黄静
（安徽医学高等专科学校 安徽合肥 230601）
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）03-0232-01
1.实验目的
1.1 掌握从组织细胞中提取DNA的基本原理。
1.2 掌握DNA提取和鉴定的方法。
实验原理：本实验所用的是DNA酚抽提法。可用于多种来源标本的高分子量DNA样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜组织以及血液标本等。
提取DNA的基本思路，DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。它是以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而DNA进入水相，再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。重复抽提DNA至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需大小范围的高分子量DNA样品。沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀。
其中EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。SDS为生物阴离子去垢剂，SDS 可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分子分离，并能与脂质和蛋白质结合使他们沉淀，同时还有降解DNA酶的作用。无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化。蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。将蛋白质降解成小肽或氨基酸，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，使 DNA 分子完整地分离出来也有裂解细胞的作用。酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。氯仿可除去微量酚。
实验材料：小鼠
器材：解剖盘、解剖剪、镊子、匀浆器、微量加样枪、烧杯、试管架、EP管、低温高速离心机、紫外分光光度计
试剂：生理盐水、10%的SDS溶液、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)、无水乙醇、10mmol/L的乙酸铵溶液、1×TE(pH8.0)缓冲液（注：1×TE(pH8.0)缓冲液由10mmol/L(pH=8.0)的Tris-HCl和1mmol/L（pH=8.0）的EDTA 配制而成）。
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操作步骤：（1）小鼠肝匀浆液的制备：①颈椎脱臼法处死小鼠，解剖，取肝脏组织一块于生理盐水中洗脱血液。②将洗脱的肝组织剪碎放入匀浆器中，在加入5ml冷的TE缓冲液，进行充分研磨。制成匀浆液。
（2）提取DNA：①取0.5ml匀浆液加入1.5ml的离心管中，加入10％SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温5min。②在上述溶液中加入饱和酚0.25ml，氯仿:异戊醇(24:1)0.25ml，充分混匀，室温放5min，12000rpm离心5min。③小心取上清液约0.4～0.5ml，加入0.5ml氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，室温放5min，12000rpm离心5min。④取上清液0.2ml，加入0.3体积（即60μl)的NH4Ac，2.5体积（即0.5ml)的无水乙醇充分混匀，12000rpm离心5min，小心倒去溶液，吸干。DNA沉淀加入1.0mlTE缓冲液溶解。
（3）DNA的含量测定
取0.5ml DNA样品加 TE缓冲液至4ml，用TE缓冲液调零，用紫外分光光度计分别测A260nm值和A280nm值。
结果记录与处理：
1、结果记录：
用紫外分光光度计分别测的A260nm值为0.498，A280nm值为0.362
2、结果计算：
A260nm/A280nm=0.498/0.362=1.376
双链DNA样品浓度（μg/ml)=A260nm×稀释倍数×50=199.2μg/ml
结果分析：
DNA的质量鉴定包括浓度分析、纯度鉴定以及大小完整性的分析。浓度分析与纯度鉴定，最简单快速的方法是紫外分光光度计。
1、通过 A260nm/A280nm的比值可以分析其纯度，DNA纯品: A260nm/A280nm=1.8
RNA纯品：A260nm/A280nm=2.0。A260nm/A280nm的比值为1.8是高纯度DNA的标志，高于或低于此值均表示不纯。但比值为1.8时的DNA溶液也不能断定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染。其中蛋白质与酚的污染均使比值下降，而RNA的污染则使比值升高，一般情况下，A260nm/A280nm的比值在1.75～1.80之间是可以接受的。但A260nm/A280nm的比值若低于1.75，则表明有显著的蛋白质污染。
经计算此次实验所提取的DNA样品的A260nm/A280nm的比值为1.376明显低于1.75，可见样品中明显有蛋白质污染，可能是由于加入的SDS未能充分混匀，致组蛋白未能与DNA完全分离，可能由于酚未能与提取液混合充分，未能使蛋白质完全沉淀，更有可能是由于在第4步中吸取上清液时，吸到了蛋白质沉淀，造成蛋白污染。
鉴于A260nm/A280nm的比值低于1.75时，明显有蛋白质污染，此时需要加入终浓度为0.5%的SDS，并重复提取DNA步骤中的2～4。
2、通过A260nm值可以定量，核酸在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50μg/ml的双链DNA、40μg/ml的单链DNA或RNA、20μg/ml的寡核苷酸。但紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
双链DNA样品浓度（μg/ml）=A260nm×稀释倍数×50
据此计算出本次实验的DNA样品浓度为199.2μg/ml。
注意事项：
1、对组织标本的高分子量DNA提取时，最好是新鲜标本，需要首先清楚血液和筋膜等纤维结缔组织，并将组织搅切或研磨成粉状，研磨要充分，否则DNA不能够完全释放，以致提取的DNA样品浓度低。
2、经酚抽提、离心分层后，操作应轻柔，以免达不到离心效果，影响抽取DNA样品的浓度。
3、实验所用的器材及试剂应消毒洁净，以免含有DNA酶，将DNA降解。
论文作者:黄静
论文发表刊物:《心理医生》2016年3期
论文发表时间:2016/8/1
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