辽宁省盘锦市辽河油田总医院渤海院区肿瘤放疗科，邮编124010
【摘要】 目的 研究白藜芦醇对NCI-H28细胞增殖及侵袭力的影响。方法 0、10、20、40、80 mol/L白藜芦醇处理NCI-H28细胞，以0 mol/L白藜芦醇作为对照组。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定NCI-H28细胞增殖水平（3T3细胞为对照）；流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡；体外黏附实验测定细胞黏附率；Transwell小室测定细胞侵袭力，荧光免疫细胞化学方法测定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的表达。 结果 白藜芦醇以剂量依赖和时间依赖方式抑制NCI-H28细胞增殖并促进其凋亡，经20μmol/L白藜芦醇处理48h后，细胞周期被阻滞在S期。白藜芦醇可引NCI-H28细胞的异质性黏附力下降，侵袭力降低，与对照组比较有明显区别，同时细胞内MMP-2蛋白表达下调，而TIMP-2蛋白表达增加。结论 白藜芦醇抑制NCI-H28细胞增殖，并具有抗肿瘤细胞侵袭作用，其机制可能涉及对MMP-2/TIMP-2表达的双向调控。
【关键词】 白藜芦醇；肺肿瘤；细胞增殖；细胞黏附；细胞侵袭；
恶性胸膜间皮瘤是一种恶性程度高的疾病，确诊时往往已到了Ⅲ至Ⅳ期，手术、放疗等局部治疗难以达到治疗目的。因此，恶性胸膜间皮瘤的治疗仍以内科治疗为主，植物抗毒素白藜芦醇能够抑制前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的生长[4]。本实验主要研究白藜芦醇对恶性间皮瘤细胞NCI-H28增殖、侵袭的影响。
1 材料与方法
1.1 实验试剂与细胞株
实验用细胞购自北纳生物；人新生小牛血清购自美国Gibco公司；白藜芦醇购自美国Singma公司，纯度99.8%；人工基底膜（Matrigel）购自美国BD公司。MMP-2、TIMP-2购自美国Sant Cruz公司，AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。
1.2 MTT法检测白藜芦醇对NCI-H28细胞及3T3细胞增殖的影响
取对数生长期NCI-H28细胞和3T3细胞调整为5×104个/ml的细胞悬液，96孔板每孔接种200μL，加入不同浓度的白藜芦醇，分别培养24、48、72h，每孔加入5 mg/ml的MTT 10 l，作用4h后弃上清，每孔加100 l DMSO，震荡10min后通过酶标仪测定吸光度（A）值，细胞增殖率(%)＝实验组A值/对照组A值×100%。
1.3 流式细胞术检测白藜芦醇对NCI-H28细胞凋亡与细胞周期的影响
取对数生长期NCI-H28细胞分别经不同浓度的白藜芦醇作用48h后，经消化、离心，调整细胞浓度为1×106/ml。按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒说明操作，运用FACS Calibur流式细胞仪进行测定。
1.4 matrigel胶检测白藜芦醇对NCI-H28细胞的黏附影响
NCI-H28细胞经不同浓度的白藜芦醇处理24h后，胰蛋白酶消化配制为5×105个/ml细胞悬液，接种于已铺好matrigel胶的96孔板中，每孔100μL，于CO2培养箱中培养1h，去掉培养液，每孔加MTT 10 mL，作用4h后，每孔加100 l DMSO，震荡10min后通过酶标仪测定吸光度（A）值，细胞的黏附率（%）＝白藜芦醇组A值／对照组A值×100%。
1.5 transwell检测白藜芦醇对NCI-H28细胞侵袭的影响
NCI-H28细胞经分组处理后，每transwell小室上层接种5×104个细胞， 0.1%BSA-1640无血清培养液培养，下层加500 μl 10%胎牛血清培养基，培养24h，用棉签拭去小室滤膜上面的细胞，95%乙醇中固定10min，结晶紫染色，置倒置显微镜下随机计数5个视野膜下面的细胞数并拍照，细胞侵袭率（%）=白藜芦醇组膜下细胞数/对照组膜下细胞数×100%。
1.6 荧光免疫细胞化学法检测NCI-H28细胞中MMP-2、TIMP-2的表达水平
取对数生长期细胞经不同浓度的白藜芦醇处理48h，消化后配制成NCI-H28细胞爬片，按细胞免疫荧光化学反应步骤操作。
1.7 统计学分析
实验数据应用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布使用±s表示，实验组和对照组的组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05代表差异有统计学意义，进一步两两比较采用LSD检验，检验水准α=0.05。
2 实验结果
2.1 白藜芦醇抑制NCI-H28细胞的增殖
结果表明，白藜芦醇对NCI-H28细胞增殖的影响与药物浓度和作用时间有关。低浓度对NCI-H28细胞增殖无显著影响（P>0.05）。当浓度大于20 mol/L时，能明显抑制NCI-H28细胞的增殖，并呈显时间、剂量依赖性，见表1。白藜芦醇对3T3细胞增殖无显著抑制作用（P>0.05），见表2。
2.2 白藜芦醇诱导NCI-H28细胞凋亡
NCI-H28细胞经10、20、40、80μmol/L浓度的白藜芦醇处理48h后，凋亡率分别为（35.10±0.45）%、（43.87±0.45）%、（50.12±0.45）%和（67.05±0.51）%，对照组为（1.02±0.43）%，5组间差异有统计学意义（F=21.032，P=0.002）,各白藜芦醇组细胞凋亡率较对照组差异有统计学意义（P<0.01）。
图.1 各组NCI-H28细胞凋亡状况 A为对照组; B为10 μmol/L; C为20 μmol/L; D为40 μmol/L; E为80 μmol/L
2.3 白藜芦醇对NCI-H28细胞周期阻滞的影响
NCI-H28细胞经过不同浓度（0、10、20、40、80 mol/L）的白藜芦醇处理48h后，细胞周期被阻滞在S期，对比对照组均显著升高（P=0.029;P=0.018;P=0.007;P=0.013;），Res浓度至20 μmol/L时，S期细胞比例达到高峰；当浓度升高为40 μmol/L和80 μmol/L时，G2-M细胞显著减少，分别为(7.45±0.51)%和(5.12±0.48)%，与对照组比较有显著差异(P=0.029;P=0.007)，图2）。
图.2 各组恶性间皮瘤NCI-H28细胞细胞周期状况 A为对照组; B为10 mol/L; C为20 mol/L; D为40 mol/L; E为80 mol/L
2.4 白藜芦醇对NCI-H28细胞黏附抑制效应
随着白藜芦醇浓度的增加，NCI-H28细胞黏附率逐渐下降，20、40和80μmol/L的白藜芦醇处理后的黏附率分别下降了（12.1±0.021）%、（27.9±0.032）%和（31.6±0.036）%，与对照组比较有统计学意义（P=0.037，P<0.001，P<0.001）。10μmol/L白藜芦醇对NCI-H28细胞粘附有抑制作用，但与对照组比较无统计学意义（P=0.23）。
2.5 白藜芦醇对NCI-H28细胞侵袭力抑制的影响
NCI-H28细胞经不同浓度白藜芦醇处理24h后，白藜芦醇＞20μmol/L时，NCI-H28细胞侵袭力呈现不同程度的下降，与对照组比较有显著差别（P<0.01），白藜芦醇≥40μmol/L时侵袭力下降尤为明显，各组间比较有统计学意义（P<0.01）。其结果表明，白藜芦醇对细胞侵袭有抑制作用，并呈浓度依赖性，见图4。
2.6 白藜芦醇对NCI-H28细胞MMP2、TIMP2蛋白表达的作用
荧光免疫细胞化学染色结果显示，NCI-H28细胞经白藜芦醇处理24h后，随着其浓度的升高MMP-2蛋白表达水平逐渐下降，当白藜芦醇浓度>40 μmol/L时抑制作用尤为明显。TIMP-2蛋白的表达模式则相反，随着白藜芦醇浓度升高其表达水平提高，白藜芦醇浓度为20μmol/L时，TIMP2蛋白的表达明显升高，见图5。
3 讨论
白藜芦醇可通过阻滞细胞周期、诱导凋亡、抑制DNA的合成、p53过表达和干扰相关信号转导通路等多种机制抑制肿瘤细胞增殖[6-10]。本次研究结果表明，低浓度白藜芦醇和较短作用时间（＜48h）对NCI-H28细胞增殖及周期无明显影响（P＞0.05），当浓度升高至20μmol/L以上，NCI-H28细胞增殖逐渐受到抑制，与对照组比较有统计学意义（P＜0.05），经白藜芦醇处理后细胞周期被阻滞在S期；但研究发现白藜芦醇即使在高浓度（80μmol/L）时对3T3细胞增殖活性亦无影响，各实验组与对照组比较无统计学意义。
侵袭和转移是恶性肿瘤最本质的特征和最普遍的一种生物学行为。目前研究，白藜芦醇抑制肿瘤细胞转移的报道尚少，本研究结果显示白藜芦醇作用较短作用时间（<24h）对NCI-H28细胞增殖影响较小，但已能显著抑制NCI-H28细胞与基底膜的黏附力和侵袭能力。当白藜芦醇浓度20、40、80μmol/L的能显著抑制NCI-H28细胞与Matrigel的黏附和穿越Matrigel的作用，并与白藜芦醇剂量有关。
基质金属蛋白酶及其抑制剂与肿瘤的侵袭及转移关系密切，本次实验结果显示，NCI-H28恶性间皮瘤细胞MMP-2表达高，而TIMP-2表达低，白藜芦醇能够显著抑制NCI-H28细胞中MMP-2的表达，同时上调TIMP-2的表达，使MMP-2/TIMP-2比值明显降低，这一结果提示，白藜芦醇通过对MMP-2/TIMP-2表达的双重调控，可抑制NCI-H28细胞与基膜的黏附和对基膜降解，降低NCI-H28细胞的侵袭力，从而抑制肿瘤细胞的转移活性。
综上所述，本研究通过体外实验证实白藜芦醇具有抑制恶性间皮瘤的增殖和转移作用，下调恶性间皮瘤NCI-H28细胞MMP-2的表达，同时上调TIMP-2的表达,可能是白藜芦醇抑制恶性间皮瘤转移的机制之一，白藜芦醇是化学防癌剂，生物学作用广泛，白藜芦醇对肿瘤细胞增殖、侵袭、转移的抑制作用可能为肿瘤治疗提供新的方法[19-20]，但其作用机制有待进一步明确。
参 考 文 献
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论文作者:陈海霞
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第12期
论文发表时间:2019/2/26
标签：细胞论文; 浓度论文; 抑制论文; 间皮瘤论文; 作用论文; 对照组论文; 统计学论文; 《世界复合医学》2018年第12期论文;