摘要：本文涉及了一种酵母菌菌株，对该酵母菌菌株进行研究和实验，并通过相应的技术进行优化措施。通过实验的步骤和实验现象的研究，找到制作酵母菌菌株制备噬菌蛭弧菌制剂的方法。
关键词：噬菌蛭弧菌；生物制剂；实验
噬菌蛭弧菌是自然界的自净因子之一，在改变人们对抗生素的依赖、减少抗生素、化学消毒剂等的残留等方面将起到越来越大的作用。目前国内外绝大部分的噬菌蛭弧菌产品都是采用大肠杆菌为宿主菌，将大肠杆菌灭活后作为噬菌蛭弧菌的宿主这种生产工艺生产的，这种工艺存在几大问题：感染性强、风险较大、能量消耗大且功能单一
一、实验内容及步骤
（1）实验内容
本实验的第一个目的是提供了一种酵母菌菌株，该菌株可作为噬菌蛭弧菌的宿主。本实验的第二个目的提供一种用上述酵母菌菌株制备噬菌蛭弧菌制剂的方法。该制备方法简化了噬菌蛭弧菌的生产工艺，进而达到节能减排的效果。
（2）实验步骤
本实验的第一个目的提供的酵母菌的新菌株（Saccharomyces sp.）XD03S，它具有作为噬菌蛭弧菌寄生宿主的能力。该酵母菌的新菌株XD03S已经于2010年1月29日在中国典型培养物保藏中心保藏，并收到保藏登记号CCTCC NO：M 2010036。
本实验第二个目的通过以下技术措施来实现：一种用上述酵母菌菌株制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其包括以下步骤：
（1）蛭弧菌的纯化：以大肠杆菌为靶细胞，采用液体培养和双层自来水琼脂相结合的方法从自然界中分离噬菌蛭弧菌基础菌株，然后采用单个菌斑传代法结合液体培养和双层自来水琼脂法进行至少10代的连续单个菌斑传代纯化，得到噬菌能力强的噬菌蛭弧菌纯系菌株；
（2）将步骤（1）中所得的噬菌蛭弧菌纯系菌株与酵母菌菌株XD03S（CCTCC NO：M 2010036）进行复合培养得到噬菌蛭弧菌制剂。
本发明所述的步骤（2）中的复合培养中优选使用的培养基采用：糖蜜5~20克、蛋清粉2~5克、水1000毫升，PH条件为3.3-7.8。
本发明所述的步骤（2）中的复合培养的温度为23~36℃。
本发明所述的步骤（2）中噬菌蛭弧菌纯系菌株与酵母菌菌株XD03S进行培养的时间优选1~5天。仅用噬菌蛭弧菌纯系菌株与酵母菌菌株XD03S进行培养得到的噬菌蛭弧菌制剂的功能较为单一，因此发明人筛选出能与酵母菌菌株XD03S共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌，建立用上述酵母菌菌株制备噬菌蛭弧菌制剂的同位培养方法，旨在得到功能较为全面的噬菌蛭弧菌制剂。所述的方法具体如下：
（1）蛭弧菌的纯化：以大肠杆菌为靶细胞，采用液体培养和双层自来水琼脂相结合的方法从自然界中分离噬菌蛭弧菌基础菌株，然后采用单个菌斑传代法结合液体培养和双层自来水琼脂法进行至少10代的连续单个菌斑传代纯化，得到噬菌能力强的噬菌蛭弧菌纯系菌株；
（2）以酵母菌菌株XD03S（CCTCC NO：M 2010036）分别与乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌进行复合培养，筛选出能与酵母菌菌株XD03S（CCTCC NO：M 2010036）共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌；
（3）将步骤（2）中所得的能与酵母菌菌株XD03S（CCTCC NO：M 2010036）共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌以及酵母菌菌株XD03S（CCTCC NO：M 2010036）先进行复合培养，然后再接种步骤（1）中所得的噬菌蛭弧菌纯系菌株继续进行培养得到噬菌蛭弧菌制剂。
本发明所述的步骤（2）和步骤（3）中的复合培养中优选使用的培养基采用：糖蜜5~20克、蛋清粉2~5克、水1000毫升，PH条件为3.3-7.8。
本发明所述的步骤（2）和步骤（3）中的复合培养的温度为23~36℃。
本发明所述的步骤（3）中能与酵母菌XD03S（CCTCC NO：M 2010036）共生的乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌以及酵母菌XD03S（CCTCC NO：M 2010036）进行复合培养的时间优选1~4天。
本发明所述的步骤（3）中接种步骤（1）中所得的噬菌蛭弧菌纯系菌株后继续进行培养的时间优选1~5天。
二、实验结果的优越性
本实验提供的酵母菌菌株（Saccharomyces sp.）XD03S（CCTCC NO：M 2010036）是一种益生菌，具有作为噬菌蛭弧菌寄生宿主的能力。采用该酵母菌菌株制备噬菌蛭弧菌制剂，简化了生产工序，且保障了生产安全。本实验通过共生培养，得到的复合型噬菌蛭弧菌制剂，该不仅具有噬菌蛭弧菌，同时还有益生菌与其共生，能够同时发挥噬菌蛭弧菌对致病菌的吞噬作用和益生菌的调节作用。增强了噬菌蛭弧菌制剂的功能，将大大促进和加速其推广应用。把噬菌蛭弧菌作为一种“活的抗生素”运用前景非常广阔。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆本实验的复合型噬菌蛭弧菌制剂产品已经在广东省、海南省、福建省等地进行了大面积的中试推广，经过多中证明，提高了鱼、虾等水产的成活率，深受养殖户的欢迎，对提高他们的养殖成功率起到了关键性的作用。
三、具体实施方式
（1）原料的准备：
1）水样的采集
收集养殖塘中取水样，底泥，封存准备作为噬菌蛭弧菌基础菌株的分离试验的菌源。
2）宿主菌的制备
从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买大肠杆菌C600作为前期宿主菌，把C600分别制成C600菌悬液，3500r/min离心成菌泥，并把菌泥制成1010cfu/ml菌悬液，一部分不灭菌即活菌泥C600，一部分灭菌即灭活菌泥C600，处理完后放入4度冰箱保存待用。
（2）蛭弧菌的分离
采用液体培养和双层自来水琼脂相结合的方法进行分离：
1）取300ml C600的菌悬液、300ml活菌泥C600和300ml灭活菌泥C600分别装在不同的三角瓶中。把所得的水样一部分在3000r/min离心15min，取上清液分别加入到三角瓶中的C600的菌悬液、活菌泥C600和灭活菌泥C600中进行培养，每瓶加入20ml上清液，重复三次，在28-32℃的温度下静置培养4-6天，再把培养好的菌液在3000r/min下离心15min，取上清液用双层自来水琼脂法做菌斑分离实验；
2）取300ml C600的菌悬液、300ml活菌泥C600和300ml灭活菌泥C600分别装在不同的三角瓶中。把所得的水样分别加入到三角瓶中的的C600的菌悬液、活菌泥C600和灭活后的C600中进行培养，每瓶加入20ml上清液，重复三次。在28-32℃的温度下静止培养4-6天。再把培养好的菌液在3000r/min下离心15min，取上清液用双层自来水琼脂法做菌斑分离实验；
3）双层自来水琼脂法：下层用灭菌的1.7%自来水琼脂倒入直径18cm灭菌的培养皿中，50ml/皿，凝固后放入45度左右的恒温箱中保温3h左右，上层把灭菌的0.8%自来水琼脂粉培养基分装到比色管，7ml/管，再加入灭活后的C600的菌泥0.8ml，放在45度左右的水浴锅中保温，最后将在3000r/min离心15min的水样上清液0.5ml加入到40度左右的比色管中摇匀后迅速倒入准备好的底层培养基上，使其均匀分布在上面，凝固后放入28度左右的恒温箱倒置培养4-6天，连续观察；
（3）蛭弧菌的纯化
利用大肠杆菌C600为宿主，采用单个菌斑传代法结合液体培养和双层自来水琼脂法进行反复纯化得到噬菌蛭弧菌的基础菌株，由于菌种不纯，培养出来的噬菌斑不纯，菌斑小，不清晰，因此需要对野生菌株进行纯化选育。利用液体培养和双层自来水琼脂相结合的方法进行10代连续的单个菌斑传代，选育出形成噬菌斑大，菌斑清晰，菌斑形成时间短的蛭弧菌菌株（Saccharomyces sp.）XD03。
（4）非大肠杆菌宿主的筛选
利用XD03分别以3株乳酸菌，3株酵母菌，8株芽孢杆菌为宿主，利用单个菌斑传代法结合液体培养和双层自来水琼脂法进行驯化培养，筛选出能够形成菌斑的宿主，每次挑起噬菌斑大，菌斑清晰，形成菌斑时间短的菌斑进行下一次筛选实验，经过12代连续的单个菌斑传代，筛选出一株酵母菌，能够达到形成噬菌斑大，菌斑清晰，菌斑形成时间短的目标，我们将这株酵母菌命名为XD03S（CCTCC NO：M 2010036）。
（5）复合宿主的筛选
取3株酵母菌XD03S（CCTCC NO：M 2010036）分别与3株乳酸菌，2株酵母菌，8株芽孢杆菌益生菌的复合培养实验，筛选能与XD03S共生的菌株，最后筛选出能与XD03S共生的1株乳酸菌、1株酵母菌、1株芽孢杆菌，将这三株菌进行复合培养得到复合宿主菌，上述复合培养的培养温度为23℃，PH条件为3.3，培养基为：糖蜜5克、蛋清粉2克、水1000毫升。
（6）噬菌蛭弧菌制剂的培养
本步骤采用培养基为：糖蜜5克、蛋清粉2克、水1000毫升，PH条件为3.3。以1株酵母菌XD03S（CCTCC NO：M 2010036）与步骤（5）中得到可与酵母菌XD03S（CCTCC NO：M 2010036）共生的1株乳酸菌、1株酵母菌和1株芽孢杆菌作为复合宿主菌接种至培养基中，先在23℃温度下，PH条件为3.3的条件下进行培养1天，然后再接种步骤（3）中得到的噬菌蛭弧菌XD03菌种，然后在23℃温度下，PH条件为3.3的条件下进行培养1天，得到噬菌蛭弧菌制剂。
结束语
大量的实验数据表明噬菌蛭弧菌制剂在养殖水体中应用不仅对控制致病性细菌有较好的作用，对稳定养殖水质，调节样子微生态环境也有良好的作用。对照养殖塘一所采用的普通噬菌蛭弧菌对控制致病性细菌有较好的作用，但是由于其中没有有益菌的作用，没有调节微生态平衡、稳定水质的菌种，养殖过程中水质不够稳定，由水质引起的死亡现象时有发生。因此在养殖过程中应当进行预防工作。
参考文献：
[1]山浩虹.噬菌蛭弧菌研究新进展[J].江苏农业科学，2006年（05）
论文作者:杨雄
论文发表刊物:《基层建设》2019年第19期
论文发表时间:2019/9/21
标签：弧菌论文; 酵母菌论文; 菌株论文; 琼脂论文; 宿主论文; 步骤论文; 制剂论文; 《基层建设》2019年第19期论文;