1南京中医药大学 江苏省南京市 邮编210023
2南京中医药大学附属南京市中西医结合医院 江苏省南京市 邮编210014
*通讯作者：钮晓红教授，博士生导师，研究方向：淋巴结核的治疗及机理研究。
摘要
目的：使用瘰疬宁治疗颈部淋巴结核，通过观察患者外周血细胞因子水平的变化，研究瘰疬宁对颈部淋巴结核的治疗作用。
方法：将60例颈部淋巴结核患者按随机、双盲、平行对照的方法分为对照组和试验组，每组各30例。试验组与对照组均接受常规抗结核药物治疗，试验组在对照组基础上加用瘰疬宁胶囊治疗，另选取健康人30例。使用细胞因子芯片和ELISA测定试验组和对照组治疗前后细胞因子的变化，并与健康人做比较。
结果：试验组和对照组治疗前的细胞因子谱无明显差异，瘰疬宁胶囊治疗后的试验组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor ，GM-CSF)水平下降，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白介素13（interleukin-13，IL-13）、白介素24（interleukin-24，IL-24）等细胞因子的水平上升。GM-CSF和TGF-β两种细胞因子水平，在试验组治疗前和对照组治疗前之间均无明显差异，无统计学意义(P>0.05)；试验组和对照组在治疗前后，GM-CSF和TGF-β水平均有变化，均有统计学意义（p<0.05）。试验组治疗后GM-CSF水平下降接近于健康人，试验组治疗后TGF-β水平上升，对照组下降。
结论：瘰疬宁联合抗结核西药能加强抗结核菌作用，调节细胞免疫失衡，从而提高了治疗效果。
关键词：瘰疬宁; 颈部淋巴结核; GM-CSF; TGF-β; IL-13; IL-24
本课题项目来源：2014年度南京市科技计划项目 项目编号：201402039
结核病由结核分枝杆菌感染入侵引发的疾病，大多数为肺结核，其余的称为肺外结核，淋巴结核是最常见的肺外结核，约占结核病的10～20%[1]。
用常规抗结核药物治疗虽有效果，耐药性和药物的不良反应已成为治疗失败的主要原因。因此，联合中药治疗淋巴结核能有效地提高治疗效果和避免抗结核药的毒副作用。瘰疬宁胶囊为中药制剂，主要成分梓木草和夏枯草，梓木草40%以上醇提取部位对结核杆菌有抑菌作用[2]，夏枯草分单体中的成分检测出具有抗结核作用[3]，瘰疬宁胶囊已获得国家发明专利[4]。本试验主要研究瘰疬宁对颈部淋巴结核患者外周血细胞因子水平的影响。
1方法
1.1患者与样本
病例采集于南京中医药大学附属南京市中西医结合医院瘰疬科2017年11月－2018年6月的颈部淋巴结核患者60例。按照随机、双盲、平行对照的方法将病人分为试验组和对照组。另外选取健康人30例。按照中华医学会编著的《临床诊疗指南·外科学分册》[5]的诊断标准和治疗方案。对照组接受常规抗结核治疗，试验组在对照组基础上加用瘰疬宁胶囊治疗。以下情况的病例将被剔除：①长期或者正在服用抗结核药物的患者；②合并有各种基础疾病的患者；③患有恶性疾病的患者。入组患者均签署书面知情同意书。试验组与对照组每个患者在治疗前后均抽取外周血5ml；健康人组每人抽取外周血5ml。所有血液样本离心后取上清液，置于-81摄氏度低温保存。
1.2蛋白芯片Human Cytokine Antibody Array测定细胞因子谱
由中国上海康成生物科技有限公司提供的Raybiotech QAH-CAA-440细胞因子芯片测定试验组与对照组治疗前后以及健康人的细胞因子表达谱。
1.3 ELISA法定量测定细胞因子蛋白
使用ELISA试剂盒（南京安杰优生物科技有限公司，品牌：纪宁）定量检测每个患者治疗前后和健康人的血清细胞因子水平。具体操作按照实验说明书进行。所有的样品在检测前都被稀释到合适的浓度。
1.4统计分析
采用Graphpad Prism 7.0软件进行统计分析。以P<0.05表示具有统计学意义。*代表P<0.05，**代表P<0.01，ns(no significant difference)表示无显著性差异。
2.结果
瘰疬宁联合抗结核西药相比于纯西药治疗能有效地调节淋巴结核患者体内的细胞因子
2.1细胞因子芯片结果（图1）
①根据蛋白芯片标准值对上清样品进行分层聚类结果， A1和B1两个样本蛋白质整体相似度高。
②根据蛋白阵列结果，无论是否使用瘰疬宁，一些与炎症有关的细胞因子发生了不同程度的变化，试验组与对照组的这些细胞因子变化各有差异.一些促炎因子，如GM-CSF等的浓度在治疗后下降，试验组相比于对照组更接近于健康人组。一些抗炎因子，如IL-13、IL-24、TGF-β等在治疗后，试验组的浓度明显升高，而对照组升高不明显甚至降低。
▲A1试验组治疗前A2试验组治疗后；B1对照组治疗前B2对照组治疗后C健康人组；这些是同类型患者血清混合物。实验只进行了一次。分析每个样本细胞因子的变化。
2.2 ELISA定量检测结果（图2）
①试验组和对照组治疗前的GM-CSF和TGF-β水平的变化无统计学意义(P>0.05)，提示两组患者治疗前无明显差异。
②试验组与对照组在治疗前后，GM-CSF和TGF-β水平均有变化，均有统计学意义（p<0.05）。
③如图2A，两组GM-CSF水平均下降，试验组幅度较小，更接近于健康人组。
④如图2B,试验组TGF-β的水平在治疗后上升，接近于健康人，对照组下降。
3讨论
淋巴结结核具有迁延难愈、易复发的特点，颈部的淋巴结核中医称为瘰疬，疾病初期的症状是颈部一个或者多个淋巴结肿大[6]，不及时治疗局部的肿块也会化脓、破溃，最后形成日久难愈的窦道。根据世界卫生组织的报告[7]： 2017年大约有1000万人感染结核病，而耐药结核病是一个持续的威胁。2017年，全球约46万例耐多药结核病。结核病的治疗主要是抗结核药物三联或者四联治疗，这是最有效、基础的治疗方式，但它与许多不良药物反应(ADRs)有关，影响治疗效果[8]。相比于肺结核，淋巴结核需要更长的疗程，不良反应发生的可能性更大。最常见的不良反应包括肝炎, 皮肤的反应, 胃肠不耐受, 血液学反应和肾衰竭，这些不利影响必须及早发现, 以减少相关的发病率和死亡率[9]。临床上主要的不良反应是抗结核药对肝肾功能的损害，如果不及时发现与治疗，不仅影响治疗效果，而且会对结核病人造成更大的损害。
结核分枝杆菌是一种胞内菌，通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细胞导致结核病，它的胞内生活方式使其难以从宿主体内彻底清除，并导致慢性病。有研究表明结核分枝杆菌能通过分泌蛋白抑制巨噬细胞吞噬体成熟来逃离机体的免疫[10]。结核分枝杆菌感染还可以干预对杀菌作用和巨噬细胞超活化所需的宿主基因对的表达[11]，通过多种方式，结核分枝杆菌逃逸免疫追杀并且在宿主体内难以被清除。
结核病的转归不仅与结核分枝杆菌和巨噬细胞相互作用有关，还与人体自身免疫能力有关。通过吞噬作用巨噬细胞将结核分枝杆菌分解产生蛋白水解酶并将抗原呈递给T细胞[12]。随后T细胞分化为Th1和Th2细胞。以Th1细胞为主的免疫反应主要与组织损伤有关，主要分泌促炎症性的细胞因子。Th2细胞与体液免疫有关，其分泌的细胞因子具有抗炎作用。机体对抗结核分枝杆菌的前期Th1反应强烈，Th2反应在随后的免疫过程中逐渐增强，来避免过度的Th1反应对机体造成的损伤。
结核分枝杆菌入侵人体后，免疫系统发挥功能，促进炎症并吞噬、杀灭细菌，但是过度地激活和活化免疫系统会导致严重炎症反应发生，引起组织和器官的损伤并且失去控制。此时，由Th2细胞分泌的一类抗炎症性细胞因子通过抑制效应T细胞和巨噬细胞等的功能，对保持机体的免疫平衡发挥重要作用。这一类细胞因子主要作用是抑制免疫应答和抗炎症反应，这些不同的细胞因子不仅决定效应Th细胞的功能还参与相应细胞的活化与增值，发挥作用时互相拮抗[13]，最终使免疫应答类型发生转变，产生不同的免疫效应，表现为细胞免疫为主的免疫应答，有效清除细胞内寄生的病原体。结核患者体内Th1/Th2的相互关系决定着结核病的控制和发展[14]。
TGF-β能影响细胞的增殖和分化并且损害巨噬细胞的杀菌能力[15]，这一功能在疾病发展后期尤为重要。白介素10（interleukin-10，IL-10）也是由Th2细胞分泌的重要的抑炎因子与免疫抑制因子，能影响单核巨噬细胞释放免疫介质及和呈递抗原的功能，可以降低很多促炎症性因子的作用。IL-24属于IL-10家族的细胞因子[16]，有着相同的结构和序列以及免疫调节能力 [17]。
Wu等发现结核病人活动期血清白介素4（interleukin-4，IL-4）水平较低，而着可能会使患者病情恶化[18]。IL-13和IL-4都是T细胞分泌的细胞因子，在对人外周血单核细胞作用方面十分相似，都能降低炎症性细胞因子和趋化因子的合成。二者的作用是修复机体并且限制自身的损害，从而调节炎症免疫过程，使之不会过分激烈。
在颈部淋巴结核治疗前期，患者机体自身大量分泌促炎症的因子来帮助免疫系统清除感染，治疗结束后，随着患者体内结核分枝杆菌数量下降，依旧高水平的促炎症性因子会对机体造成免疫过激伤害，瘰疬宁治疗后的患者（试验组）抗炎症性因子TGF-β、IL-13、IL-24等的水平上调明显，有利于对机体的保护。
GM-CSF是由上皮细胞分泌可促进巨噬细胞的活化、增殖的细胞因子[19]。 GM-CSF可以促使多种细胞因子向炎症部位聚集，加重炎症反应。有体外试验表明：GM-CSF通过促进吞噬溶酶体融合和诱导一氧化氮等机制，促进结核分枝杆菌等清除和增强宿主对结核分枝杆菌感染等防御[20]。有试验证明GM-CSF对于肉芽肿的产生，以及对于结核分枝细菌生长的抑制是至关重要的，但是当GM-CSF过表达时，也会影响肉芽肿的形成[21]。在结核感染前期，GM-CSF数量迅速增殖，参与免疫反应，在治疗结束后，其数量逐渐下降，但因为结核菌的潜伏作用，机体内仍需保持一定浓度抑制结核菌，防止淋巴结核再次复发。本实验中，服用瘰疬宁的患者GM-CSF浓度在治疗后下降，接近于正常人，提示感染强度下降，疾病好转，而对照组浓度下降剧烈，远低于正常值，对结核菌的抑制作用降低，更容易复发。
综上所述，瘰疬宁能有利于清除体内结核分枝杆菌，又能缓解促炎症性因子的过度分泌带来的过高免疫反应，达到Th1和Th2细胞因子的平衡，增强对颈部淋巴结核的治疗作用。临床上使用瘰疬宁加抗结核西药同时治疗，可以提高对颈部淋巴结核的治疗效果并且能避免西药的不良反应。
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论文作者:施怡1 朱珠1,高金辉2 许费昀2 丁继果2 张丹2 李辉
论文发表刊物:《医师在线》2019年第01期
论文发表时间:2019/3/4
标签：细胞因子论文; 结核论文; 瘰疬论文; 分枝论文; 对照组论文; 淋巴论文; 患者论文; 《医师在线》2019年第01期论文;