中国人民解放军火箭军总医院肿瘤科1，超声科2；解放军总医院呼吸科3；解放军总医院临床药理研究室4；北京100088
过去几年里，美国学者Drlica K和Zhao X在研究氟喹诺酮耐药性的基础上提出了防细菌耐药突变株选择浓度（mutant prevention concentration，MPC）和耐药突变体选择窗（Mutant Selection Window，MSW）新理论[1]。该理论认为只有药物浓度高于MIC并低于MPC，即处于MSW内时，才导致耐药突变体的选择性扩增并产生耐药。治疗浓度低于MIC，耐药突变体面临的选择压力或者不存在、或者相对较弱；高于MPC，敏感菌和突变菌的生长均被抑制，因而耐药突变体的选择性富集均不会发生。MPC 、MSW理论从全新的角度研究耐药性的产生，对制定新的临床用药策略，减轻广泛和日益严重的细菌耐药问题具有指导意义。
国内外研究者开展了有关MPC、MSW体外实验研究[2-9]，均验证了这一假说。但实验均采用通过37℃过夜震荡培养富集的细菌，来测定MIC和MPC，并以此值为依据计算动物体内实验的PK/PD参数。但事实上，体内感染的细菌往往是逐步增长达到一定浓度，在此过程中，细菌的敏感性是否发生改变还不得而知。本实验通过建立兔组织笼感染模型，注入适当浓度的金黄色葡萄球菌，待细菌在体内增殖至少100倍后，测定左氧氟沙星对其的MIC、MIC99及MPC，目的是了解左氧氟沙星对分别在体内、体外富集增殖细菌的抗菌活性和抑制耐药突变株选择的能力是否存在差异。以明确体外富集细菌的MIC、MPC值，能否反映抗菌药物对体内增殖细菌的敏感性及限制下一步突变体选择的能力。
目的：测定左氧氟沙星对体内增殖1010cfu/ml细菌的MIC和MPC。方法：建立兔组织笼模型，并将3×107cfu/ml-3×109cfu/ml金黄色葡萄球菌ATCC25923注入组织笼内增菌到1010cfu/ml。采用琼脂平板稀释法测定左氧氟沙星对体内增长的金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC、MIC99、MPC和耐药突变菌恢复生长菌落数。结果：左氧氟沙星对体内增菌的ATCC 25923的MIC、MIC99和MPC分别为0.125μg /ml，0.1μg /ml 和0.8μg /ml，与测定体外富集细菌的结果完全一致。结论：体外富集细菌的MIC、MPC值，能够反映抗菌药物对体内增殖细菌的敏感性及限制下一步突变体选择的能力。
材料与方法
1 材料
1.1 细菌
金黄色葡萄球菌ATCC25923，购自中国药品生物制品检定所。
1.2 培养基及主要仪器
Muller-Hinton（M-H）肉汤、M-H琼脂和胰酶大豆琼脂（Difco，美国）；胰酶大豆肉汤和Vitek比浊仪（BioMerieux，法国）；HZQ-X100震荡培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）。
1.3 抗菌药物
左氧氟沙星（批号：130455-200202，含量：97.2%）标准品购自中国药品生物制品检定所。用无菌双蒸水配成1920ug/ml的储备液，分装后-70℃保存备用。
1.4 高尔夫练习球
为多孔、中空的塑料球，直径43mm，可高温高压消毒。
1.5 实验动物
新西兰白兔8只，体重2.5～3.0kg，由解放军总医院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 兔组织笼感染模型的建立[10]
雌性新西兰白兔，背部去毛，速眠新0.1ml/kg肌注麻醉后，皮肤碘伏消毒，铺无菌洞巾。在背部正中切开皮肤，钝性分离皮下组织，在皮下植入无菌的多孔、中空的高尔夫练习球（直径43mm）1个，然后缝合。术后应用青霉素100000U/kg、2次/日肌注，共3天预防感染。观察手术伤口愈合情况及兔的一般状况。2周后手术伤口愈合，4~6周后，高尔夫练习球内已充满清亮的组织液（Tissue Cage Fluid，TCF），兔组织笼模型建立成功。实验前1天，用无菌注射器抽取球内液体0.5ml，取100μl铺于M-H琼脂平板上，37oC过夜培养，经检验无菌后，用于建立感染模型。实验当日，将3×107cfu/ml-3×109cfu/ml对数生长期金黄色葡萄球菌ATCC25923 1ml以生理盐水反复洗涤（3次）后，用无菌注射器往高尔夫练习球内注入。观察兔的一般情况及组织笼局部情况，细菌感染后24h开始抽取球内组织液0.5ml进行细菌菌落计数，细菌浓度在108cfu/ml以上者用于下一步实验。
2.2 组织笼内细菌浓度检测
细菌感染后24h、48h及72h分别从组织笼内抽取液体0.3ml，标本用生理盐水进行10倍系列稀释（1：101~1：107），分别取100ul涂布于大豆胰酶琼脂平板上，37oC孵育24小时，进行菌落计数。细菌浓度检测低限为100cfu/ml。
2.3 MIC和MPC测定
抽取球内含高浓度细菌（～1010cfu/ml）的组织液2ml，测定左氧氟沙星对在组织笼内增菌的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的MIC、MPC及耐药突变频率，并绘制菌落恢复生长曲线。（方法同第1部分）
结 果
1．兔组织笼感染模型
每只兔子皮下植入1个高尔夫练习球，2周后手术伤口愈合，4~6周后，高尔夫练习球内已充满清亮的组织液。将金黄色葡萄球菌ATCC25923注入高尔夫练习球后，兔子有发热，食欲减退及组织笼局部皮肤充血、皮温增高，部分动物局部皮肤肿胀。抽取组织液进行细菌培养，生长细菌为金黄色葡萄球菌，表明兔组织笼感染模型建立成功（图2-2），高尔夫练习球位于兔侧腹部。
2．组织笼内细菌浓度变化，见图2-3。
将3×107 -3×109cfu细菌注入8只兔子的组织笼内，均可见球内细菌数在感染后24h有101-103倍减少；48h略有恢复到1×106cfu/ml-4×107cfu/ml；之后迅速增长，到72h时，6只兔子的细菌浓度在108cfu/ml以上，其中1只兔子组织笼内细菌浓度达到最高2.1×1010cfu/ml，此时兔组织笼感染模型方可用于MPC的体内研究。而另2只兔子组织笼内细菌浓度分别为1.3×107cfu/ml和1.4×107cfu/ml。我们曾将1.5×105cfu/ml-1.5×107cfu/ml对数生长期金黄色葡萄球菌ATCC25923 1ml用无菌注射器注入6只兔子的组织笼内，进行了5天的观察，无1只兔子死亡。但仅注入1.5×107细菌的2只兔子在第3天和第4天时组织笼内细菌浓度分别达到8.0×108cfu/ml和6.0×108cfu/ml。注入1.5×106细菌的2只兔子到第5天球内细菌分别是1.0×103cfu/ml和3.0×102cfu/ml。而注入1.5×105细菌的2只兔子中，1只到第3天球内细菌已全部被清除，另1只在第3天时球内细菌浓度为1.0×102cfu/ml，到了第4天已无细菌生长。
3． 左氧氟沙星对体内、体外增菌的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的MIC、MIC99、MPC及菌落恢复生长曲线的测定，结果见表2-1
左氧氟沙星对体内增菌的ATCC 25923的MIC、MIC99和MPC分别为0.125μg /ml，0.1μg /ml 和0.8μg /ml，与测定体外富集细菌的结果完全一致。可见无论体内、体外增菌的ATCC 25923，左氧氟沙星对其抗菌活性和抑制下一步耐药突变株选择的能力相同。
4. 左氧氟沙星对体内、体外增菌的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的细菌恢复生长曲线，见图2-4
随着药物浓度逐渐增加，平板上恢复生长的菌落数出现两次明显下降。当药物浓度接近MIC时，琼脂平板中细菌恢复生长的菌落数出现第一次迅速下降；随后出现一个缓慢的下降，表现为一个小平台；药物浓度进一步增加，平板中恢复生长的菌落数出现第二次明显下降，直到到达一定浓度（即MPC），平板中无菌落生长。与通过37℃体外过夜震荡富集的细菌相比，组织笼内增殖的细菌使曲线略向右移动，其菌落数第二次明显下降发生在10-6左右，而体外富集细菌的小平台则在10-7左右，可见左氧氟沙星对体内生长细菌的耐药选择频率略高于体外富集细菌约10倍，但MPC并无变化。
讨 论
细菌发生耐药突变，并在有药物选择压力时，在菌群中得到选择性优势生长，是细菌产生耐药的必需条件。细菌自发突变的频率很低，仅为10-7(10-6～10-8)，细菌数量达到1014时，才可能出现同时发生两次耐药突变的菌株。同时由于临床实际中，人体感染部位细菌数量可达到1010cfu，但不可能达到1014cfu, 因此MPC测定中每个药物浓度的细菌接种总量是1010cfu[11]。以往实验采用37℃体外过夜震荡培养富集的细菌，来测定MIC和MPC，并以此值为依据，计算动物体内实验的PK/PD参数。但事实上，体内感染的细菌往往是逐步增长达到一定浓度，在此过程中，细菌的敏感性和突变频率是否发生改变还不得而知。因此需要测定体内增菌的MIC和MPC，来计算出预测防止耐药发生的PK/PD参数。
为获得在体内增长达到108cfu/ml-1010cfu/ml 的细菌量，首先建立兔组织笼模型，将高尔夫练习球植入兔腹侧皮下，植入过程中，兔皮下组织分离一定要充分，以减少切口张力；同时要注意无菌操作，防止切口及球内组织液的感染。组织笼较为局限固定，组织液又是良好的培养基，有利于细菌在体内增长，适合造成感染模型。对于注入球内细菌的量，可根据实验目的来决定。
从MIC、MIC99和MPC结果看，左氧氟沙星对体内、体外增菌的ATCC 25923的抗菌活性和抑制耐药突变株选择能力完全一致。从菌落恢复生长曲线可见，左氧氟沙星对体内增殖细菌的耐药选择频率是10-6，而对体外富集细菌的耐药选择频率是10-7，虽然体内增菌的突变发生频率是体外富集菌的10倍，但仍在细菌自发突变频率范围内(10-6～10-8)，提示细菌在体内增长，其敏感性没有发生改变。其原因主要是增菌过程中未行药物干预，没有抗菌素的选择压力，从而未引起耐药突变株的选择。这也进一步解释了左氧氟沙星对体内、体外增菌的MIC、MIC99和MPC结果一致的现象。
上述结果表明，使用体外富集细菌的MIC、MPC值，能够准确反映抗菌药物对体内增长细菌的敏感性及抑制耐药产生的能力。可用于计算动物体内实验的PK/PD参数。
【参考文献】
1. Zhao X, Drlica K. Restricting the selection of antibiotic-resistant mutant bacteria: measurement and potential use of the mutant selection window. J Infect Dis,2002, 185: 561-565.
2. Zhao X, Eisner W, Perl-Rosenthal N, et al. Mutant prevention concentration of garenoxacin (BMS-284756) for ciprofloxacin- susceptible and ciprofloxacin-resistant staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 2003,47:1023-1027.
论文作者:李朝霞1 ，谢玉英2 ，刘又宁3 ，王睿4 ，李爱民2
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/12
标签：细菌论文; 氧氟沙星论文; 浓度论文; 体外论文; 体内论文; 组织论文; 葡萄球菌论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;