早期(6h)外周循环血及脑组织中IL-1β、ICAM-1表达水平即明显增高,且二者之间存在着单向递进关系,即炎性细胞因子IL-1β的表达能够激活内皮细胞产生ICAM-1,缺血区中性粒细胞的浸润需要内皮细胞经多个炎性介质的介导和炎性细胞的相互作用才能完成。(3)电针可降低脑缺血不同再灌时间外周血及脑组织中IL-1β、ICAM-1的含量水平,尤其在缺血再灌后6h时这一作用更为显着。结论针刺治疗缺血-再灌注损伤大鼠可通过在一定范围内降低脑缺血后免疫炎症反应中炎性介质的表达,来抑制炎性细胞在缺血区的聚集和激活,减少炎性因子的释放,减缓炎症反应的进程;同时针刺通过减少炎性因子的表达抑制细胞毒性物质的释放和缺血后迟发性神经元的损伤,从而改善了局部微循环,起到了很好的脑保护作用。综上所述,电针对于脑缺血后免疫炎症反应的调节作用是多方向、多环节、多途径的,它不局限于仅仅对单个炎性介质的向上或向下调节,而是使参与炎症反应的多个细胞因子、黏附因子以及其他炎性介质的表达都趋向于正常值,使整个的神经-内分泌-免疫网络在新的水平达到平衡和统一,从而调整机体紊乱的免疫状态,减轻由于炎症反应所带来的损害。针刺调动机体的自身调节功能来减轻脑缺血-再灌注所带来的炎性损伤,是针刺治疗缺血性脑血管疾病的重要途径之一。
黄康柏[3]2011年在《脑缺血后STAT信号转导系统的调控及电针干预作用的研究》文中指出脑血管疾病是危害中老年人健康的一类常见病。随着人口的老龄化,脑血管疾病的发病率有逐年增高的趋势,我国属于世界上脑血管疾病高发国家之一。据统计：在我国,每年仍有160万-200万脑缺血卒中新发病例。其中80%有不同程度的功能障碍,50%-70%遗留有轻重不等的认知障碍,约有25%发展成痴呆。每年我国死于缺血性卒中的人数高达75万,占全部中风病死亡率3/4,该病已经成为人类的健康和生存质量的严重威胁。因此寻找有效的治疗手段并阐释其机理仍然是目前脑科学领域的研究热点。本文拟从针刺对脑缺血大鼠STAT信号转导系统的干预调控作用方面进行研究,以进一步揭示针刺治疗缺血性中风的作用机制,为临床治疗提供坚实的理论基础。本文分为文献研究、实验研究及小结叁大部分。1.文献研究通过对中风病因病机理论的古代及现代文献研究,中风的病因繁多,病机复杂,发病急骤,变化多端,表现各异。大量的实验研究也揭示了针灸治疗缺血性中风的可能作用机制。现代医学认为缺血性中风主要是由于脑局部循环障碍,引起以智力障碍、躯体运动功能障碍为主要表现的临床常见疾病。缺血区的脑组织可分为严重缺血的无灌流的中心坏死区和位于周边的低灌流的缺血半暗带区(ischemic penumbra, IP)。随着缺血时间的延长,坏死区逐渐扩大,而半暗带区不断缩小。细胞凋亡主要出现在缺血半暗带,凋亡可能决定了最终梗死体积。因此,尽快恢复缺血半暗带的功能,抵制凋亡和抢救受损细胞是治疗脑缺血的关键。细胞凋亡是受细胞内活性基因、酶和信号转导途径调控的一个“瀑布式”过程,是细胞主动死亡的过程。神经细胞是否发生凋亡是许多细胞活性因子共同作用的结果。其中,尤其以JAK (Janus kinase)/STAT (signal transducer and activator of transcription)家族的调控对此起着决定性的作用。目前研究发现：细胞凋亡可能与STAT1、STAT3激活相关,而细胞生存和修复可能与STAT5激活有关。针灸在治疗脑缺血性疾病有独特的疗效。在此基础上,研究针灸干预对脑缺血大鼠模型脑内信号转导系统的影响,探讨病灶区域内信号转导系统即STAT家族各成员及其mRNA表达水平及相关调制因子作用的机制,对进一步了解针灸治疗脑缺血,干预细胞凋亡的内在机制,有一定的参考价值。2.实验研究目的：观察针刺对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区不同时间段STAT信号转导系统反应性变化的影响,进一步揭示针刺治疗脑缺血疾病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠300只,随机分为5组：假手术组、模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组,各组又分为术后2h,1d,3d,1w及3w 5个时段组,12只/时段组。模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组采用电凝闭大脑中动脉建立局灶性脑缺血(MCAO)模型,假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭。电针组和AG490+电针组术后2h立即给予电针治疗,取百会(GV20)、大椎(GV14)穴,选用疏密波,5-10次/s,强度以大鼠安静耐受为度,电压约2-3V,留针30min,1次/d。其他3组不予针刺处理。观察以下指标：(1)参照Zea-Longa的5分制评分标准,对各组大鼠进行神经功能缺损评分。(2)采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法观测局灶性脑缺血模型大鼠在不同时段缺血侧大脑皮质神经细胞凋亡情况以及电针的干预作用。(3)采用免疫荧光、原位杂交及蛋白印迹等技术检测病灶侧皮质STATs (STAT1、STAT3、STAT5)表达的变化以及电针的干预作用。结果：(1)电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠神经运动功能的影响。不同时段的模型组与假手术组比较均有显着差异,大鼠造模后均出现不同程度的神经缺损体征,表明脑缺血模型造模成功。脑缺血1d时其余各组大鼠经神经功能缺损评分均处于较高水平。模型组的分值最高,分别与电针组、AG490组以及AG490+电针组比较,差异均有显着意义(P<0.01),而后叁组之间的差异没有统计学意义(均P>0.05)。模型3d组大鼠神经功能障碍有所减轻,部分大鼠向病灶对侧倾倒,与假手术组比较仍有显着差异(P<0.01),而电针组、AG490组和AG490+电针组大鼠神经缺损功能逐渐恢复,评分明显低于模型组(P<0.01),而叁组间的差异仍无统计学意义(均P>0.05)。缺血1w后,各组大鼠神经功能缺损状况有所改善,评分均较3d组降低,而且各组内此两时段之间、以及各自与假手术组之间比较的差异有统计学意义(均P<0.01)。3w后模型组与电针组神经缺损评分继续下降,但与1w组比较无明显差异,与假手术组比较均有显着的差异(P<0.01),模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组之间无显着差异(P>0.05)。(2)电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区神经细胞凋亡的影响。缺血2h后模型组、电针组、AG490组、AG490+电针组凋亡细胞即开始增多,与同时段假手术组相比均有显着的差异(均P<0.01),而各组之间无明显差异(均P>0.05)。缺血1d后各组均继续升高,其中以模型组的水平最高,电针组、AG490组和AG490+电针组的明显低于模型组(均P<0.01),而叁组之间的差异均不明显(均P>0.05)。各组在缺血3d后开始下降,而电针组、AG490组与AG490+电针组均远低于同时段的模型组(均P<0.01),叁组均处于较低的水平,组间差异不明显(均P>0.05)。到了缺血后3w各组已接近正常水平,各组间差异不明显(均P>0.05)。(3)电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区STATs表达的影响。①电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区STAT1表达的影响。各时段的假手术组均只有少量STAT1表达。缺血2h后模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组STAT1的含量即开始升高,与同时段假手术组相比均有显着的差异(均P<0.01),而各组之间无明显差异(均P>0.05)。缺血1d后各组STAT1的表达均继续升高,其中以模型组与AG49组的STAT1表达水平较高,电针组和AG490+电针组的STAT1表达明显低于上述两组,之间的差异均有统计学意义(均P<0.01)。各组在缺血3d后STAT1表达水平开始下降,而电针组与AG490+电针组均低于同时段的模型组和AG490组(均P<0.01)。在缺血1w后各干预组仍可检测到STAT1的表达,到了缺血后3w各组STAT1蛋白已接近正常水平,组间差异不明显(均P>0.05)。②电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区p-STAT3表达的影响。各时段的假手术组均只有极少数量p-STAT3表达。缺血2h后模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组p-STAT3表达水平即开始升高,与同时段假手术组相比均有显着的差异(均P<0.01),其中又以模型组与电针组升高明显,均明显高于同时段的AG490组、AG490+电针组(均至P<0.01)。而模型组与电针组之间以及AG490组与AG490+电针组之间的差异则不明显(均P>0.05)。缺血1d后各组均升高达到峰值,模型组最为显着,电针组次之,AG490组及AG490+电针组即使达到组内峰值,也处于较低的水平。各组在缺血3d后p-STAT3表达水平开始下降,电针组、AG490组及AG490+电针组均明显低于模型组(均P<0.01),且叁组之间的差异不明显(均P>0.05),持续下降至缺血1w后,各组p-STAT3含量已接近假手术组水平,组间的差异不明显(均P>0.05)。到了缺血后3w各组p-STAT3含量已恢复正常水平,组间差异不明显(均P>0.05)。③电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区p-STAT5表达的影响。在实验各时段假手术组只检测到少数量的p-STAT5蛋白表达。缺血后2h模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组即见有大量p-STAT5的表达,其中模型组和电针组处于较高的表达水平,AG490组及AG490+电针组的表达稍低,但模型组和电针组之间,以及AG490组及AG490+电针组之间均无明显差异(均P>0.05),且与同时段假手术组相比均有显着的差异(均P<0.01)。缺血1d后各干预组p-STAT5蛋白的表达情况与缺血2h基本相同,而缺血3d后各干预组的p-STAT5水平开始下降,其中电针组的水平较高,模型组次之,AG490组及AG490+电针组的表达水平低于以上两组(均P<0.01),到了缺血后3w各组p-STAT5表达已接近正常水平,组间差异不明显(均P>0.05)。3结论：综上所述：电针可以提高脑缺血模型大鼠神经功能缺损评分,其对缺血性脑损伤的功能改善内在机制可能与电针对脑缺血病灶区STAT系统调控作用有一定的关系,即抑制STAT1的含量及p-STAT3的表达,提高p-STAT5的表达水平。通过此途径所形成的自身保护、修复机制的启动,达到抑制病灶区半暗带细胞的凋亡,恢复受损的脑组织的细胞功能。初步验证了“针刺刺激--信号调节-自稳态调节启动是其脑缺血局部自我修复的关键作用机制之一”的科学假说,为针灸治疗缺血性脑血管疾病提供了一定的科学依据和理论指导。
刘荣[4]2012年在《JAKs激酶在电针抗缺血性脑损伤中作用的研究》文中进行了进一步梳理脑血管病(脑卒中)是危害人类健康的常见病,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,目前是世界第叁大死因。在中低收入国家,脑卒中死亡率尤为严重(占全球死亡的85.5%),因脑卒中所导致伤残而损失的调整寿命年(QALYs)是高收入国家的7倍,寻找有效的治疗手段并阐释其机理是目前脑科学领域的研究热点。研究证实,脑缺血损伤后缺血中心区的神经元死亡以坏死为主,而缺血周边半暗带区的神经元死亡与凋亡有关,如何挽救缺血半暗带区受损的神经细胞是一个值得关注的重要课题,因此研究引起细胞凋亡的信号转导机制可能为脑缺血提供新的前景。JAK-STAT系统是脑缺血后的炎性反应中重要的信号转导通路,也是决定病灶区细胞凋亡进程的重要因素。JAKs激酶作为JAK-STAT信号转导系统的重要组成部分,是许多细胞因子、生长因子的重要信号传感器。众所周知,针刺对脑缺血性疾病有着独特的疗效,具有多环节、多层次、多靶点的作用特点,而针刺对脑缺血后JAKs激酶作用机制研究尚未明确。因此,本文拟从JAKs激酶及其下游因子STATs与神经细胞凋亡间的关系及电针对其影响作用进行研究,以进一步揭示针刺治疗缺血性中风的作用机制,为临床治疗提供坚实的研究基础。本文分为文献研究、实验研究及小结叁大部分。1.文献研究综观历代医学典籍,不乏有对中风病的精辟论述。在中风的病因病机认识上,经历了外风论、内风论以及非风论等阶段。归纳起来不外乎风、火、痰、气、虚、瘀六端,此六端常相互影响,相互作用,合而为病。为探讨古代针灸文献中针灸治疗中风病的选穴规律,本文选取晋代至清代具代表性的12部医着文献,通过确立中风检索词、建立数据库、频数分析及支持度对比的方法,总结出中风病总体腧穴运用频次,半身不遂、口眼歪斜、语言不利叁大症状腧穴运用频次及经络腧穴相关性。现代文献研究方面,本文就缺血性中风的病理生理学机制、针灸作用机理、JAKs激酶及JAK-STAT信号转导通路与脑缺血发病机制的研究进展进行了综述,认为脑缺血能引起JAKs激酶的异常活化,但该信号途径的异常活化与缺血导致的神经元存亡之间的具体关系尚不十分清楚。因此进一步探讨JAKs激酶及JAK-STAT信号转导途经在缺血性脑损伤中的调控机制及针刺干预作用,将为防治缺血性脑损伤提供有益的线索。2.实验研究目的：观察电针对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区不同时间段缺血侧皮质神经元病理形态学、神经元细胞凋亡、酪氨酸蛋白激酶JAKs及其下游因子STATs的影响,进一步揭示针刺治疗脑缺血疾病的可能作用机理。方法：SPF级雄性SD大鼠300只,按随机区组化法分为5组：假手术组、模型组、电针组、AG490组、电针+AG490组,各组又分为术后2h、1d、3d、7d、21d5个不同时段亚组。假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭；模型组采用电凝闭大脑中动脉建立局灶性脑缺血模型；电针组手术凝闭大脑中动脉,予电针治疗；AG490组侧脑室注射AG49020min后,手术凝闭大脑中动脉；电针+AG490组侧脑室注射AG49020min后,手术凝闭大脑中动脉,续予电针治疗。观察指标如下：(1)各组大鼠神经功能缺损评分、HE染色及透射电镜观察局灶性脑缺血大鼠大脑皮质缺血灶周围区病理形态学改变。(2)TUNEL细胞凋亡染色法观察不同时段各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区神经元细胞凋亡情况。(3)采用免疫荧光染色法、Western Blot、原位杂交法检测各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK1磷酸化蛋白及mRNA表达变化。(4)采用免疫荧光染色法、Western Blot、原位杂交法检测各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK2磷酸化蛋白及mRNA表达变化。(5)免疫荧光染色法和激光共聚焦显微镜观察各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK下游因子p-STAT3、p-STAT5表达情况。(6)运用双尾Pearson/Spearman相关检验分别进行2h、1d、3d、7d及21d五个时间段脑缺血模型组p-JAK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5平均荧光强度值与神经细胞凋亡相关分析。结果：(1)缺血早期大鼠即出现神经功能缺损,神经功能缺损峰值出现在脑缺血后1d,随着缺血时间的延长,其神经行为学评分明显降低,以21d下降最为明显。除21d组,各时段干预组评分与同时段模型组相比,神经功能缺损评分具有所减少(P<0.05)。结合HE染色、电镜观察,其病理形态学改变与神经功能缺损的发展趋势基本一致,说明了电凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血大鼠模型的成功性,同时也说明电针治疗、AG490干预对脑缺血大鼠神经缺损体征具有明显改善作用,对脑缺血后大脑皮质神经元的恢复有一定促进作用。(2) TUNEL细胞凋亡检测结果显示：大鼠脑缺血2h后,在缺血侧大脑皮质可见较多的凋亡细胞,脑缺血1d后凋亡细胞的表达达到峰值,脑缺血3d细胞凋亡阳性反应物仍处较高的表达水平。随着缺血时间的延长,凋亡细胞数目逐渐下降,以脑缺血后21d减少最为明显。电针治疗方面,缺血后各时间段其细胞凋亡表达水平均低于模型组,以1d、3d、7d时间相点比尤为明显(P<0.01)。AG490组大鼠缺血侧脑组织细胞凋亡的变化趋势及其抗凋亡作用与电针组基本一致。电针治疗与AG490干预的协同作用方面,在脑缺血的超早期(2h),两者的联合应用即可较好地抑制细胞凋亡(P<0.05),但是在缺血后1d、3d、7d时间段,电针+AG490与单纯电针治疗或AG490干预相比差异不明显(P>0.05)。(3)采用免疫荧光染色法、western blot、原位杂交技术研究电针对局灶性脑缺血大鼠不同时间段p-JAK2蛋白及mRNA表达的影响。假手术组各相点的只检测到少量p-JAKl表达,脑缺血后2h大鼠缺血侧皮质即可检测到相当数量的JAK1磷酸化表达,缺血后1d达到高峰,模型3d组较前有所下降,随着缺血时间的延长,模型7d组p-JAK1的表达持续下降,直至缺血后21d尚有少量表达。电针组在1d、3d时间段JAK1磷酸化水平明显高于相应相点模型组的表达含量(P<0.01)。(4)假手术组大鼠的皮质中p-JAK2的表达量极少,说明正常生理状态下脑组织中JAK2是以非磷酸化形式存在。模型组2h大鼠缺血侧大脑皮质可检测到少量p-JAK2表达,脑缺血后1d到达峰值,M3d组开始下降,缺血后21d仍可检测到p-JAK2的少量表达。除缺血后2h、21d时间段,电针组JAK2磷酸化水平均少于同时间段模型组,1d、3d组尤为明显(P<0.01)。AG490组对JAK2磷酸化干预作用比电针组更明显,这种优势主要体现在脑缺血神经功能缺损的高峰期,即脑缺血后1d,A1d组与Zld组差异有显着性意义(P<0.05)。电针治疗与AG490干预协同作用方面,脑缺血后2h,两者的联合应用即可较好地抑制JAK2的磷酸化水平(P<0.05),此外,E+A1d与Eld、E+A3d与E3d相比较均有统计学意义(P<0.05),说明二者的共同作用在减少p-JAK2超量表达方面比单纯电针干预更有优势。(5)采用免疫荧光染色法观察电针对局灶性脑缺血大鼠不同时间段p-STAT3、 P-STAT5蛋白表达的影响。结果显示：①脑缺血后1d组的P-STAT3含量升高到达峰值,3d组开始下降,缺血后21d表达量明显减少。P-STAT3免疫阳性细胞的表达与脑缺血后p-JAK2、凋亡细胞的变化规律在时空分布及动态变化上呈一致性,都是在缺血后1d显着升高达到峰值,而其后又随着时间的推移逐渐下降。与模型组相比,脑缺血后1d、3d,电针治疗可明显减少STAT3的磷酸化表达水平。②缺血后2h,模型组即可检测到大量P-STAT5免疫荧光阳性细胞的表达,缺血后1d达到最高值,而缺血后3d,模型组P-STAT5水平开始下降,直到缺血后7d,21d, p-STAT5含量明显降低。在脑缺血1d,即P-STAT5表达的峰值期,电针治疗可促进STAT5的磷酸化；到缺血3d时,电针则明显提高P-STAT5的表达水平(P<0.01)；至脑缺血7d、21d时,电针组与模型组相比,差异虽无统计学意义,但在数据上具有一定优势。(6)脑缺血后JAK/STAT信号转导通路与神经细胞凋亡相关性分析：JAK1、JAK2、STAT3磷酸化表达与神经元细胞凋亡在脑缺血高峰期(即缺血后1d、3d时间段)密切相关,而在脑缺血慢性期关联性不甚明显。此外,p-JAK1蛋白表达与TUNEL细胞凋亡呈负相关性,P-JAK2、 p-STAT3蛋白表达与TUNEL细胞凋亡呈正相关性,P-STAT5蛋白表达与TUNEL细胞凋亡相关性不明显。结论：(1)缺血性脑损伤后,大鼠神经功能缺损、病理形态变化及神经细胞凋亡情况有向好的方向发展趋势,说明脑损伤后具有自我可塑性的调节机能。而电针可以改善受损的神经功能障碍,促进神经元的修复,抑制脑缺血后的神经元细胞凋亡。(2)电针治疗的介入能显着提高脑缺血早期缺血侧皮质JAK1的活性,激发机体自我保护机制,减轻脑缺血损伤,并且能促使这种保护性的效应维持一段较长的时间,参与受损组织的修复。(3)JAK2及其下游因子STAT3磷酸化的超量表达,JAK2-STAT3通路的异常激活与诱导细胞凋亡有关。电针治疗缺血性脑血管疾病的机制可能是通过针刺信号激发躯体神经系统的有关反应来启动相关信号转导通路来调节,即电针通过抑制JAK2-STAT3的异常活化,部分阻断或降低了炎性细胞因子的细胞内信号转导,以减少细胞凋亡的发生。(4)予JAK2阻滞剂AG490干预后,可明显抑制JAK2磷酸化表达和神经元细胞凋亡,且其与电针的协同作用更为明显,提示脑缺血后AG490对缺血灶大脑皮质神经元修复作用可通过作用于JAK/STAT信号转导系统而实现的。(5)电针能提高脑缺血缺血侧皮质STAT5磷酸化表达,作用机理可能是通过激活STAT5所诱导的相关细胞因子通路,以减轻脑缺血的损伤,提高修复受损神经元的能力。(6)结合本研究的实验结果,我们认为针刺启动JAK/STAT信号转导通路,促进神经自稳态调节是其治疗缺血性脑损伤的关键作用机制。
王薇钧[5]2007年在《电针对脑缺血再灌注损伤大鼠痛阈、IL-1β、eNOS、nNOS、NGF影响的实验研究》文中提出脑血管疾病以其高发病率、高死亡率、高致残率严重危害着人类的健康与生命,随着社会发展和经济条件改善,人们的生活节奏和饮食习惯等发生了重要变化,导致本病的发病率增加,影响了人们的生活质量,给家庭和社会造成巨大的负担。针刺治疗脑血管疾病有较理想的疗效,被临床广泛应用。针刺能够改善脑缺血再灌注损伤动物模型的多项指针,调整机体状态,发挥脑保护作用,促进功能改善。本实验观察了脑缺血再灌注损伤前后大鼠痛阈的改变、脑损伤区病理形态、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经性一氧化氮合酶(nNOS)、神经生长因子(NGF)及外周血白介素-1β(IL-1β)的变化及针刺的影响,从多个角度验证了针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用。目的:通过观察局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的病理变化,损伤前后痛阈的改变,循环血中IL-1β含量的变化;脑组织NGF、eNOS、nNOS的表达情况及电针“曲池”、“后叁里”穴,对以上各指标的影响,研究针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用,并探讨针刺作用的机制,为进一步探索针灸治疗缺血性中风的作用机理提供新的思路和依据。方法:(1)栓线法闭塞大鼠大脑中动脉造成局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO模型);(2)电针“曲池”、“后叁里”穴作为治疗手段;(3)采用冷刺激的方法观察大鼠痛阈的变化;(4)苏木精-伊红(HE)染色法观察缺血侧脑组织病理形态的改变;(5)放射免疫分析法检测血清中IL-1β的含量的变化;(6)免疫组化的方法观察大鼠脑组织缺血损伤区NGF、eNOS、nNOS表达的变化。结果:(1)局灶性脑缺血再灌注损伤早期缺血皮质出现神经元变性坏死,脑损伤和程度随时间进展而加重,电针可以减轻缺血区的损伤程度;(2)脑缺血再灌注损伤大鼠的痛阈降低,但随时间的变化痛阈改变不大,针刺可以提高大鼠脑损伤后的痛阈;(3)脑缺血再灌注损伤后外周循环血IL-1表达水平明显增高,电针可降低外周血中IL-1β含量;(4)脑缺血再灌注损伤大鼠脑损伤区NGF表达上调,针刺可以增强脑损伤区NGF的表达,并且使NGF保持在较高水平;(5)脑缺血再灌注损伤后,NOS的两种不同亚型神经型一氧化氮和酶(nNOS)、内皮型一氧化氮和酶(eNOS)均有表达,针刺可以使nNOS表达减弱,eNOS表达增强。结论:(1)局灶性脑缺血再灌注早期缺血区皮质可见神经元变形坏死等病理征象,针刺能够减轻缺血区损伤程度,发挥脑保护作用;(2)脑缺血再灌注损伤前后,大鼠痛阈发生改变,电针可以增强脑损伤大鼠对痛刺激的耐受程度;(3)脑缺血再灌注损伤大鼠循环血中IL-1β在缺血6h即明显增高,12h时达到高峰,IL-1β通过多种途径介导脑缺血再灌注损伤,电针可以降低IL-1β外周血中的含量,降低脑损伤程度;(4)脑损伤区可见神经型一氧化氮合酶(nNOS)阳性细胞存在,随着时间的延长逐渐增多,nNOS是神经毒作用的重要物质,针刺可以明显降低nNOS的表达,使其表达量呈下降趋势;(5)脑损伤区内皮型一氧化氮合酶(eNOS),eNOS一方面发挥脑保护作用,而且可以促进损伤区血管的修复和再生,模型组eNOS表达逐渐减少,而针刺可以使它表达上调;(6)脑损伤区可见神经生长因子(NGF)阳性细胞,模型组表达呈下降趋势,针刺可以增强NGF表达,使其维持在较高水平,从而促进脑保护和修复作用。
许能贵[6]2001年在《针刺对脑缺血后神经元损伤保护作用的研究》文中研究指明缺血性脑血管疾病，中医学将其归属为“中风”范畴，以其发病、死亡、致残率高而严重危害着人类健康，对该病的防治是重要的医学及社会课题。针灸疗法因其简、便、验、廉在治疗缺血性中风的疾病中占有一定的优势，且疗效也早已被国内外同行及患者首肯。为了更系统更全面地探讨针灸治疗缺血性中风的作用机制，本文从以下几个方面进行了研究。一．文献研究 推本溯源，从我国第一部中医学系统经典着作《黄帝内经》开始，直至唐宋元明清时期，对古文献中有关中风的病名、病因病机及针灸治疗等方面进行了探讨。并就近几年来针刺治疗缺血性中风的临床研究概况和现代医学对缺血性脑损伤的病理、生理学基础及针刺干预作用的研究进展作一系统综述。为进一步研究针刺治疗缺血性中风奠定了理论基础。二．实验研究 本研究选择凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血为模型，针对缺血性脑损伤的病理生理机制，采用电生理学、形态学、生物化学、细胞化学、放射免疫学等方法，系统全面地研究针刺督脉经穴对脑缺血后继发神经元的损伤的保护作用，其结果如下：1．致大鼠局灶性脑缺血10min、60min和120min后，缺血区局 部脑血流量（rCBF）迅速下降，电针具有改善缺血区脑组织局 部血流量的作用，阻止脑缺血后血流量下降的效应。2．脑缺血后脑内产生大量的自由基，电针可抑制缺血区自由基的 产生，提高缺血区脑组织SOD活性，降低MDA含量，从而 阻止脂质过氧化反应对缺血神经元的损伤。针刺对脑缺血后神经元损伤保护作用的研究 中文摘要3．脑缺血后缺血区脑组织中的NO、NOS及ET－l水平呈增高趋 势，电针可逆转这一趋势，从而改善脑血流量，有利于保护缺 血神经元的进一步损伤。4．脑缺血后神经细胞的机能活动明显受到抑制，电针可显着改善 脑缺血后自发脑电（EEG）和体感诱发电位（SEP）的变化， 从电生理学角度证明电针具有保护缺血性脑神经元的机能活 动。5．脑缺血后兴奋性氨基酸（EAA）过度释放，导致缺血区谷氨酸 （GIS）和天门冬氨酸（ASp）积蓄增多。电针可降低缺血区 脑组织中m 和ASp的含量，从而有效抑制“兴奋毒性”作用， 保护缺血性脑损伤。6．脑缺血后脑内单胺类神经递质代谢紊乱，缺血区脑组织内多巴 胺（DA）、5－羟色胺（5－HT）和去甲肾上腺素（NE）含量明显 降低，电针可纠正这一现象，从而保护脑的缺血性损伤。7．胞内旷”超载是脑缺血后神经细胞损伤和死亡的“最后共同通 路”，脑缺血后大量对”涌入胞内，导致胞内＊”超载，针刺 叮阻止C／”向胞内迁移，调节细胞钙稳态，保护缺血神经元免 受损伤。8．光镜和电镜研究证明，电针可有效保护缺血后神经元的形态结 构，井可减轻缺血区脑组织水肿，从而保护缺血性脑损伤。叁．结论 1．通过对古今文献的研究，我们认为针刺治疗缺血性中风具有 科学的理论依据和良好的临床疗效。2．通过实验研究，我们发现针刺可通过全面调整脑缺血后脑功 能的失衡状态，包括脑血流量、脑组织的水含量、脑细胞的机 能活动、脑神经生化的代谢紊乱、脑的形态结构和脑细胞的 Cay离子稳态等，从而保护脑缺血后继发神经元的损伤。3．由于胞内仇”超载是脑缺血后神经细胞损伤和死亡的“最后 共同通路”，结合本研究的实验结果，我们认为针刺调节钙稳 2针刺对脑缺血后神经元损伤保护作用的研究 中义摘要 态是针刺保护脑缺血后继发神经元损伤的最主要的作用机理。
玄勇[7]2003年在《针刺对脑缺血再灌注损伤后血液流变学和白细胞变化的影响》文中研究指明脑血管病（cerebrovascular disease，CVD）是由各种血管性病因引起的脑部疾病的总称。本病具有发病率高、死亡率高、致残率高及复发率高的特点，在我国的疾病死因调查中一直居于首位，严重危害人类的健康。缺血性脑血管病在脑血管疾病中占绝大部分，而局灶性脑缺血又是缺血性脑血管病的主要种类，后期恢复差。因此，研究缺血性脑血管病的病理生理机制，寻找适当的治疗措施一直是临床上的重要课题之一。针灸治疗脑血管病的疗效已经被世界卫生组织确认，为了发挥针灸特长，提高临床疗效，有必要进一步研究针灸治疗的机制。脑缺血再灌注损伤有多种病理机制，其中炎性反应过程起着很重要的作用。另外，血液流变学在此过程中也有所变化。因此，如果在缺血早期能降低再灌注时炎性反应的程度，抑制其反应过程，改善血液流变性，就可以加快脑血流的速度，减轻再灌注时的脑组织损伤，为后期的功能康复打下良好的基础。本实验对临床急性脑缺血2天的患者选取百会、中脘、足叁里为主穴进行针刺治疗，观察针刺0天、4天、7天后白细胞和血液流变学的变化，并对患者用Fugl-Meyer评测表进行评测，观察针刺组和非针刺组上述指标的变化。同时用线栓法阻闭大鼠大脑中动脉，造成局灶性脑缺血模型，观察再灌注0分钟，6小时，24小时外周血白细胞的变化和血液流变学的变化，以及针刺上述叁穴后各项指标的变化，为临床脑缺血疾病的治疗提供实验依据，以指导临床治疗，提高临床疗效。本实验结果表明：（1） 针刺可明显降低脑缺血再灌注后外周血白细胞的数量。临床研究显示以针刺后第4天的变化显着；而脑缺血大鼠以再灌注24小时后白细胞升高显着，针刺后显着降低。提示针刺对脑损伤的保护机制与针刺能降低脑缺血后外周血白细胞的数量有关。（2） 针刺可使脑缺血患者外周血粘度减低，红细胞压积降低，其中以针刺第4天后影响最大。大鼠以再灌注6小时血液粘度和红细胞压积升高显着，针刺6h后，红细胞压积降低显着，24h后，高切粘度降低显着。说明针刺能改善血液流动性，减轻脑缺血损伤。（3）针刺组与对照组比较，Fugl-Meyer评分也显着上升，说明针刺可以从整体上加快脑缺血患者的恢复进度。 综上所述，说明针刺对脑缺血再灌注损伤具有保护和治疗作用。同时也说明针刺的早期介入对于抑制白细胞上升，改善血液流变性和脑供血的程度，加快患者的整体恢复具有积极的意义。针刺的这种作用机制可能是通过对神经，体液和免疫系统的广泛调节而发挥作用的。由于针刺抑制了脑损伤后的病理变化，为脑缺血患者的后期功能康复提供了良好的前期条件，这对于提高偏瘫患者的生活质量具有重要意义。
黄伟[8]2010年在《超早期针刺对急性脑缺血大鼠能量代谢的影响及其机制研究》文中指出目的：脑血管病已成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病,急性缺血性脑血管疾病占脑血管疾病的43%-65%,病死率为15%-25%,其高发病率,高死亡率和高致残率给国家及患者带来了沉重的经济和社会负担。临床中许多缺血性脑血管病发病后超早期急救不及时,脑细胞在短期缺血、缺氧后形成了不可逆的损伤,最终造成死亡或恢复期遗留严重后遗症。在发病后最短时间内,使用安全有效、简便易行的急救措施对脑组织进行有效的保护,将对患者的预后产生积极影响。药物疗法仍是目前治疗缺血性脑血管病的有效手段之一,但药物疗法均有一定的毒、副作用,而针刺疗法已广泛应用脑血管病恢复期治疗,并且已被越来越普遍地应用于缺血性中风急性期治疗,在缺血后立即给予针刺治疗则能使局部脑血流显着增加,使缺血组织局部维持有效的血供,对抗缺血引起的损伤；缺血后再灌注期针刺增加局部脑血供,使脑梗死面积显着减小,神经功能得到有效的保护。因此,针刺超早期介入的意义值得重视。本研究在前期采用microPET观察到超早期针刺对脑缺血葡萄糖代谢改善的基础上,进一步探讨超早期针刺抗脑缺血损伤的作用机理,为临床针刺治疗缺血性中风提供一定的实验依据。方法：SPF级雌性SD大鼠140只,3月龄,体重200～250g,随机分为7组,正常组、穴位2h组、非穴位2h组、模型2h组、穴位24h组、非穴位24h组、模型24h组,每组各20只,其中10只用来灌注取脑,10只取新鲜脑组织。采用开颅法电凝大脑中动脉造模,制作右侧大鼠大脑中动脉急性脑缺血模型。穴位组取“百会”、“水沟”针刺,以120次／分左右进行捻转1min,共留针30min,期间每5min捻转行针1次,每次1min。非穴位组分别在百会、水沟左侧旁开约5mm处进针,避开穴位,手法同穴位针刺。穴位24h组及非穴位24h组在造模后24小时候再针刺1次。采用高效液相检测各组缺血脑组织ATP、ADP、AMP含量,比色法检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量,real-time PCR检测HIF-1αmRNA及EPOmRNA表达,采用免疫组化检测缺血脑组织GLUT1、GLUT3阳性细胞表达,对上述结果进行综合统计分析。结果：1.脑组织ATP、ADP含量在大鼠脑缺血后2h后即明显下降,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)；模型24h组ATP、ADP含量降低更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。穴位2h组大鼠ATP、ADP含量较模型2h组升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；与非穴位2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。非穴位2h组与模型2h组比较,无显着性差异(P>0.05)。穴位24h组ATP、ADP含量较模型24h组及非穴位24h组明显升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01),但非穴位24h组与模型24h组比较,无显着性差异(P>0.05)。脑组织AMP含量在大鼠脑缺血后2h后即明显升高,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)；模型24h组AMP含量升高更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。穴位2h组大鼠AMP含量较模型2h组降低,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01),与非穴位2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。非穴位2h组与模型2h组比较,无显着性差异(P>0.05)。穴位24h组AMP含量显着低于较模型24h组及非穴位24h组,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01),但非穴位24h组与模型24h组比较,无显着性差异(P>0.05)。2.脑组织TAN在大鼠脑缺血后2h后即明显下降,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)；模型24h组TAN降低更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。穴位2h组大鼠TAN较模型2h组升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01),与非穴位2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。非穴位2h组与模型2h组比较,无显着性差异(P>0.05)。穴位24h组TAN较模型24h组明显升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位24h组TAN较非穴位24h组升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.05)。但非穴位24h组与模型24h组比较,无显着性差异(P>0.05)。3.脑组织EC在大鼠脑缺血后2h后即明显下降,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)；模型24h组EC降低更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。穴位2h组大鼠EC较模型2h组升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；与非穴位2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。非穴位2h组与模型2h组比较,无显着性差异(P>0.05)。穴位24h组EC较模型24h组及非穴位24h组明显升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；但非穴位24h组与模型24h组比较,无显着性差异(P>0.05)。4.脑组织Na+-K+-ATP酶含量在大鼠脑缺血后2h后即明显下降,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)；模型24h组Na+-K+-ATP酶降低更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。穴位2h组及非穴位2h组大鼠Na+-K+-ATP酶含量较模型2h组升高,但穴位2h组上升更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01),与非穴位2h组比较,有显着性差异(P<0.05)。非穴位2h组与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.05)。穴位24h组Na+-K+-ATP酶含量较模型24h组及非穴位24h组明显升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；非穴位24h组与模型24h组比较,无显着性差异。5.脑组织Ca2+-ATP酶含量在大鼠脑缺血后2h后即明显下降,与正常组比较,有显着性差异(P<0.01)；模型24h组降低更显着,与模型2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。穴位2h组大鼠Ca2+-ATP酶含量较模型2h组升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01),与非穴位2h组比较,有显着性差异(P<0.01)。非穴位2h组与模型2h组比较,无显着性差异(P>0.05)。穴位24h组Ca2+-ATP酶含量较模型24h组及非穴位24h组明显升高,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；非穴位24h组与模型24h组比较,无显着性差异(P>0.05)。6.各组大鼠缺血侧皮质区域GLUT1免疫阳性物MOD值明显高于正常组(P<0.05～0.01)。穴位2h组较模型2h组比较,阳性表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.05)；穴位2h组GLUT1阳性表达较非穴位2h组明显增加(P<0.05),而非穴位2h组与模型2h组比较无显着性差异。模型24h组与模型2h组比较,阳性表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位24h组阳性表达要明显多于模型24h组和非穴位24h,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)。上述结果表明,在缺血后2h～24h之间,GLUT1阳性表达增加；穴位针刺可以明显增强大脑皮质GLUT1阳性表达,而非穴位组表达略有增加,但无显着性差异(P>0.05)。7.各组大鼠缺血侧皮质区域GLUT3免疫阳性物MOD值明显高于正常组(P<0.05)。穴位2h组较模型2h组比较,阳性表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位2h组GLUT3阳性表达较非穴位2h组明显增加(P<0.05)；非穴位2h组与模型2h组比较无显着性差异(P>0.05)。模型24h组与模型2h组比较,阳性表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位24h组阳性表达要明显多于模型组和非穴位24h,经统计学处理,有显着性差异(P<0.05)。上述结果表明,在缺血后2h～24h之间,GLUT3阳性表达增加；穴位针刺可以明显增强大脑皮质GLUT3阳性表达,而非穴位组表达略有增加,但无统计学意义。8.各组大鼠缺血侧皮质HIF-1αmRNA表达明显高于正常组(P<0.01)。穴位2h组较模型2h组比较,基因表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位2h组基因表达较非穴位2h组明显增加(P<0.05)；非穴位2h组与模型2h组比较无显着性差异(P>0.05)。模型24h组与模型2h组比较,基因表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01),穴位24h组基因表达要明显多于模型组和非穴位24h,经统计学处理,有显着性差异(P<0.05)。上述结果表明,在缺血后2h～24h之间,HIF-1αmRNA表达增加；穴位针刺可以明显增强大脑皮质HIF-1αmRNA表达,而非穴位组表达略有增加,但无统计学意义(P>0.05)。9.各组大鼠缺血侧皮质EPOmRNA表达明显高于正常组(P<0.01)。穴位2h组较模型2h组比较,基因表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位2h组基因表达较非穴位2h组明显增加(P<0.05)；非穴位2h组与模型2h组比较无显着性差异(P>0.05)。模型24h组与模型2h组比较,基因表达明显增加,经统计学处理,有显着性差异(P<0.01)；穴位24h组基因表达要明显多于模型组和非穴位24h,经统计学处理,有显着性差异(P<0.05)。上述结果表明,在缺血后2h～24h之间,EPOmRNA表达增加；穴位针刺组可以明显增强大脑皮质EPOmRNA表达,而非穴位组表达略有增加,但无统计学意义(P>0.05)。结论：1.急性脑缺血后大鼠脑组织ATP生产及利用均减少,TAN及EC均降低,表明脑缺血后能量代谢障碍,而穴位针刺可以显着改善脑缺血大鼠脑组织能量代谢,发挥抗脑缺血损伤的作用。2.穴位针刺可以通过改善缺血脑组织的能量代谢,从而恢复Na+-K+-ATP与Ca2+-ATP酶的活性,从而可能通过减少胞内Na+负荷,减轻Ca2+超载,维持了细胞内外Na+、Ca2+稳态,减轻细胞内水肿,影响突触兴奋、传导和递质释放,抑制兴奋性氨基酸等毒性物质的释放,达到脑保护作用。3.穴位针刺可以上调脑内GLUT1和GLUT3的蛋白表达,增加葡萄糖通过血脑屏障转运入脑,以提高葡萄糖脑转运效率,延续缺氧缺血情况下脑的能量供应,延缓能量耗竭,对抗缺氧缺血的正向反应,减轻缺血缺氧造成的脑损害。4.穴位针刺能诱导缺血区HIF-1αmRNA表达增加,从而增强EPOmRNA、GLUT1等靶基因的表达,发挥抗缺血损伤的作用。5.超早期针刺可通过对HIF-1α、GLUT1、GLUT3、EPO等的调节,有效的改善脑缺血后能量代谢,发挥抗脑缺血损伤的作用。6.穴位针刺对脑缺血大鼠能量代谢及影响脑能量代谢的相关指标的调节作用明显优于非穴位针刺。
任秀君[9]2007年在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中认为研究目的:高脂血症(hyperlipidemia,HLP)由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居叁大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“叁高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针叁阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针叁阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针叁阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法(ELISA)检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒(术后约1h)后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞(背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。)正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。(nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。)右侧大脑匀浆中NSE(41.70±3.47 ng/dL)及神经营养因子NGF(79.36±7.07 pg/ml)、BDNF(5.66±0.86μg/L)、bFGF(51.20±6.05 ng/L)含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区(背外侧伸展、侧脑室外侧壁)、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“叁阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。
侯雪民[10]2008年在《电针对脑缺血后模型大鼠突触可塑性干预作用的研究》文中指出脑血管病严重威胁着人类的健康和生命,而缺血性脑血管病约占各类中风的80%。高等动物脑内突触传递的可塑性是近30年来神经科学研究的热点,而关于其机理的研究,很多学者从不同角度进行了探讨,但是对于针刺调节突触的可塑性方面的研究非常缺乏。针刺作为一种外源性信号,是临床卓有成效的缺血性脑损伤康复手段,其作用机制是否与调节突触传递效能以调动机体的自我修复系统,从而促进脑可塑性的形成有关呢?本文从以下几个方面进行了研究。1.文献研究本部分就古代中医学关于中风的命名、病因病机以及针灸治疗中风的古代记载方面进行了论述,从而对中风的古代文献研究背景进行了深入的认识。近年来对于脑血管病的研究中发现卒中后恢复阶段,突触在结构和功能上可以进行自我修复和重建。因此本文就突触可塑性及其有关物质进行综述,为进一步研究针刺治疗脑缺血损伤机制奠定理论基础。2.实验研究本研究观察了脑缺血后不同时间段大鼠的学习记忆能力、突触超微结构的变化及突触素P38和GAP-43表达的动态变化,探讨针刺督脉经穴“百会”、“大椎”干预其变化的时效关系。2.1方法2.1.1选用健康雄性Wistar大鼠250只,随机分为假手术组(A)、缺血组(B)、缺血+电针组(C)、缺血+DL-AP5组(D)、缺+DL-AP5+电针组(E)五组,每组又分为1h、3h、6h、12h、2w五个时间段。动物模型复制沿用以往的电凝大脑中动脉法,采用热凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血模型。其中假手术组只作手术暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭。模型复制完成后,分别将D组和E组大鼠在脑立体定位仪上进行侧脑室注射NMDAR拮抗剂DL-AP5。对于C组和E组,取督脉经穴“百会(GV20)”、“大椎(GV14)”穴进行针刺,后接电针30min。2.1.2 Y迷宫测试成绩:对于C和E,先进行电针治疗,治疗后分3h、6h、12h、2w四个时间段进行Y迷宫测试,记录不同时间段各组大鼠的成绩。2.1_3突触超微结构:12h、2w后,随机取25组大鼠每组各3只左心室灌注取材。参数的观察采用JEM一1200EX透射电镜,底片放大1.5万倍印相,进行电镜观察缺血区皮层突触界面参数突触间隙宽度、PSD厚度和突触界面曲率的变化及电针对其影响。2.1.4突触素P38的免疫阳性表达:250只大鼠于术后1h、3h、6h、12h、2w每个时间段分别进行左心室灌注取材后,采用免疫组化方法检测缺血区周围皮层突触素P38的免疫阳性表达及电针的累加效应情况。2.1.5 GAP-43免疫阳性表达:250只大鼠于术后1h、3h、6h、12h、2w每个时间段分别进行左心室灌注取材后,采用免疫组化方法检测缺血区周围皮层GAP-43的免疫阳性表达及电针的累加效应情况。2.2结果2.2.1 Y迷宫测试成绩脑缺血后3h,各组大鼠学习记忆能力下降,分别与假手术组比较均有显着性意义(P＜0.01)。随着脑缺血时间延长至6h时,学习记忆功能反而较3h下降。脑缺血时间的延长至12h时,大鼠学习记忆能力有所提高。随着脑缺血时间继续延长至2w时,各组大鼠受到刺激后从非安全区跑至安全区所用时间明显减少,C组大鼠所用时间已接近A组,表明局灶性脑缺血大鼠已经趋向于康复。其中B组优于D组(P＜0.01),C组优于B组(P＜0.01),E组优于D组(P＜0.01)。2.2.2突触超微结构2.2.2.1突触间隙宽度和PSD厚度方面:B组12h、2w下降均较为明显,与A组比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但是均优于同期D组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01);与E组比较,12h差异无统计学意义(P＞0.05),2w差异则有显着性意义(P＜0.01)。C组明显优于同期B组,12h和2w均有显着性意义(P＜0.01);也优于D组和E组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但低于A组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01)。D组明显低于同期A组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01)。E组优于同期D组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但始终低于A组(P＜0.01)。2.2.2.2突触界面曲率方面:B组12h、2w均下降,与A组比较差异均有显着性或非常显着性意义(12h,P＜0.01;2w,P＜0.05);但是均优于同期D组,分别比较差异均有显着性或非常显着性意义(12h,P＜0.01;2w,P＜0.05);与E组比较,12h与2w差异均无统计学意义(P＞0.05)。C组明显优于同期B组,差异均有显着性或非常显着性意义(12h,P＜0.01;2w,P＜0.05);也优于D组(12h和2wP＜0.01),优于E组(12h,P＜0.01;2w,P＜0.05);但低于A组(12h和2wP＜0.01)。D组明显低于A组(12h和2wP＜0.01)。E组优于同期D组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但始终低于A组(P＜0.01)。2.2.3突触素P38和GAP-43的免疫阳性表达其中假手术组表达很少,C组表达最多。2.2.3.1大鼠脑缺血后1h,大鼠突触素P38和GAP-43的免疫阳性表达稍下降:2.2.3.1.1对于P38,B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显着性意义(P＜0.01):但是低于C组和E组,分别与此二组比较差异均有显着性意义(P＜0.01);C组平均每个高倍视野的阳性细胞数高于其他各组,分别比较差异均有极显着性意义(P＜0.001);D组与A组差异无统计学意义(P＞0.05);E组高于D组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01)。2.2.3.1.2对于GAP-43,B组高于A组、D组和E组,但是低于C组。B组分别与A组和C组及D组比较差异均有显着性意义(P＜0.01),但是与E组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组高于其他各组,分别比较差异均有显着性意义(P＜0.01);D组高于A组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01);E组高于D组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01)。2.2.3.2随脑缺血时间延长至3h时,大鼠P38和GAP-43免疫阳性细胞表达较1h增多:B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但是低于C组,两者比较差异也有显着性意义(P＜0.01);但与E组比较差异则无统计学意义(P＞0.05);C组高于其他各组,分别比较差异均有极显着性意义(P＜0.001);D组高于A组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01);E组高于D组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01)。2.2.3.3大鼠脑缺血后,随时间延长至6h时,大鼠突触素P38和GAP-43免疫阳性细胞的表达未见增加,反而降低。B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但是低于C组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01);但与E组比较则差异则无统计学意义(P＞0.05);C组平均每个高倍视野的阳性细胞数明显高于其他各组,分别比较差异均有极显着性意义(P＜0.001);D组高于A组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01);E组高于D组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01)。2.2.3.4大鼠脑缺血后,随时间的继续延长至12h时,大鼠突触素P38和GAP-43免疫阳性细胞的表达较6h明显增加。B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但是低于C组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01);但与E组比较差异则无统计学意义(P＞0.05);C组明显高于其他各组,分别比较差异均有极显着性意义(P＜0.001);D组高于A组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01);E组高于D组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01)。2.2.3.5大鼠脑缺血后,随时间再延长到2周时,大鼠突触素P38和GAP-43免疫阳性细胞的表达未见到继续再增加,反而降低至3h左右的水平。可见,P38和GAP-43的免疫阳性细胞表达并不是随着时间的延长一直增加,而是一直在变化着,但是各组的P38和GAP-43的免疫阳性细胞表达虽有降低,但是仍然高于A组,说明受到创伤的脑组织仍然不能恢复到正常水平。B组平均每个高倍视野表达的免疫阳性细胞数高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显着性意义(P＜0.01);但与E组比较差异则无统计学意义(P＞0.05);C组明显高于其他各组,分别比较差异均有极显着性意义(P＜0.001);D稍高于A组,两者比较差异仍然有显着性意义(P＜0.01);E组高于D组,两者比较差异有显着性意义(P＜0.01)。2.4结论2.4.1凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血动物模型,目前是动物实验研究中较为成功的模型之一,经过本实验研究证实这一造模方法可靠、可行。2.4.2大鼠脑缺血损伤后,学习记忆能力下降,可能与缺血后突触结构破坏、数量减少有关,电针可以改善缺血大鼠的学习记忆能力,可能与电针促进了突触的重建和突触联系有关。2.4.3大鼠脑缺血损伤后,其缺血区周围皮层突触界面结构参数发生了改变,表现为突触后致密物厚度下降,突触间隙宽度减小,突触界面曲率降低,导致其学习记忆能力下降,而电针能够提高缺血大鼠的学习记忆能力,可能与电针增加了突触后致密物厚度、增大了突触间隙宽度、升高了突触界面曲率有关。2.4.4大鼠脑缺血损伤后,其缺血区周围皮层中突触素P38和GAP-43的阳性表达增加,可能与脑缺血后突触结构破坏,突触前、后膜代偿,新的突触生成以建立新的突触联系有关。而电针可以提高缺血大鼠的缺血区周围皮层中突触素P38和GAP-43的阳性表达,促进突触重建,增强突触传递的效能,有利于缺血大鼠的自我恢复。2.4.5本实验研究结果表明,缺血+DL-AP5+电针组大鼠PSD厚度、突触间隙宽度及突触界面曲率均分别显着大于缺血+DL-AP5组,提示电针可在一定程度上逆转NMDAR拮抗剂DL-AP5所引起的PSD厚度、突触间隙宽度及突触界面曲率的降低,增强了突触的传递效能,从而促进脑功能的恢复。2.4.6由Y迷宫测试成绩、突触超微结构及突触素P38和GAP-43的阳性表达结果来看,突触存在可塑性,本实验研究结果表明,电针可提高缺血大鼠的学习记忆能力,促进突触重塑,增加P38和GAP-43的阳性表达,增强了突触的传递效能,从而促进缺血损伤的尽快恢复。2.4.7实验结果表明,脑缺血损伤后6h,突触间隙宽度、突触后致密物厚度和突触界面曲率相较于3h反而减小,突触素P38和GAP-43的阳性表达降低,而此时缺血大鼠的学习记忆能力也下降,说明学习记忆能力与突触的可塑性密切相关。综上所述,我们认为针刺促进了脑缺血后突触重建和突触联系,这可能是针刺治疗缺血性脑损伤的作用机制之一。
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