湖南医药学院第一附属医院检验科 湖南怀化418000）
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湖南医药学院检验医学院；湖南医药学院第一附属医院检验科 湖南怀化418000）
摘要：目的 建立环介导等温扩增技术（LAMP）用于检测B7-H3基因，以评价肿瘤患者的预后转归。方法 收集临床病理阳性样本并用荧光定量PCR检测，然后根据B7-H3基因序列设计LAMP引物并优化反应条件。用LAMP方法检测收集的临床样本，计算阳性率，并比较LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果 建立的LAMP体系特异性和灵敏性良好。通过对临床样本的检测，B7-H3阳性样本的LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义（P<0.05）。结论 LAMP对B7-H3 基因的检测具有较好的特异性，操作简便，适合在基层医院应用。
关键词：环介导等温扩增技术；B7-H3；肿瘤
B7-H3分子是由Chapoval等人从DC的cDNA库中克隆出 的B7家族新成员，是一种新型的共刺激分子。现有研究表明，B7-H3在多种肿瘤组织中高表达，其与多种肿瘤的恶性程度、迁移以及患者的预后转归有着密切的关系。因此检测B7-H3的表达对于判断肿瘤患者的预后有着重要的意义。传统的检测方法如western blotting和ELISA，操作繁琐，耗时较长且需用到特异性单克隆抗体，因而其应用受到一定的限制。此外，sB7-H3在血清中出现仅见于少数几种恶性肿瘤患者且含量不高。以上原因使得检测可溶性B7-H3分子在肿瘤患者预后判断中
的应用存在着一定的局限性。因此，开发一种应用范围更广、特异性更高、操作更简单、价格低廉的检测B7-H3分子表达的试剂盒有着重要的临床意义和良好的市场前景。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性，缩短了检测时间。目前，该技术已成功应用于微生物检测领域，但在肿瘤相关基因表达的检测中尚无应用。我们将LAMP技术的上述优点应用于B7-H3分子表达的检测，以期开发出应用范围广、检测速度快、结果特异性高和低成本的试剂盒，为肿瘤的预后评估提供新的评价方法和途径。
1.材料与方法
1.1 主要试剂 样品DNA抽提试剂盒、DNA聚合酶、1Kb和100bp DNA ladder和均购自天根生物；Betaine（甜菜碱），Calcein（钙黄绿素）购自Sigma公司；
1.2 标本来源收集湖南医药学院第一附属医院病理科2015年1月到2015年10月肿瘤患者组织标本35例，健康对照标本11例，按照DNA抽提试剂盒的操作说明提取DNA，提取好的DNA进行分装，一部分冻于-80℃冰箱备用，一部分用荧光定量PCR进行检测。所有患者均签署知情同意书。
1.3 引物设计 获取B7-H3基因序列，使用ClusawX软件进行多重序列对比，确定引物设计区段。通过引物软件Primer 5设计4条通用引物，序列见表1，其中F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物， 所有引物均有上海生工公司合成。
1.4 LAMP体系的构建 25μl体系包括：1.5μl内引物（FIP和BIP），0.3μl外引物 （F3和B3），0.6μl甜菜碱，10mmol/L MgSO4，1.5mmol/L dNTPs，6U DNA聚合酶 ，2.5μl10×PCR反应缓冲液，1μl模板，1μl钙黄绿素和MnCl2，用超纯水补足至25μl，同时用加入模板的体系作为阴性对照。将反应管置于65℃恒温水浴箱内反应60min后冷却，灭活反应酶，用来终止反应。
1.5 产物检测 扩增完毕后，取5μl扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶中电泳，观察条带。在反应体系中加入钙黄绿素和MnCl2混合染液，阳性可以观察到反应体系由橙色变为绿色，此现象即用可视化方法进行结果判定：绿色改变为阳性结果，保持橙色为阴性。
1.6 统计学处理 实验数据用SPSS18.0 软件分析结果, 应用配对卡方检验比较LAMP和荧光定量 PCR的统计学差异，P<0.05 表示差异具有显著性。
2.结果
2.1 LAMP检测B7-H3基因的特异性，肿瘤患者阳性标本LAMP扩增后具有梯状条带，健康对照无条带；在反应体系中加入钙黄绿素和MnCl2混合染液，肿瘤患者阳性标本LAMP扩增后管中的颜色由淡橙色变为绿色，而健康对照样本管颜色未发生改变。这种染色方法快速简便，直接观察反应试管颜色即能对结果进行定性判定。
2.2 临床标本的检测 LAMP分别扩增经荧光定量PCR检测的35例阳性标本、11例阴性对照，结果如表2所示，LAMP法和荧光定量PCR的结果比较差异有统计学意义（P<0.05）。
3. 讨论
研究表明，B7-H3分子与多种肿瘤的恶性程度、迁移以及患者的预后转归有着密切的关系[1-3]。检测B7-H3的表达对于判断肿瘤患者的预后有着重要的意义，但以往的检测方法如western blotting和ELISA操作繁琐，耗时较长且需用到特异性单克隆抗体，因此B7-H3分子在肿瘤患者预后判断中的应用受到了一定程度的制约。我们的研究则基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，形成了一个反应体系，经过对体系的特异性、敏感度以及临床标本的评价，该方法可以满足基层医院对于B7-H3基因的检测要求，反应迅速，不需要特殊的仪器设备，适宜在基层医院推广。
LAMP技术，作为一种特异性和灵敏性均好、成本低廉、易于操作、较有前途的分析诊断技术，已经被多方面认可[4-6]。通过本研究对该技术的应用，我们发现LAMP技术在检测B7-H3基因时，其扩增条件在恒温（60℃～65℃）下进行，无需特殊设备，操作方法简单易学。同时，其扩增效率高，LAMP技术在60min后就可见明显的显色反应，加入群引物后，反应时间更短。因此，我们将LAMP技术的上述优点应用于B7-H3分子表达的检测，检测速度快、结果特异性高、成本低廉，可以为基层医院的肿瘤预后评估提供新的评价方法和途径。
本文受湖南省怀化市科技局科研项目基金(项目编号:2014-15)资助。
通讯作者：阳大庆，博士，副教授，副主任技师，主要从事抗感染免疫研究。
参考文献：
1. 王茗典，张大昕. B7-H3在恶性肿瘤中的研究进展. 现代肿瘤医学，2018, 26（14）：2305-2308.
2. 卢旭东邓志勇陆益民赵年B7-H3在肺癌恶性胸腔积液中的表达及临床意义. 临床肺科杂志, 2019, 24(3):481-486.
3. 关爱华. 过表达B7-H3对乳腺癌细胞增殖的影响及其初步机制研究. 中国妇幼保健，2018, 33(23):5594-5597.
4. 杨德全，鞠厚斌，葛菲菲等．环介导等温扩增技术及其在动物疫病诊断中的应用．中国动物传染病学报，2011(2):75-78.
5. 袁向芬，吕继渊，吴绍强等. 环介导等温扩增技术作为基因快速诊断方法的研究与展望. 生物技术通报，2018，34（10）：64-70.
论文作者:李典芬 王海英 周太梅 阳大庆
论文发表刊物:《中国结合医学》2019年第08期
论文发表时间:2019/9/24
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