安志英1 李 浡2
1.河北省廊坊市中医医院 河北廊坊 065000；
2.北京电子科技职业学院 北京 100029
【摘 要】目的：探讨单一药材与多味药材配伍情况下芍药苷提取率的差异。方法：分别以水和50%乙醇为提取溶剂，采用浸泡、索氏回流、超声及微波等提取法对药材进行预处理，采用高效液相色谱法测定芍药苷含量。结果：单一赤芍药材中芍药苷含量测定结果低于验方药材，其含量分别为39.37mg/g和41.47mg/g；芍药苷提取以50%乙醇和微波提取法结合最佳。结论：验方药材配伍对芍药苷提取有一定的促进作用，芍药苷成分提取以60℃水浴、50%乙醇和微波辅助法结合提取较好。
【关键词】赤芍；芍药苷；高效液相色谱
【中图分类号】R284.2 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0001-02
Comparison of Different Extracting Methods for Paeoniflorin
in Paeoniae Radix Alba and Empirical Prescription
AN Zhi-ying1，LI Bo2
（1 Langfang Traditional Chinese Medicine Hospital，Langfang，Hebei 065000；
2 Beijing Polytechnic Vocational College, Beijing 100029）
【ABSTRACT】OBJECTIVE：To study the different of Paeoniflorin extraction from Radix Paeoniae Rubra and empirical prescription．METHODS：Extracted with water and 50% ethanol，four extraction processes，such as soaking extraction，reflux extraction，ultrasonic extraction and microwave extraction were exploited respectively to extract paeoniflorin from Radix Paeoniae Rubra and empirical prescription．To study these extraction methods by HPLC as a reference index of paeoniflorin．RESULTS ：The determination results of paeoniflorin in Radix Paeoniae Rubra were obviously higher than that in empirical prescription，which was 39.37mg/g and 41.47mg/g respectively.Microwave method extracted the highest rate，coupled with heating and 50% ethanol solution．CONCLUSION：Compatibility has the important promoter action to paeoniflorin extraction in empirical prescription．60°C water bath，50% ethanol and microwave assisted extraction method was helpful for extraction of paeoniflorin.
【KEY WORDS】Radix Paeoniae Alba；Paeoniflorin；HPLC
传统中医验方因组方药材众多，煎制过程中难以兼顾众多药材有效成分的保留。传统的药材提取方法仍是目前药典和工业应用最常用的提取手段，如回流提取［1-3］、温浸提取［2］、超声波提取［2，4］等，使用的提取溶剂包括乙醇、甲醇、水等［5，6］，常用于单一药材药效成分的提取研究。但在验方中由于配伍药材较多，影响提取效率的因素必将更多且复杂。
本文拟通过对单一药材和验方中同一药效成份的提取研究，比较二者提取效率的差异，为复杂组分药材煎制中药效成份保留提供一定参考。实验选取了某慢性乙肝验方为研究对象，该验方经临床100余例慢性乙型肝炎患者实际应用验证，对慢性乙肝治疗有明显疗效。验方以黄芪、党参、柴胡、赤芍、当归、白花蛇色草、五味子、甘草等为主药，视患者病症予以加减。考虑到中药制剂、煎剂化学成分的复杂性，作为研究性探索，选取了该验方中的芍药苷成分为研究对象。本文使用不同的提取方法对单一赤芍样品和验方药材进行预处理，采用高效液相色谱对样品中芍药苷的含量进行了测定。
1 材料
Agilent 1200高效液相色谱分析仪（美国Agilent公司）、ZORBAX SBC18 柱(4.6 mmX150 mm， 5um )、KQ-50B超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）、MP17C-KE微波炉（美的公司）、Laborato 4000 effiencient 旋转蒸发仪（德国海道夫仪器有限公司）。
芍药苷标准品购于上海同田生物技术有限公司；中药材黄芪、党参、柴胡、赤芍、当归、白花蛇色草、五味子、甘草购于河北安国东方药城；乙腈、冰醋酸、乙醇均为色谱纯，购于Sigma公司；水为超纯水水（MILLIPORE公司的Milli-QA超纯水机制得）。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil C18柱(5μm， 250mm×4.6mm i.d)；流动相：A：乙腈，B：1% 冰醋酸水溶液；采用梯度洗脱程序：0～8.0min，20% A；8.0～12.0min，30% A；12.0～22.0min，40% A；22.0～32.0min，12% A；流速：1.0ml/min；柱温为：25℃；检测波长：280nm。
2.2 验方药材处理
该验方中以黄芪、党参、柴胡、赤芍、当归、白花蛇色草、五味子、甘草等为主药，视患者病症予以加减。为便于实验研究，制作煎剂时，选取主药材用于实验研究，将药材粉碎成细粉，过80目筛。按验方各药材用量准确称量（党参15g，黄芪30g，甘草10g、当归15g、五味子10g、赤芍20g、白花蛇舌草10g、柴胡10g），混合均匀备用。
2.2.1 常温浸泡法水溶解样品
准确称取5. 000g验方预处理后药材，加50mL双蒸水，常温（23.5°C）浸泡1h，过滤。滤液减压回流至干，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）溶解并定容至10ml，摇匀，待用。
2.2.2 加热浸泡法水溶解样品
准确称取5. 000g验方预处理后药材，加50mL双蒸水，60°C水浴加热浸泡1h，过滤。滤液减压回流至干，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）溶解并定容至10ml，摇匀，待用。
2.2.3 微波提取法水溶解样品
准确称取5.000g验方预处理后药材，加50mL双蒸水，于60°C水浴中浸泡30min，微波炉小火（100W）5min。过滤后滤液减压回流至干，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）溶解并定容至10ml，摇匀，待用。
2.2.4 超声提取法水溶解样品
准确称取5. 000g验方预处理后药材，加50mL双蒸水，于60°C水浴中浸泡30min，超声波50W处理 30min。过滤后滤液减压回流至干，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）溶解并定容至10ml，摇匀，待用。
2.2.5 索氏回流提取法水溶解样品
准确称取5. 000g验方预处理后药材，以双蒸水为提取剂，索氏回流1h，过滤后滤液减压回流至干，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）溶解并定容至10ml，摇匀，待用。
2.2.6 醇提处理样品
使用50%乙醇为提取剂，按照步骤2.2.1~2.2.5 方法处理样品备用。
2.3 赤芍药材样品的制备
将赤芍药材样品按照2.2所含步骤进行制备。
2.4 芍药苷标准溶液
准确称取干燥至恒重的芍药苷标准品10mg，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）溶解定容，配制成1mg/ml的标准溶液待用。
3 结果
3.1 标准曲线测定
取配制好的芍药苷标准溶液，过滤后，依次进样1.0，2.0，5.0，10.0， 20.0 μl，根据液相色谱优化的梯度条件，对标准溶液分别进样进行HPLC分析，以色谱峰面积积分值对样品量回归，回归方程为y = 27.728x - 13.935，线性相关系数R? =0.9998。结果显示芍药苷标准品在0.2~24.0μg范围内线性关系良好，检出限为0.204μg。芍药苷标准溶液的色谱图如图1所示（保留时间5.786min）。
图1 芍药苷标准品色谱图
Fig 1 Chromatogram map of paeoniflorin standard
3.2 加标回收率和精密度测定
以2.2.1和2.2.3方法分别处理验方药材和赤芍药材，准确吸取药材提取液1mL共6份，分别加入芍药苷标准溶液1ml，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）定容10mL。色谱条件进样量5μl，测定加样回收率。另准确吸取药材提取液1mL共6份，用流动相（20%乙腈和80%冰醋酸水溶液）定容10mL。色谱条件进样量5μl，以芍药苷色谱峰面积计算精密度。结果见表1。
结果显示芍药苷加标回收率在95% 以上，回收率良好。芍药苷峰面积的RSD值小于4%，表明仪器精密度良好。
表1 加标回收率和精密度测定
Tab 1 Determination results of standard addition recoveries and precisions
图2 验方样品的色谱图
Fig 2 Chromatogram map of empirical prescription
表2 验方样品中芍药苷含量
Tab 2 Paeonflorin in empirical prescription
4 讨论
4.1 提取方法和提取溶剂的影响
对于验方制剂来说，制备中应尽可能保留各味药材的药效成分。文献报道中单一药材药效成分的提取方法对组方药材药效成分的提取与保留有重要参考价值，但中药组方由多种药材组成，具有复杂的成分，因此研究验方药材中药效成分的提取方法具有重要意义。中药材常用的提取方法有浸渍法、回流法、水解法、微波法、超声法、酶解法等，但同一药材不同的提取方法和提取溶剂，也导致了提取效率的区别[7-12]。
在本文的提取方法中，以微波提取法为例，在常温浸泡和加热浸泡时，以水为提取剂时赤芍药材中芍药苷含量分别为14.27mg/g和17.35mg/g，验方药材中芍药苷含量分别为17.21mg/g和19.58mg/g；以50%乙醇为提取剂时赤芍药材中芍药苷含量分别为24.01mg/g和24.68mg/g，验方药材中芍药苷含量分别为24.07mg/g和24.22mg/g。实验表明无论提取剂是水还是乙醇，加热提取效果明显好于常温浸泡方法。而且在提取溶剂相同的前提下，微波提取法最好，赤芍药材和验方药材中芍药苷含量分别为39.37mg/g和41.47mg/g，提取效果均好于其他提取方法。
4.2 单一药材和组合药材的影响
本文比较了赤芍单一药材和验方组合药材在不同提取方法下的芍药苷含量的变化。以50%乙醇为提取剂，验方药材与赤芍药材中芍药苷含量测定结果，在常温浸泡时分别为17.21mg/g和14.27mg/g；在加热浸泡时分别为19.58mg/g和17.35mg/g；微波提取时分别为41.47mg/g和39.37mg/g；超声提取时分别为27.75mg/g和25.65mg/g，索氏提取时分别为17.54mg/g和16.93mg/g。通过对药材中芍药苷含量比较，可以发现单一赤芍药材提取液中芍药苷含量明显低于验方药材提取液中的芍药苷含量。结果表明，多味药材的组方中，药材配伍对药效成分的提取可能存在相互作用和影响。
文献报道中单一药材药效成分的提取工艺研究较多，在多味药材组方中药效成分提取的研究报道较少。陈龙等[13]对48种中药材活性成分使用多种方法进行提取，发现同一药材不同提取方法得到的提取物活性差异很大；何峰等[14]研究了赤芍与辛芍组方中没食子酸、芍药内酯苷在大鼠体内的药动学，结果显示中药组方与单味药材体内药动学之间存在差异，其产生的原因可能与复方间的相互配伍以及复方组成有关。因此对组方药材药效成分提取不仅要考虑提取工艺，而且要考虑药材配伍的影响。文献报道的提取方法描述与研究中，尚未发现以一种最佳的提取方法，对于组方药材多种药效成分的保留具有最佳效果。
4.3 提取对象的影响
本文初步探讨了提取溶剂、提取方法、提取温度等条件对药材药效成分的影响。对于芍药苷成分的提取，本文实验结论显示，50%乙醇比双蒸水提取效果好，加热状态比常温状态效果好，微波提取效果亦好于本文中其他提取方法。但在文献研究中，路晓钦等 [15]提出，芍药苷由于受热而被破坏，含量往往下降，可能是因芍药苷的水解所致; 因此，白芍在提取过程中应尽量避免长期高温受热。黄夏敏等[16]提出，芍药苷对热、碱具有不稳定性，提取时间不宜长时间加热，故在提取液中加入少量的酸，可使溶液的稳定性增加。因此，实际实验中对于药材药效成分的提取我们仍然需要考虑提取方法、温度、溶剂、酸碱度等多种因素，应根据实际情况进行多次正交试验来确定验方制剂的制取方法。
5 结论
本文着重探讨了提取方法、提取溶剂、提取温度等对赤芍和组方药材中芍药苷成分的影响。实验结论显示，50%乙醇比双蒸水提取效果好，加热状态比常温状态效果好，微波提取效果亦好于其他提取方法。此外，多味药材的组方中药材配伍对药效成分的提取可能存在相互作用和影响。若改变研究对象，提取方法和提取试剂均应进行实际实验验证。特别是组方药材多种药效成分的提取效果确定，选取提取试剂和提取方法时应慎重比较，综合考虑。
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基金项目：
河北省廊坊市科技计划项目（2012013070）
作者简介：
安志英（1970-），女，汉族，河北保定人，主管中药师，中药学学士学位，主要从事中药标准化和药品质量控制研究工作。
论文作者:安志英1,李浡2
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/1
标签：药材论文; 芍药论文; 验方论文; 赤芍论文; 方法论文; 药效论文; 色谱论文; 《中医学报》2015年8月论文;