郭庆广[1]2000年在《一类具有增长抑制和代谢过量的微生物连续培养模型的研究》文中研究指明本文主要研究了用微生物法将甘油转化成1，3—丙二醇变化过程的数学模型，全文共分为四章： 第一章是绪论，主要介绍微生物连续培养模型的意义。 第二章是预备知识，主要介绍本文用到的基本定义和定理。 第三章研究了微生物法生产1，3—丙二醇的二维常微分方程模型和时滞微分方程模型。对常微分方程模型，给出了正平衡点的存在性和解的有界性的充分条件，并得到了多态存在的参数区域，分析了临界情形平衡点的稳定性；对时滞微分方程模型，得到了系统存在Hopf分支的充分条件，给出了计算分支值的公式以及分支值和周期解的周期随参数变化的规律。 第四章，首先研究了三维常微分方程模型，得到了在具有增长抑制和代谢过量的条件下模型的多态性，但是此模型不存在Hopf分支。在此基础上进一步研究了时滞微分方程模型，得到了模型的Hopf分支，讨论了时滞对系统产生Hopf分支的影响，利用时滞微分方程数值解法绘制了解随时间变化的图形和在平面上的相图。 本文的主要工作是应用微分方程的定性理论和分支理论，对微生物法生产1，3—丙二醇过程的振荡机理进行了研究，得出时滞可以使系统产生振荡，给出了系统存在Hopf分支的参数区域，为这一过程的研究提供了理论依据，并可用于指导实验和生产。
宋炳辉[2]2002年在《具有时滞的微生物连续培养模型的研究及其应用》文中认为本文主要建立了具有时滞的微生物连续培养模型，并进行了分析和计算。 第一章 绪论，主要介绍了微生物连续培养的意义和本文将要研究的问题。 第二章 相关知识简介，主要介绍本文将要用到的数学基本定义和定理以及生物化工的基础知识。 第三章 数学模型的建立，介绍肺炎杆菌将甘油发酵生产1，3—丙二醇的实验过程和在实验的基础上建立微生物反应动力学模型的过程，并进一步给出了几个酶催化反应和基因调控动力学模型。 第四章 三维时滞微分方程模型分析。研究了以单底物、单产物为基础的三维时滞微分方程模型。首先介绍了已有的离散时滞模型及其计算结果。在此基础上，本文引入了连续时滞，给出了系统存在Hopf分叉的条件，得出系统的振荡图像及其相图，并对过渡态进行了定性的描述。 第五章 研究运用系统中出现的多稳态和振荡现象设计生化反应器。主要思路是设计两个反应器串联，使第一个反应器处于自激振荡状态，迫使第二个反应器产生强迫振荡。为此对第一个反应器建立了具有离散时滞的三维微分方程模型，对第二个反应器建立了无时滞的三维常微分方程模型，两个反应器串联得到了六个方程所构成的方程组，分析结果表明两个反应器串联降低了残余底物浓度，提高了产物浓度、产率和生产强度；考虑到反应中还有另两种主要副产物，本文又对第一个反应器建立了具有连续时滞的五维微分方程模型，对第二个反应器建立五维常微分方程模型，得到十个方程所构成的方程组，并进行了研究，得出系统存在两个多态区域和多态存在的参数范围。通过计算，选取了系统处于较优状态的操作参数的范围，并判定出系统存在Hopf分叉的条件，绘制了两个反应器串联时的振荡图形及其相图。 本文的主要工作是在做生化实验的基础上建立数学模型，并运用微分方程的分支理论，在系统中引入时滞以研究克雷伯氏菌将甘油发酵生产1，3—丙二醇的实验过程中的振荡机理。对系统进行Hopf分支判定，绘出了系统的振荡图形及其相图，并对过渡态做了定性的描述。在此基础上，运用实验过程中出现的多稳态和振荡现象设计生化反应器，建立了两个反应器串联模型，达到了降低底物残余浓度，提高产物浓度、产率和生产强度的目的。本文的研究内容为实际生产提供了理论依据，并可用于指导实验和生产。
马永峰[3]2004年在《微生物连续培养过程中非线性行为的分析与模拟》文中提出非线性行为是自然界普遍存在的现象,也是当今自然科学基础理论研究的重大课题之一。由于细胞内部结构、反应类型和时序的复杂性,细胞培养过程存在着复杂的非线性行为。本文以微生物连续培养生产1,3-丙二醇的模型(简记为MMCC)为研究对象,详细讨论了不同时滞对具有底物、产物抑制和代谢过量特征的微生物连续培养模型的非线性行为的影响。虽然已有的MMCC能定性地描述微生物发酵法生产1,3-丙二醇实验中出现的多态现象,但不能描述实验中出现的振荡现象。本文在已有的非线性模型中引入时滞,不仅能够解释多态问题,而且能够描述振荡行为,并阐述了混沌现象。主要研究成果有:1、 在第二章利用分叉理论结合数值计算给出了MMCC的静态分叉点曲线和Hopf分叉曲线,求出了多态存在的区域,并论述了Hopf分叉的方向和分叉出的周期解的稳定性。2、 第三章在MMCC中引入离散时滞,论述了时滞对MMCC的正平衡点的局部稳定性的影响。本章给出了存在Hopf分叉的操作参数区域,利用规范型理论和中心流形定理判断了周期解产生的方向和分叉周期解的稳定性;延拓分叉周期解,表明时滞超过临界值时,其周期解失去稳定性,出现了倍周期分叉。数值计算表明随着时滞的增加,模型将出现混沌。3、 第四章在MMCC中引入连续时滞,论述了平均时滞对MMCC正平衡点局部稳定性的影响。比较了离散时滞和连续时滞对微生物连续发酵模型的周期解的周期和位置的影响。4、 第五章在具有三种产物的MMCC中引入“动态比增长速率”、“动态比消耗速率”和“动态比生成速率”,建立了中立性时滞微分方程组。为使修改后的模型能描述实验中的数据,建立了参数辨识问题。利用Hooke-Jeeves方法拟合模型中的参数,定量地描述了实验中出现的振荡现象。
连涵生[4]2008年在《带有时滞的微生物连续培养模型的分析与模拟》文中研究表明本文以甘油为底物、采用微生物歧化方法生产1,3-丙二醇的连续发酵为背景,根据发酵过程中的振荡现象与生物意义,在模型中分别引入了离散时滞和连续时滞,建立了非线性时滞微分动力系统,运用Hopf分叉理论讨论了模型的振荡行为。本课题受到国家“十五”科技攻关计划项目“发酵工程生产1,3-丙二醇”(编号为2001BA708B01-04)和国家高技术研究发展计划(863计划)“生物柴油与1,3-丙二醇的联产工艺”(编号为2007AA02Z208)的资助。此项研究为实现1,3-丙二醇的产业化生产提供理论指导,因此,该项目研究具有重要的理论意义与应用价值。本论文的主要工作如下:1.以往的文献大多是研究单底物单产物的三维理想模型,而实际连续发酵过程中,产物不止一个。本文考虑产物乙酸和乙醇对微生物生长的抑制作用,讨论五维系统的稳定性。根据生物意义,在系统中引入离散时滞,建立了五维非线性离散时滞动力系统,以时滞为参数,讨论了时滞对系统的正平衡点渐近稳定性的影响及Hopf分叉的存在性。并且在稀释速率恒定条件下,数值模拟了分叉值和周期随进料浓度变化的曲线,以及固定某一进料浓度,模拟了分叉的周期解与相图。最后讨论了模型的过渡行为。2.在上述五维模型中引入弱核连续时滞,以平均时滞的倒数为参数,讨论了平均时滞对系统正平衡点的局部稳定性的影响。运用Hopf分叉判据,给出了存在Hopf分叉的操作参数区域,运用MATLAB数值模拟了分叉的周期解及相图。最后讨论了模型的过渡行为。
孙亚琴[5]2010年在《甘油生物歧化过程酶催化和基因调控的非线性数学模拟与分析》文中认为受石油价格不断攀升的影响,生物基化学品的生产逐渐引起人们的重视。甘油生物转化生产1,3-丙二醇因为原料的可再生性和1,3-丙二醇(1,3-PD)的潜在用途而日益受到关注。本论文针对克雷伯氏杆菌转化甘油为1,3-丙二醇过程,建立了酶催化和基因调控非线性动力学方程,对甘油生物转化及其基因调控过程进行了模拟分析,主要研究内容如下：首先,建立了甘油生物歧化过程酶催化动力学方程,包括甘油代谢过程中关键酶——甘油脱水酶(GDHt)、1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)、甘油脱氢酶(GDH)、丙酮酸激酶(PK)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和丙酮酸脱氢酶(PDH)的酶催化动力学,3-羟基丙醛(3-HPA)对GDHt、PDOR和GDH的抑制动力学,甘油和产物的跨膜转运动力学。酶催化动力学能够很好地描述甘油连续发酵过程中底物的消耗和产物如1,3-PD,乙酸、乙醇、琥珀酸和甲酸的形成,对间歇培养过程适应期和对数生长期的描述也很合理；该动力学系统能够预测连续培养条件下胞内物质的浓度,如胞内残余甘油、3-HPA、1,3-PD、琥珀酸、甲酸和乙酸,且能预测连续发酵过程中出现的多稳态现象。分析结果表明,连续发酵培养条件下,二羟基丙酮、磷酸二羟基丙酮、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰CoA在胞内没有积累,全部进入下一级代谢；另外,过多的3-HPA积累和残余底物甘油对1,3-PD的生成是不利的；3-HPA的积累对PDOR的抑制作用要强于对GDHt和GDH的抑制作用,即底物过量导致3-HPA积累时,PDOR是甘油代谢过程的限速酶。其次,对色氨酸操纵子基因调控动力学进行了深入研究,为甘油生物歧化过程的基因调控动力学研究奠定了基础。重点考察了色氨酸操纵子中多基因间的相互作用以及胞内色氨酸向胞外的转运机制,建立了一个包括阻遏蛋白基因和色氨酸关键酶基因之间相互作用以及色氨酸由胞内向胞外转运的色氨酸操纵子基因调控系统。鲁棒性分析表明,该系统具有很强的鲁棒性,求取的参数值和动力学描述合理。考察了比生长速率对色氨酸生物合成和系统稳定性的影响,对色氨酸合成过程的动态行为进行了理论预测和分析。采用间接优化方法对色氨酸的生产进行了优化分析,细胞生长速率为0.00624 h-1时色氨酸的产量提高了4.8倍。再次,建立了甘油生物歧化过程基因调控动力学方程,重点研究了甘油代谢还原途径的中间产物3-羟基丙醛对dha调节子基因表达的阻遏作用,对GDHt和PDOR的反馈抑制作用。建立了包括调控蛋白(dhaR)、GDHt和PDOR及其相关基因表达调控,以及酶催化代谢产物之间的复杂网络。鲁棒性分析表明,该动力学系统具有很强的鲁棒性,求取的参数值和动力学描述合理。和酶催化动力学系统一样,多稳态现象在基因调控动力学中同样存在。对发酵过程进行模拟的结果表明,3-HPA的积累导致甘油代谢还原途径中酶的基因表达受阻,表达量减少；3-羟基丙醛参与了dha调节子的基因表达与调控,是dha调节子上的负调控因子。在dha调节子中存在两种负反馈调控机制：阻遏作用和酶抑制。两种并存机制能更为合理地阐释实验结果。最后,对微生物转化法生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和氢气进行了化学计量分析。综合考虑了质量、能量和还原当量的平衡,通过“原子经济性”理论分析,实现底物向产物的最大转化。结果表明：共底物发酵有利于提高目标产物的收率,并且还原当量的合理分配对目标产物的收率有非常重要的影响。在葡萄糖和甘油共底物厌氧生产1,3-丙二醇过程中,甘油既不进入氧化途径也不用来生成生物量,该部分能量由葡萄糖代谢提供,甘油可以完全转化为1,3-丙二醇,此时底物中葡萄糖相对于甘油的比率为0.32mol.mol-1。葡萄糖和甘油共底物厌氧联产1,3-丙二醇和2,3-丁二醇时,葡萄糖代谢提供细胞生长所需能量和1,3-丙二醇生成所需的还原当量；当葡萄糖与甘油的比率为1.13mol.mol-1时,甘油可以完全转化为1,3-丙二醇,而2,3-丁二醇相对于葡萄糖的收率为0.88mol.mol-1,此时基本的假定条件是高浓度葡萄糖对甘油代谢酶没有抑制作用。葡萄糖和木糖共底物微氧发酵生产2,3-丁二醇和氢气时,理论上可获得2,3-丁二醇和氢气相对于底物葡萄糖和木糖的最大质量收率分别为0.5g.g-1和0.008g.g-1,此时呼吸商为14。葡萄糖厌氧发酵生产氢气时,最大收率为2.86 mol.mol-1；微氧发酵呼吸商为2.26时,氢气最大收率可达6.68 mol.mol-1。上述研究工作对深入理解克雷伯氏杆菌的甘油代谢途径、菌种的基因工程改造、甘油代谢过程基因表达的全局调控、甘油生物转化为1,3-丙二醇过程的在线控制和代谢控制分析具有重要的参考价值和指导作用。
姚玉华, 孙丽华, 修志龙[6]2005年在《一类具有时滞的微生物连续培养数学模型研究》文中指出研究了具有强核函数时滞的微生物连续培养数学模型,利用泛函微分方程理论和数值解法得到系统在一定操作条件下存在Hopf 分叉以及分叉值随操作参数变化的规律,并研究了Hopf 分叉产生的方向及周期解的稳定性,绘制了周期解的图形和相图.该模型定性地描述了实验中的振荡和过渡现象.最后与弱核函数时滞模型、离散时滞模型进行比较,分析了它们对多态、振荡等动态行为的影响.
袁海平[7]2009年在《镉污染对放线菌生物活性和种群结构的影响及镉生物吸附研究》文中进行了进一步梳理本项目以华家池旱地黄松田土壤为研究材料,运用现代分子生物学手段,采用室内培养及统计分析相结合的方法,全面探讨了镉胁迫对旱地土壤放线菌生态多样性的影响,并以土传致病菌-番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,Cmm)为供试菌株,分析筛选到的1株对Cmm具有较强抑制作用的放线菌HL-12(Streptomyces vinaceus)受镉胁迫在纯培养条件下及在无菌土壤环境中对Cmm的抑制效果。此外还分离到1株对镉具有较强抗性的放线茵K33(Streptomyces psammoticus),对2株放线菌在镉污染水环境中对镉的生物吸附动力学及其吸附机理作了初步研究和比较,为建立有效的重金属污染预警指标体系、环境质量评价及抗镉微生物的有效利用提供有益的参考。本研究所获主要结论如下:1采用现代分子生态学手段研究了镉胁迫对旱地土壤中放线菌生态多样性的影响。在培养初期镉对放线菌种群毒害作用较为明显,与对照相比,许多条带消失,基因多样性下降,到了培养后期,不同处理间的基因多样性差异逐渐缩小,数量上仍存在一定差异。在含0.5～1.0 mg·kg~(-1)镉的培养初期DGGE图谱中出现特异性条带,为对照和高浓度镉处理样品中所没有,经序列测定及与GenBank中核酸数据进行比对分析,与Rhodococcus sp.M51-3.3具有很高的相似性,以该序列代表菌株用来检测土壤低浓度镉污染具有一定的可行性。另有一条特异性DGGE条带只出现在对照样品中,经序列测定及与GenBank中核酸数据进行比对分析,与Streptomyces sp.343E07具有很高的相似性,说明该条带代表菌株对镉较为敏感,可以作为一种镉污染环境中的特征性菌株。2从浙江台州一废弃铅锌尾矿土壤和浙江大学华家池一处未遭受重金属污染的旱地土壤中分别分离纯化获得1株可在含镉300mg·1~(-1)的LB培养基中正常生长的抗镉放线菌株和对Cmm具有较强抑制作用的放线菌。通过对2菌株进行形态观察、培养特征、生理生化特性分析、细胞壁化学组分分析及16S rRNA基因序列同源性比较,利用DNAStar软件进行系统发育地位分析,构建系统进化树,鉴定其分别属于Streptomyces psammoticus和Streptomycesvinaceus。重金属抗性实验表明,菌株K33对铅和锌具有良好的抗性,对铜的耐受性较差。利用圆纸片法测定菌株HL-12的发酵粗提液对Cmm的抑制作用,直径可达11mm,利用琼脂块平板法测定活菌活性,直径大小为13 mm。此外,菌株HL-12对革兰氏阳性菌具较强的抑制作用,对革兰氏阴性菌的抑制性较弱,对稻瘟病菌(真菌)无拮抗作用。3研究了纯培养及灭菌土壤环境中,镉对菌株HL-12抑菌活性的影响。结果显示适宜浓度镉胁迫下,促进放线菌的次生代谢过程,增强其抑菌活性,当镉浓度超过菌体自身调节作用,则对菌体产生一定的毒害作用,影响其次生代谢过程,进而对其抑菌活性产生负面效应。添加Ca~(2+),在一定程度上可以缓解镉对菌株的毒害作用。添加低浓度Ca~(2+)有利于菌株抑制Cmm生长,高浓度Ca~(2+)降低菌株HL-12对Cmm的抑制作用。在灭菌土壤中,超过土壤镉污染临界点的浓度(1.0 mg·kg~(-1)),菌株HL-12对Cmm仍具有一定的抑制效果,只有在镉离子浓度超过污染临界值3～5倍左右时,才会对菌株HL-12的抑菌活性产生一定的影响。4研究了2分离菌株HL-12和K33对镉离子的吸附动力学。结果表明菌株K33在镉污染水环境中的吸附能力较菌株HL-12要强。在pH为6.0,菌体浓度为2.0～2.5g·l~(-1)的条件下,一定浓度镉溶液中处理60 min,菌株K33的最大吸附量为1.98 mol·g~(-1),菌株HL-12的最大吸附量为1.14 mol·g~(-1)。Langmuir,Freundlich和Dubinin-Radushkevich(D-R)3个等温吸附模型对实验数据均可以进行较好的模拟,Langmuir与实验数据拟合效果最好。二级动力学模型能较好地模拟整个吸附过程。在pH值为2.0时,菌株K33的解吸率达70%左右,可以作为生物吸附剂处理低浓度镉污染水体。5初步研究了放线菌对镉的生物吸附及耐受性机理。细胞中DNA、蛋白质、多糖、脂类4类主要组分对镉离子的吸附具有较大差异。菌株K33和HL-12细胞中均以蛋白质结合态镉为主要存在形式,脂类和多糖结合态镉的存在比例相当,以DNA结合态镉存在形式最少。透射电镜观察结果显示,镉对菌株HL-12形态影响较大,添加镉后菌株HL-12体积变小,胞囊壁呈现变形虫状,胞内透明,胞囊增大,许多细胞出现了表面破裂、细胞变形等情况。菌株K33胞内胞囊变化不明显,添加镉后,个别细胞出现破裂,表面出现裂痕,但仍保持完整。富镉菌体颜色较无镉菌体浅,较高浓度镉培养下的菌体表面较为粗糙,且有较大的结晶颗粒附着其上。FT-IR方法分析了2菌株细胞表面的功能团对镉离子的螯合特性,结果表明2菌株中结合镉离子的可能功能团为O-H,N-H,C=O,C-O,这些基团基本集中在蛋白质和糖类物质,且菌株HL-12表面结构改变较大。
郭卫革[8]2012年在《喹赛多对恒化器模型中人肠道菌群的影响》文中进行了进一步梳理喹赛多是喹嗯啉类一种新型的抗菌促生长剂,能促进畜禽及水产动物生长、提高动物生产性能,并能有效降低疾病的感染率,安全低毒高效的特性使其在畜牧业中有较好的研究及应用前景。虽然实验室前期对喹赛多的代谢及残留消除规律进行了系统研究,毒理学方面的研究显示为一类安全性较高的药物,而目前还未从微生物学安全性的角度进行分析,因此为了保证食品安全,有必要考察喹赛多残留是否对人的肠道菌群有负面效应,对肠道菌群结构、代谢活性、耐药率及定植屏障功能的发挥是否有干扰,同时抗菌药微生物影响作用又是食品安全评估中要求进行的一项重要内容,因此本试验应用离体恒化器模型,系统评价不同剂量喹赛多对人肠道微生物菌群的作用,丰富其微生物学安全性方面的资料,为喹赛多申报和进一步推广使用提供全面科学的资料。1喹赛多对肠道茵群的影响本研究采用FDA推荐使用的连续培养系统研究喹赛多对人结肠菌群的影响。首先进行喹赛多及其主要代谢物对肠道菌株(大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌)的药敏试验,发现喹赛多主要代谢物Cy1、Cy2、Cy4、Cy6、Cy10、Cy12与原形喹赛多相比均没有抗菌活性,因此模型系统中仅考虑喹赛多对结肠菌群的微生物学效应。根据喹赛多对临床分离的四种优势菌的药敏的范围是1-16μg/mL,设计了包含此范围的一系列不同浓度0.5-128gg/mL在厌氧箱中与粪样孵育,通过对四种优势菌数量及兼性需氧厌氧菌(大肠杆菌、肠球菌)耐药率考察,最终确定终浓度为4gg/mL、16gg/mL、32μggmL、128μg/mL在模型中进行预试。模型接种粪样后第7d达到平衡,于第13d添加终浓度为4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、128gg/mL的喹赛多,考察不同浓度作用下对四种优势菌(大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌)数量影响、短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)影响及兼性需氧厌氧菌耐药率变化(大肠杆菌、肠球菌),连续给药7天,第21d接种108CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌1mL,接种三天,通过采样计数沙门氏菌的数量来判断肠道菌群的定植屏障功能是否破坏。在4μg/mL、16μg/mL剂量下发现对肠道代表菌株的数量、短链脂肪酸、兼性需氧厌氧菌耐药率及沙门氏菌数量均在95%置信范围内,也就是说,这两个剂量组对肠道菌群没有影响。加药期间这两个剂量组下大肠杆菌数量保持在106CFU/mL浓度,肠球菌浓度104CFU/mL,双歧杆菌、脆弱拟杆菌浓度107CFU/mL,均在95%置信范围内,也均在正常生理值范围内；对鼠伤寒沙门氏菌的数量计数分析,也发现4gg/mL、16μg/mL剂量下沙门氏菌数量与对照组相比没有差异,在模型内没有增值的趋势。相反地,32gg/mL、128μg/mL这两个剂量组对四种观测指标则有不同程度的影响。加药期间对四种代表菌株数量均有影响,厌氧菌(双歧杆菌、脆弱拟杆菌)数量降低程度更明显；大肠杆菌、肠球菌耐药率增加；沙门氏菌数量与对照组相比有差异,在模型中有增值的趋势,肠道菌群的定植抗力作用受到破坏；但是321μg/mL、128μg/mL剂量组并没有影响短链脂肪酸的浓度,加药期间乙酸、丙酸、丁酸的浓度均在95%置信范围内,可能与模型系统不能模拟肠道吸收功能有关,使短链脂肪酸浓度变化不是很明显。在恒化器模型中通过对4gg/mL、16μg/mL、32gg/mL、128gg/mL剂量的考察结果显示,16μg/mL剂量组对考察的指标没有影响,不会扰乱人肠道菌群的平衡。2大肠杆菌及肠球菌耐药方式分析模型加药前期(第8-13d)及加药期(第14-20d)从模型中采取样品分离耐药大肠杆菌和肠球菌,加药前期32μg/mL模型中分离大肠杆菌和肠球菌各10株；128μg/mL剂量组大肠杆菌和肠球菌各分离9株。加药期间,32μg/mL浓度下耐药大肠杆菌和肠球菌各14株,128μg/mL剂量组耐药大肠杆菌和肠球菌各分离13株。首先对分离的耐药大肠杆菌、肠球菌进行耐药表型分析,发现模型加药前后分离大肠杆菌对喹噁啉类药物耐药严重(MIC≥64μg/mL),此外还对β-内酰胺类药物耐(MIC≥128μg/mL)。设计引物对分离耐药大肠杆菌和肠球菌进行喹嗯啉类耐药基因oqxAB扩增,检测我们临床的分离的耐药菌中是否有这种耐药基因,目的片段oqxA和oqxB的大小分别是670bp和520bp。加药前期321μg/mL浓度分离的10株大肠杆菌中3株有oqxAB基因,128μg/mL浓度下9株耐药大肠杆菌中有1株有oqxAB基因；加药期间32μg/mL浓度模型14株耐药大肠杆菌有5株有oqxAB基因,128μg/mL剂量组13株耐药大肠杆菌中有3株检测有oqxAB目的条带,模型加药前后分离大肠杆菌都是耐药的,即加药前模型耐药大肠杆菌是固有耐药的,32、128μg/mL剂量组大肠杆菌耐药率增加是药物对固有耐药大肠杆菌的选择作用,固有耐药大肠杆菌过度生长繁殖表现耐药率增加,有研究报道厌氧条件下喹赛多对大肠杆菌的MBC≤321μg/mL,因此模型中这两个剂量组下不可能诱导耐药菌的产生。而我们加药前期及加药期间分离的耐药肠球菌却都没有oqxAB基因,可能是别的耐药基因介导,有待进一步研究。而对携带有oqxAB基因的大肠杆菌进一步分析耐药方式,提取质粒,并作为扩增模板,仍有oqxAB基因目的片段大小正确的条带,之后又进行测序比对,与报道的oqxA和oqxB基因耐药质粒的同源性分别是99%和100%,因此初步可以确定我们临床分离的耐药大肠杆菌oqxAB基因位于质粒上,这种耐药方式有质粒介导,这与文献报道oqxAB基因在质粒上的研究是一致的。综上所述,本试验设计不同浓度喹赛多考察对模型中人肠道菌群的影响,16gg/mL剂量组对肠道四种优势菌数量、大肠杆菌和肠球菌耐药率、短链脂肪酸f乙酸、丙酸和丁酸)、定植屏障指标没有影响；32、128μg/mL剂量组对肠道菌群指标有不同程度的影响,16μg/mL浓度是不会对人肠道菌群有影响的,是一类较为安全的抗菌促生长剂。另外,32、1281μg/mL剂量组大肠杆菌耐药率的升高是药物对固有耐药大肠杆菌选择作用,杀死敏感菌同时,固有耐药菌过度生长繁殖所致的耐药率的增加,而耐药大肠杆菌中可以扩增出喹噁啉类耐药基因oqxAB,这种耐药方式是由质粒介导,与相关研究也是一致的,说明oqxAB基因有一定的流行性,因此应该加强兽药市场的监管,更加合理安全使用抗菌药,保证动物源性食品安全及人类健康。
王兆守[9]2003年在《微生物降解茶叶农药残留的研究》文中进行了进一步梳理本文采用HP6890气相色谱仪测定了联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯在水体和茶叶中的添加回收率。3种菊酯在水体中都分别设计了1mg／L、10mg／L、100mg／L3个浓度的添加回收试验，在茶叶中都分别设计了0.1mg／kg、1.0mg／kg、10.0mg／kg3个浓度梯度的添加回收率试验。结果表明，3种菊酯在水样中的添加回收率在95.47％至103.21％之间，变异系数在2.21％至4.72％之间，在茶样中的添加回收率在84.32％至93.34％之间，变异系数在2.95％至4.22％之间。联苯菊酯的标准曲线方程为y_1=10~6x_1+10~6(R_1~2=0.9987)，甲氰菊酯的标准曲线方程为y_2=10~6x_2+619406(R_2~2=0.9976)，氯氰菊酯的标准曲线方程为y_3=741527x_3+686486(R_3~2=0.9982)。 从农药厂车间下水道污泥中和喷药的茶园小区的茶叶中，通过富集培养基、基础培养基富集培养分离到3株对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯都有较高而稳定的降解力的细菌w10j15、t6f2和c1f6，经鉴定，它们分别为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacap)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。第二次复筛测定结果表明，对100mg／L的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解率，w10j15分别为52.43％、50.76％和56.89％，t6f2分别为50.96％、48.79％和44.57％,c1f6分别为55.64％、44.56％和52.19％。 菌体生长与联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解的关系曲线表明，w10j15、t6f2和c1f6菌株生长都和对农药的降解呈同步关系，而且经只加以农药为唯一碳源的基础培养基平板划线培养，菌株在平板上生长良好，说明菌株能以农药为唯一碳源和能源。 对不同的外界条件对菌株的降解力的影响进行测定。菌株对30、50、100、200、300、400、500、600mg／L的3种菊酯农药降解效果测定结果表明，农药浓度过低及过高都对菌体生长不利，从而影响了菌株对农药的降解率。w10j15在农药浓度为50和100mg／L时菌株的降解率相对较高，并以100mg／L时降解率最高，t6f2在农药浓度为50、100、200mg／L时降解效果较好，c1f6在农药浓度为50、100mg／L时菌株对农药的降解率较其它浓度更高。 菌株w10j15、t6f2、c1f6对100mg／L的3种菊酯农药的降解速率与接菌量近似成正比例关系。从降解效果及降解率与菌量比值的降解效率来看，w10j15和c1f6接种量都以D_(415nm)值取0.1为佳，t6f2接种量以D_(415nm)值0.1或0.3较好。博士论文摘要 以10、15、20、25、30、35、40、45℃不同温度梯度测定温度对菌株降解效能的影响，结果表明，过低和过高温度都对菌株生长和降解效能有抑制作用。wloj巧最适温度在30一35℃之间;t6几适宜的温度在20一35℃之间，以25一35℃时降解效果最好;clf6最适温度在25一30℃之间。 以pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、ro.0测定pH对菌株降解效能的影响，结果表明，过低或过高的pH值，使菌株生长受抑制，导致降解率受到影响。w10)巧适宜的pH范围在6.0一8.0之间，最适pH在7.0左右，对3种菊醋的降解率都在50%以上;t6fZ适宜的pH范围在5.0一7.0之间，以pH=6.0时降解效果最好，对3种菊醋的降解率都在55%以上;clf6适宜的pH范围为6.0一8.0，以pH=7.。时降解效果最好，对3种菊酷降解率都在40%以上。 振荡培养ld、2d、3d、4d，5d后萃取，测定不同的培养时间对菌株降解效能的影响，结果表明，在培养前3d，菌株wloj巧、t6fZ、clf6的降解率增长较快，第3d以后，降解率增长开始减缓。 取0、60、120、180、220rmin一，的不同振荡速率和250mL的三角瓶中装50、100、150、ZOOInL的基础培养基发酵液，测定振荡速率和装液量对菌株降解效能的影响，结果表明，菌株wloj巧和t6fZ对农药的降解率随振荡速率的增加和装液量的减少而增加，，说明菌株wloj巧和t6几是好氧型的;菌株clf6对农药的降解率受振荡速率和装液量的影响不大，在不同的振荡速率和装液量下，菌株对农药的降解率比较接近，说明菌株clf6是兼性好氧型的。 测定edZ+、znZ+、euZ+、Fe，+、PbZ+、AI，+、BaZ+、MnZ+和eaZ+共9种金属离子和氟离子(F一)对菌株的降解效能的影响，结果表明，A13十、Mn，+、caZ+对菌株wl叩5降解力有促进作用，以MnZ十、caZ十促进作用较明显;Cu2+、BaZ+、F一对菌株t6fZ降解力有促进作用，以F一促进作用最明显;znZ+、Mn2+、F一对菌株clf6降解力有促进作用。除此之外，不同的离子对菌株都有不同程度的抑制作用。 基础培养基中单独添加葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖、麦芽糖lg/loolllL时，都不同程度地提高了菌株w10jls、t6fZ和clf6对农药的降解率。对菌株wloj巧以蔗糖促进效果最明显，葡萄糖和果糖次之;对菌株t6几以葡萄糖促进效果最明显，其次是果糖;对菌株clf6以果糖促进效果最明显，其次是葡萄糖和蔗糖。但添加蛋白陈和牛肉膏0.sg/loomL对菌株wloj15、t6fZ和clf6降解农药有明显的抑制作用。博士论文摘要 采用L，:(2x37)正交表，取酵母膏、3种菊酷农药浓度、碳源(w 10)巧选用蔗糖，t6几选用葡萄糖，clf6选用果糖)、接种量、pH值、金属离子、装液?
甄丽莎[10]2016年在《石油污染土壤修复过程微生物群落结构和酶活性变化研究》文中提出石油污染已经成为土壤生态环境保护的一个突出问题。本研究利用Biolog、RFLP、Illumina高通量测序技术探究了石油污染土壤修复过程微生物群落结构的变化,利用基因克隆和异源表达技术研究了石油降解关键酶——邻苯二酚双加氧酶活性及其编码基因的克隆和表达。通过石油污染土壤的微生物群落结构及其代谢特征研究,明确了污染环境中的优势类群为细菌。从石油污染土壤中富集驯化得到16个复合菌群和7株高效石油降解菌株,利用RFLP技术和Illumina高通量测序技术分别对菌株16S rDNA图谱和菌群物种组成进行分析,并测定菌株(群)的石油降解能力。进一步研究了土壤石油含量、氧化剂和有机肥对堆腐化修复过程微生物群落结构组成和代谢特征的影响。研究了邻苯二酚双加氧酶活性特征,对酶蛋白的编码基因进行了克隆和转化,获得1株重组菌实现邻苯二酚双加氧酶异源表达。本研究为石油降解微生物资源利用以及石油污染土壤的微生物修复提供理论依据,主要研究结果如下:1.在石油烃类污染物胁迫条件下,不同类群的土壤微生物总量和组成均存在较大差异。细菌和真菌数量极显著增加,比清洁土壤高1个数量级,放线菌数量极显著减少。细菌是石油污染土壤的优势类群,占微生物总量的99.8%-99.9%。石油污染土壤和清洁土壤的微生物群落存在显著差异,起分异作用的碳源主要为糖类,其次是羧酸类和氨基酸类。随土壤石油污染程度的增加,土壤微生物总体活性减弱,群落结构稳定性降低,碳源代谢模式由以糖类为主转变为以多聚物类为主,微生物群落的Shannon丰富度指数和McIntosh均一度指数减小,Simpson优势度指数增加。2.从不同石油污染土壤中分离得到16个复合菌群和7株高效石油降解菌株,利用RFLP技术和Illumina高通量测序技术分别对菌株16S rDNA图谱和菌群物种组成进行分析,测定菌群和菌株的石油降解能力,采用MPN法对石油降解复合菌群载体进行优化。结果表明,驯化温度和石油浓度对复合菌群石油降解率和物种组成的影响因土壤异质性而不同,中温菌群石油降解率比高温菌群高7.91%-66.43%,低浓度驯化获得的菌群石油降解率是高浓度驯化获得菌群的1.22-5.82倍。中温菌群的优势类群是Achromobacter,高温菌群的优势类群是Geobacillus,2个复合菌群间无共有物种。不同石油浓度条件下筛选获得的复合菌群存在共有物种,Pseudomonas是3个菌群的优势类群,Geobacillus和Brevibacillus是C4-30-20的特有物种,Brucellaceae.unclasified是C4-30-50的特有物种。麸皮是石油降解复合菌群的理想载体,固液比为1:1时,吸附固定的石油降解菌数最高达1012。单菌株D4109石油降解率最高达68.65%,AD049石油降解率最低为34.41%,16S rDNA测序结果表明D4109 Brucellasuis相似度达到96%,ad049与rhodococcuspyridinivorans相似度达到99%。3.石油降解符合一级反应动力学,随着石油含量的增加石油降解半衰期延长。不同土壤污染程度的石油降解率分别为91.45%、91.83%和73.97%,石油平均降解速率分别为112.08、230.05和887.93mg/(kg·d)。在一定范围内,石油降解速率随土壤石油含量增加而升高。随堆腐化进程的推进,awcd值、碳源利用率、shannon丰富度指数和mcintosh均一度指数升高,多聚物类和糖类代谢群逐渐成为优势菌群,微生物群落趋于稳定。主成分分析表明不同程度石油污染土壤的微生物群落差异显著,起分异作用的碳源主要是糖类和羧酸类。堆肥结束时不同程度石油污染土壤的sgi值分别比堆腐初期提高了18.26%、20.42%和36.41%。4.石油降解主要发生在堆腐化修复过程的中期。在一定范围内,氧化剂使用量越高修复进程越滞后,氧化剂中使用量的石油降解率最高为75.20%,是不使用氧化剂的1.24倍。随着堆腐化进程的推进,awcd值、碳源利用率、shannon丰富度指数和mcintosh均一度指数(u)逐渐升高,堆腐中期达到最大。在堆腐化过程中多聚物类和糖类代谢群逐渐成为优势菌群。主成分分析表明堆腐中后期氧化剂微生物群落差异显著,起分异作用的碳源主要是糖类、氨基酸类和羧酸类。堆腐初期的优势类群是pseudomonadaceaeunclassified,平均相对丰度达到76.15%,随着堆腐化进程的推进,sphingobacterium成为堆腐中后期的优势类群,平均相对丰度达到44.66%。flavobacterium是堆腐后期的特有物种。多酚氧化酶活性、羧酸类、糖类、多聚物类和氨基酸类的代谢与土壤石油含量呈显著负相关,azospirillum、sphingomonas、enterobacteriaceae.sp,rhizobiales.sp和agrobacterium等是提高土壤酶活性和碳源代谢能力的主要类群,inquilinus、pseudomonas、sphingobacterium和steroidobacter等是对土壤石油降解起主要作用的微生物类群。5.低有机肥的石油降解率最高71.69%,分别不添加有机肥、中添加量和高添加量高20.39%、15.48%和9.26%。随着土壤堆腐化修复进程的推进,石油降解菌呈先缓慢降低再升高后降低的趋势,awcd值、碳源利用率(除芳香烃类化合物外)、shannon丰富度指数和mcintosh均一度指数(u)升高。堆腐初期优势群落为多聚物类代谢群,中期的优势群落为糖类和氨基酸类代谢群,后期以糖类和多聚物类代谢群为优势群落。主成分分析表明不同有机肥添加量微生物群落差异显著,起分异作用的碳源主要是糖类、羧酸类和氨基酸类。石油降解菌与微生物群落多聚物类代谢显著相关,石油含量与多聚物类、羧酸类、糖类和多胺类代谢显著相关。6.ad049(rhodococcuspyridinivorans)代谢苯酚的途径是以邻苯二酚1,2-双加氧酶(c12o)为主进行邻位开环,以邻苯二酚2,3-双加氧酶(c23o)为辅进行间位开环。c12o酶合成方式为诱导合成,在250-1500mg/l范围内,底物诱导效应逐渐增强。c12o酶不能代谢氯代邻苯二酚,属于c12oi型酶。影响酶活性的因素研究表明hg2+、ag2+和mn2+可有效抑制c12o酶活性,fe2+、fe3+、zn2+和3种脂肪族醇对c12o酶活性的抑制作用较小,Cu2+对C12O有轻微的激活作用。AD049胞内酶降解苯酚的酶促反应最适pH为7.0-8.0,最适温度为30-35°C。利用稳态法获得了底物动力学模型,米氏常数为2.34×10-2 mol/L,最佳底物浓度为3128.1 mg/L。7.C12O的编码基因catA全长944 bp,位于染色体DNA上,通过Genbank比对,AD049的catA与Rhodococcus pyridinivorans SB3094的相似性达到99%(覆盖度99%)。用设计的特异性引物,从红球菌(Rhodococcus)AD049中PCR扩增得到邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因(cat A),双酶切后连接至pET 28a表达载体,使其在E.coli BL21(DE3)宿主菌中成功表达。经IPTG诱导重组菌株的C12O酶活性为(1.42±0.02)μmol·min-1·mg-1,酶活性比原始菌株AD049提高了10.08%。
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