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【摘 要】目的 探析基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法。方法 选取来自11个产地的88份植物样本为研究对象，包括金银花真品、金银花伪品及两者混杂品，将其随机分为两组，每组44份。对照组采用实验鉴别，观察组采用双向位点特异性PCR技术辨别，对比分析鉴别效果。结果当退火温度为61℃时，真品金银花条带为468hp，伪品条带为324hp，正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带，两组在鉴别结果有明显差异（P＞0.05）；观察组的鉴别时间短于对照组（P＜0.05）。结论 双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品，在未破坏金银花样本组织结构及材质的情况下，可有效辨别金银花真伪，具有较强的优良性，更值得进一步推广和应用。
【关键词】双向位点特异性PCR；金银花；真伪鉴别
金银花又名忍冬，药科金银花属忍冬科忍冬属植物及同属植物干燥花蕾或带初开的花，外貌上形似于华南忍冬，具有清热解毒之功效。伪品金银花[1-2]主要包括苦糖果、金银木，且无正品金银花的药效，如被误当真品服用，将会延误治疗。因此，采用正确的方法对其真伪进行辨别尤为重要。本文选取来自11个产地的88份植物样本为研究对象，对双向位点特异性PCR鉴别金银花真伪的重要价值进行评价，具体如下。
1材料与方法
1.1材料
选取来自山东平邑、河南封丘、河北巨鹿、广西马山、湖南隆回及湖北、江西、广东、重庆、陕西、江西11个产地的88份植物样本为研究对象，所选样本主要包括忍冬32个，华南忍冬6个，灰毡毛忍冬8个，黄褐毛忍冬8个，水忍冬12个，金银忍冬6个，繁果忍冬7个，红腺忍冬9个。所有药材均经相关部门批准，符合药材选择标准[1]。同时，选取购自市场上经炮制的药材进行双向位点特异性PCR鉴别。
1.2仪器与试剂
1.2.1仪器
选用东胜龙二代ETC811新款PCR仪为检测仪器，温度为0-105℃，热盖温度30-110℃，显示精度为0.1℃，温度准确度性为±0.1℃@55℃，温度均一性为＜0.3℃@55℃，温度梯度为5℃/s，梯度跨度为1-42℃，输入电压为AC220V（±10%）50/60Hz。选用Eppendorf小型台式冷冻高速离心机5427R，温度范围为-11℃~40℃，离心计时为10s-10h，最大功率为550W，最大容量为48×1.5/2.0ml。选用Biorad伯乐凝胶成像系统，检测器为CCD，像素为4.65×4.65μm，像素密度为4096，工作湿度为＜70%，工作温度为10-28℃。
1.2.1试剂
SunShineBio琼脂糖（原产于西班牙，供应商：南京生兴生物技术有限公司）；Sigma-Aldric溴化乙啶（原产于美国，供应商：北京基尼亚生物技术有限公司）；Promega聚合酶（保定市凌业商贸有限公司）。
1.3方法
观察组：取干燥材料100mg，并提取入选材料的DNA，不同样品的DNA浓度约为10mg/L，利用引物（trnF、trnL，各0.2pmol）对PCR反应及DNA质量进行检测。在PCR扩增仪上进行反应，待反应结束后在反应体系中增加适量缓冲剂，待混合均匀后在EB染色的1%琼脂酸凝胶点上检测，并使用凝胶成像系统进行系统化的观察。
对照组：取该品粉末0.2g，加入5ml甲醇，并将其放置12小时后过滤溶液，使用照高效液相色谱法对金银花含量进行检测。
1.4统计学方法
本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计量资料用（ +s）进行表示，计数资料用%表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1SNP位点的筛选与引物
根据数据库中显示的忍冬属植物的叶绿体序列，并使用软件对比不同序列间的内在联系，对忍冬属植物的trnF-trnL序列进行分析，结果显示trnF-trnL序列的625位均为G，而其他物种均为A。以SNP为主要位点，双向位点特异性PCR引物的序列情况如表1所示。
2.2双向位点特异性PCR反应条件
在建立单侧位点特异性PCR的基础上设计另一侧的引物，并优化反应循环数目及内侧与外侧的引物浓度，确定Bi-PASA的反应条件。实验研究结果表明，对APRMS分型产生影响的相关因素较多，其中包括退火温度、Tap酶种类、用量等，且金银花的使用量相对较低。但由于Bi-PASA所使用巢式引物极易造成正常的PCR扩增过程受限，因此，将Bi-PASA内外侧的比例优化为3：1，此时，金银花Bi-PASA的结果最佳。
2.3金银花真伪
当退火温度为61℃时，真品金银花条带为468hp，伪品条带为324hp，正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带。
2.4 两种鉴别方法的鉴别时间比较
观察组的鉴别所用时间为（3.56±1.25）h，对照组的鉴别所用时间为（11.25±2.96）h，观察组明显优于对照组，两组组件有显著差异（P＜0.05）。
3讨论
双向位点特异性PCR检测技术仅通过单个单核苷酸多态性位点则可对两种基因类型进行鉴别和区分，具有操作简单、共显性等特点，尤其在药材真伪的鉴别中具有独到的应用优势。
本次研究结果显示，两组在鉴别结果上午明显差异（P＞0.05）；观察组的鉴别时间短于对照组（P＜0.05）。本结果与相关研究结果相符[3]，从结果中可以看出，双向位点特异性PCR检测技术在金银花真伪的鉴别中具有较高的临床应用价值。
综上所述，双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品，在未破坏金银花样本组织结构及材质的情况下，可有效辨别金银花真伪，具有较强的优良性，更值得进一步推广和应用。
参考文献：
[1]蒋超，侯静怡，黄璐琦，等.快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2014，39（19）：3668-3672.
[2]蒋超，黄璐琦，袁媛，等.金银花中几种分子的真伪鉴别方法比较及其研究进展[J].世界科学技术：中医药现代化，2014，16（8）：1831-1839.
[3]崔占虎，蒋超，黄璐琦，等.断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究[J].中国中药杂志，2013，38（16）：2563-2566.
论文作者:曾云生,曾燕,姚冬云
论文发表刊物:《航空军医》2016年第8期
论文发表时间:2016/6/21
标签：忍冬论文; 特异性论文; 伪品论文; 真伪论文; 位点论文; 双向论文; 引物论文; 《航空军医》2016年第8期论文;