（1福建福州肺科医院 肿瘤科 350008；2福建医科大学临床教学医院 呼吸内科 350008）
摘要：目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者癌组织miR系列基因表达水平与手术疗效的相关性。方法 分别收集2013年10月至2017年4月的同时收集25例NSCLC手术患者的癌组织和癌旁组织冰冻样本，以及手术前和手术后2周的血清样本。组织total RNA 抽提使用 The mirVana miRNA Isolation Kit（Ambion，Austin，Texas，USA）。血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC处理水中，零下80度保存。RNA浓度使用Nanodrop 2100（NanoDrop，Wilmington，DE）测量。采用qRT-PCR方法检测NSLCLC患者手术前、后血清miR系列基因表达水平，判断血清miR系列基因表达水平与手术效果的关系。结果 NSLCLC患者的组织中miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与癌旁组织存在显著差异（P＜0.01）。NSLCLC患者手术后的血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与手术前存在明显差异（P＜0.05）。结论 miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达水平在NSCLC患者癌组织内明显升高，手术切除后血清基因表达明显下降。血清miR系列基因有可能成为预测NSCLC手术预后的分子标志物。
关键词：非小细胞肺癌；miR系列基因；手术；预后
The Correlation Between The Expression Levels of mir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1 and mir-92-1 in NSCLC Patients with The Efficacy of The Operation
CHEN qun，SHI qin.Department of Oncology，Fuzhou Pulmonary Hospital，The Teaching Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350008，China.
[Abstract] objective：To study the correlation between cancer tissue miR gene expression with surgical efficacy in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods：From Oct 2013 to April 2017，50 NSCLC frozen tissue and serum samples，Each 25 taked from cancer tissue and adjacent tissues.Serum samples were collected within 2 weeks before and after operation.Total RNA extraction using The mirVana miRNA Isolation Kit（Ambion，Austin，Texas，USA）.Total RNA of serum was extracted using microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）.Total RNA is soluble in DEPC treatment water，minus 80 degrees.RNA concentration was measured using Nanodrop 2100（Nanodrop，Wilmington，DE）.Qrt-pcr was used to detect the expression level of serum mir-series before and after operation of NSLCLC patients，and to determine the relationship between the expression level of serum mir-series gene and the surgical effect.Results：The expression of mir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1 and mir-92-1 in the cancer tissues of NSLCLC patients were significantly different from that of the adjacent tissues（P < 0.01）.Serum mir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1 and mir-92-1 were significantly differences after and before surgery（P < 0.05）.Conclusion：the expression level of mir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1 and mir-92-1 was significantly increased in patients with NSCLC，and the serum gene expression decreased significantly after surgical resection.The serum mir-series gene may be a molecular marker to predict the prognosis of NSCLC surgery.
Key words：non small cell lung cancer；miR series gene；Operation；prognosis
非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数的80%，手术是治疗早期非小细胞肺癌的主要手段之一，但临床缺少较为准确地评价手术后效果的手段。当前除了常规指标，miR系列基因也被广泛用作评价NSCLC的临床疗效指标。大部分学者关于miR系列基因与NSCLC预后的研究涉及其中的1-2个指标，准确性很有限。本研究涉及6个指标miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，因此可以提供更准确的判断。
1 资料与方法
1.1 临床资料
分别收集2013年10月至2017年4月的同时收集25例NSCLC手术患者的癌组织和癌旁组织冰冻样本，以及手术前和手术后2周的血清样本，并按期整理临床治疗资料。
1.2 方法
1.2.1 RNA分离提取
按照试剂说明书，组织total RNA 抽提使用 The mirVana miRNA Isolation Kit（Ambion，Austin，Texas，USA）。血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC处理水中，零下80度保存。RNA浓度使用Nanodrop 2100（NanoDrop，Wilmington，DE）测量。
1.2.2 qRT-PCR分析
差异表达使用Two-step qRT-PCR分析。第一步cDNA的反转录，第二步是 real-time quantitative PCR。miRNA的反转录相关操作严格按试剂盒One Step PrimeScript®；microRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，反转录的反应体系为[3-4]：2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μμ1，0.1％BSA 2μ1，microRNA PrimsScript®；RT Enzyme Mix2μ1，Total RNA 1μ1，RNase Free ddH2O 5μ1。反转录反应条件：37℃ 60min，85℃变性5s。microRNA的qRT-PCR严格按照试剂盒SYBR®；Premix EX TaqTM Ⅱ（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，qRT-PCR的反应体系为SYBR®；Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5μ1，PCR Forward Primer 1μ1，Uni-miR qPCR Primer 1μ1，模板2μ1，ddH2O 8.5μ1。qRT-PCR反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，共40个循环。定量PCR使用ABI7900的Fast real time PCR system（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）执行，每个样本平行重复3次，采用U6 snRNA 做参考基因，2-△△Ct method 用于计算基因表达倍数变化。
1.3 统计学方法
数据分析使用SPSS21.0 统计学软件，所有数据均符合正态分布，计量数据以均数±标准差（?x±s）表示，进行t检验，统计数据P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1癌组织与癌旁组织的miR系列基因表达水平
具体结果见表1，由表1可知NSLCLC患者的组织中miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与癌旁组织存在明显差异（P＜0.05）。
3 讨论
miR系列基因在多种肿瘤细胞中表达异常[1-4]。林铿强和王欢等[5，6 ]的研究结果显示NSCLC患者癌组织中miR系列基因的表达显著高于癌旁组织，此外，Gallardo等[7] 分析了70例NSCLC患着的肿瘤组织，发现miR-34家族在肿瘤组织中表达下调且与术后复发率高有关，同时存在p53突变和miR-34表达下调的患者术后复发率最高，多因素分析显示miR-34a是NSCLC术后复发的独立预测因素。因此，在肿瘤的诊断及治疗中可以通过监测患者的miR系列基因的变化可以判断NSCLC患者的发病情况、化疗后患者的康复情况，也可以作为判断NSCLC患者预后的重要指标。
本课题同时利用组织和血清样本检测miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表达水平，先确定了靶病灶组织中与切除前血清中miR系列基因表达的相关性，再检测靶病灶手术切除后的血清样本中miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表达的变化，有助于提高准确性和可靠性。结果显示手术前NSCLC患者癌组织和血清miR系列基因的高表达存在高度的一致性，说明miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1的表达与肿瘤的发生、发展具有密切关系。但如果通过检测靶病灶组织miR系列基因表达水平，作为NSCLC患者手术疗效的观察指标，缺乏可行性。
外周血miR系列基因的稳定性比较强，不受外界环境及自身的生理状态的影响，可以准确的反应人体自身的生理变化[8]，那么外周血miR系列基因能否应用于NSCLC手术后疗效预后的评价？本研究结果显示手术后患者的血清miR系列基因表达较术前明显降低，说明了miR系列基因可以用作评价NSCLC手术疗效预后观察。
综上所述，miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达水平在NSCLC患者癌组织内和手术前患者血清中高表达，手术切除后血清基因表达明显下降。血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因有可能成为预测NSCLC手术疗效的分子标志物。
参考文献
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注：基金项目：福建省科技自然基金资助项目（No：2014J01387）
个人简介：陈群，男，1965年9月，本科，籍贯：福建福州，现任职称：主任医师，研究方向：胸部肿瘤诊断治疗
通讯作者：石琴，女，1976年1月，本科，籍贯：福建福州，现任职称：副主任医师，研究方向：胸部肿瘤诊断治疗。
论文作者:陈群1 石琴2（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2018年6期
论文发表时间:2018/6/14
标签：基因论文; 血清论文; 组织论文; 患者论文; 肺癌论文; 系列论文; 手术论文; 《航空军医》2018年6期论文;