阎超华[1]1997年在《丁基苯酞的抗脑缺血作用及其机制研究》文中研究指明缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，对人类危害极大。近三十年来神经科学家们投入大量的人力、财力、物力对缺血性脑损伤进行研究，企图阐明这一疾病的病理生理及生化机制，并试图找到一种行之有效、疗效确实的治疗方法，但目前尚未实现这一目标。 丁基苯酞(NBP)是我组近年来研制的一个新型抗脑缺血药物，动物实验证明，NBP能缩小大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)后脑梗塞面积，改善神经功能缺失症状，减轻脑水肿，改善能量代谢，防治自发性高血压脑卒中型大鼠的脑卒中。为进一步探讨NBP的抗脑缺血作用及作用机制，我们用生理、生化、放射免疫、组织细胞培养、电镜观察、高效液相(HPLC)、分子生物学等不同的实验方法，从整体动物、组织器官、细胞分子及基因调控等不同水平研究了NBP的抗脑缺血作用及其作用机制，主要结果如下： (1)应用原代培养大鼠胎鼠皮层神经元的方法发现，d-NBP(1～100μM)和l-NBP(1～100μM)均能剂量依赖性地抑制N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA，30μM)、KCl(20mM)或低糖低氧诱导的大鼠皮层神经细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的释放，降低细胞死亡率，改善受损细胞的形态，抑制神经细胞内多聚核糖体的解聚。 (2)应用氢清除法连续测定大鼠一侧纹状体脑血流量(rCBF)的方法发现，dl-NBP能在不影响动物平均动脉压的情况下增加正常大鼠纹状体的脑血流，改善脑供血，并能使MCAO大鼠减少的局部脑血流显著增加，其作用至少持续3h，而且预防给药或治疗给药，ip或ig同样有效。 (3)用高压液相荧光检测(HPLC-FD)的方法发现，d-NBP(0.1～100μM)能剂量依赖性增加大鼠皮层及小脑突触体胞浆内的原生型NO合酶(cNOS)活性，使L-胍氨酸的生成量明显增加，而对缺血再灌后诱导的诱生型NO合酶(iNOS)活性无明显作用；相反，l-NBP则与NO合酶(NOS)抑制剂L-NAME(0.1～100μM)相似，既能剂量依赖性地抑制脑组织内cNOS活性，又能抑制脑缺血再灌诱导的iNOS活性。我们用原代培养大鼠小脑细胞及皮层胶质细胞的方法同样观察到d-NBP(0.1～100μM)能剂量依赖性增加cNOS活性，对LPS诱导的iNOS活性无明显影响；而l-NBP和L-NAME则既能抑制cNOS活性，又能抑制iNOS活性。
常青[2]2002年在《手性丁基苯酞抑制脑缺血诱导的凋亡及消旋丁基苯酞对离子通道作用的研究》文中研究说明丁基苯酞(3-n-butylphathlide，NBP)，是医科院药物所研制开发的一类新型抗脑缺血药物。s-(-)-NBP最初是从芹菜籽中提取的一种有效成分，因其具有一手性活性中心，本所合成室已成功地合成了消旋体[(±)-NBP]，并经拆分获得了一对光学异构体—左旋及右旋丁基苯酞[s-(-)-NBP和r-(+)-NBP]。大量研究证实，NBP具有缩小脑梗塞面积，改善脑能量代谢，增加局部脑血流量，减轻脑水肿，改善学习记忆障碍，减轻线粒体损伤等作用。目前(±)-NBP已进入Ⅲ期临床试验阶段。越来越多的研究证实，凋亡在轻、中度暂时性脑缺血损伤所致的神经细胞迟发性死亡过程中起重要作用。而近年来线粒体在细胞凋亡机制中的作用日益引起人们的重视。位于线粒体外膜上的Bcl-2家族蛋白可调控线粒体膜通透性改变，和／或调控致凋亡蛋白如细胞色素C的释放，细胞色素C从线粒体释放至胞浆后通过参与caspase-9和caspase-3的裂解激活而诱导细胞凋亡。我们以前的研究发现(±)-NBP能够显著抑制低氧低糖诱导的大鼠皮层神经元凋亡。由于药物的光学活性与药物的作用及毒性有密切关系，研究和开发手性药物是当代新药研究与开发中为寻找高效低毒药物而提出的一条新思路。顺应开发光学活性药物这一新思路，我们采用治疗给药的方式从整体水平观察并比较了s-(-)-，r-(+)-，和(±)-NBP对暂时性局部脑缺血诱导的凋亡的影响，并着重观察了手性NBP对暂时性脑缺血后细胞色素C释放，caspase-3激活以及Bcl-2／Bax蛋白表达的影响。 在从脑缺血发生到细胞死亡的一系列级联反应过程中，离子通道起着极
徐皓亮[3]1999年在《消旋和光活丁基苯酞对血栓形成、脑微循环障碍及脑缺血后炎症的作用及其机理研究》文中认为脑卒中是仅次于心血管疾病及癌症的一种重要的致死因素。许多脑卒中后的幸存者，由于在运动能力、情绪、智力上的损伤，遭受极大痛苦。这些人需要护理和治疗的费用极为昂贵。目前，国内外虽已开展了大量的研究工作，但迄今为止，尚未找到能够有效减轻其临床症状的药物。为了减少脑卒中致残人数并提高脑卒中患者的生活质量，寻找和开发新型抗脑缺血药物刻不容缓。 丁基苯酞(3-n-butylphathlide，NBP)，是我所开发研制的一类新型抗脑缺血药物，为芹菜籽挥发油中内酯化合物，它具有光学活性基团，天然状态为左旋体。本所杨靖华教授已成功地合成了消旋体(d1-3-n-butylphathlide，d1-NBP)，并拆分获得了左旋及右旋丁基苯酞(1-NBP和d-NBP)。目前丁基苯酞正处于Ⅱ期临床实验阶段，通过随机，双盲，安慰剂对照试验，对60例急性缺血性脑卒中患者(药物与安慰剂组各30例)的治疗结果表明，NBP有较好的临床效果，是一个极具开发应用前景的药物。我组已对丁基苯酞的药理作用机制进行了多年细致深入的研究。结果表明，丁基苯酞具有增加MCAO后局部脑血流量，缩小脑梗塞面积，改善能量代谢，减轻脑水肿等作用。 本部分工作主要研究了NBP对血栓形成，血小板功能，脑微循环状态，血管活性物质生成及脑缺血后炎症反应的影响，进一步阐述NBP抗脑缺血的药理作用及其机制。 本论文的主要研究结果如下：
彭英[4]2004年在《左旋丁基苯酞抗脑缺血和抗老年痴呆的药理作用及机制研究》文中进行了进一步梳理丁基苯酞(或丁苯酞，3-n-butylphathlide，NBP)是中国医学科学院药物研究所研制开发的一类新型抗脑缺血药物，对急性缺血性脑卒中有明显疗效。2002年9月已被国家食品药品监督管理局(SFDA)批准为治疗急性缺血性脑卒中的一类新药。本研究组对该化合物进行了十多年的研究，发现它有多方面的药理学活性。近年来，左旋丁基苯酞(l-NBP)和右旋丁基苯酞(d-NBP)已经被拆分。并且从以往研究发现，d-NBP对l-NBP有拮抗作用。 既往研究发现，丁基苯酞能改善缺血区局部脑血流，抑制自由基的产生，抑制炎症反应，提高胆碱乙酰基转移酶的活性，抑制神经细胞凋亡，保护缺血缺氧引起的神经细胞损伤。这些机制均与老年痴呆的发生有关。然而手性丁基苯酞是否对老年痴呆的行为和病理改变有改善作用值得深入研究。本研究观察了手性丁基苯酞抗脑缺血和抗老年痴呆的药理作用，并对其机制进行了探讨。本工作分为以下几个方面： 第一部分 左旋丁基苯酞对暂时性局部脑缺血大鼠脑梗塞体积及对血小板聚集和血栓形成的影响 一．左旋丁基苯酞对暂时性局部脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响 应用插线法造成大鼠暂时性局部脑缺血模型，并通过测定脑梗塞体积和行为学评分，比较了l-NBP和d-NBP对局部脑缺血的保护作用。结果发现，l-NBP组脑梗塞体积明显缩小，而且存在剂量效应关系。其中40mg/kg组作用最强，缩小梗塞体积达80.4％，治疗效果接近于MK-801组(81.8％)。d-NBP和dl-NBP组作用较弱。并且l-NBP 20和40 mg/kg组的作用明显大于dl-NBP 40和80mg/kg组。行为学评分与脑梗塞体积的结果相吻合。本实验提示，dl-NBP中l-NBP抗脑缺血作用较强，而d-NBP不仅作用弱，而且拮抗l-NBP的抗脑缺血作用，因此有理由开发l-NBP成为一个新的治疗急性缺血性脑卒中的药物。
吴丽蓉[5]2007年在《丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧炎性损伤及机制》文中研究表明背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验和临床研究,使人们对脑缺血损害及药物干预等的认识不断深化,针对该病的不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改观,但该病的治疗仍未取得理想效果。因此,寻找新的、针对性的治疗靶点和策略很有必要。目前,对缺血性/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、线粒体损伤、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,缺血/再灌注后的炎症反应是研究的热点。神经元是神经系统的形态和功能单位,具有感受体内、外刺激传导冲动和整合信息的能力。神经元数量庞大,约有1011个,它们通过突触彼此连接,形成复杂的神经网络和通路。脑的不同部位和不同的细胞对缺氧的敏感性不尽相同。各类细胞对缺氧敏感性由高到低依次为:神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞。脑缺血、脑损伤等多种神经疾病均涉及到神经元的损伤,尤其在脑缺血时,在缺血中心区和半影区存在大量的神经元变性、死亡。神经元作为神经功能的主要承载者和体现者,保护其结构和功能是十分重要的。众多试验表明,脑缺血后ICAM-1、iNOS的表达增强。同时发现,在脑血管疾病尤脑缺血时可引起NF-κB的活化,活化的NF-κB可上调细胞因子、粘附分子、炎性蛋白酶等的表达,造成缺血脑组织的炎性反应加剧,细胞的通透性增高,细胞基质破坏,血脑屏障破坏等最终导致神经元坏死。多数学者认为NF-κB是炎症反应的中心环节。靶向NF-κB的抗炎治疗成为国内外学者的研究热点。恩必普(通用名丁基苯酞软胶囊,NBP)是我国研发的治疗脑血管疾病的一类新药。恩必普的主要成分丁基苯酞是从我国南方的一种水芹籽中提取出来的有效成分,可分为左旋丁基苯酞(l-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)及消旋丁基苯酞(dl-NBP),有全新的作用机理,可以增加缺血区的脑血流,重建缺血区微循环,缩小脑梗塞面积,保护线粒体,改善脑缺血后能量代谢,减轻局部脑缺血所致的脑水肿等。有研究提示丁基苯酞可以明显降低缺血再灌时脑损伤区的中性粒细胞数目,并可以抑制缺血区的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的升高,d-NBP还可以降低低氧/复氧、IL-1所致的中性粒细胞-内皮细胞粘附,l-NBP能够明显抑制iNOS表达和NO的合成。丁基苯酞(NBP)是否可以通过抑制NF-κB的活化,进而影响其靶基因的转录抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达发挥抗炎作用而保护神经元,是我们研究的重点。目的:(1)探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法并对之进行形态学观察;(2)建立一种方便、稳定、可靠的体外细胞氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)/复氧(reoxygenation)模型(3)通过该模型,研究神经元在氧糖剥夺/复氧后NF-κB p65的表达、活化的动态规律;(4)研究NBP对神经元在该模型条件下细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法:取Wistar大鼠乳鼠脑组织,采用筛网过滤、胰酶酶消化、离心等技术获取大脑皮质神经元并进行培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学进一步鉴定,采用细胞培养、MTT法、酶学检查、光学显微镜等研究和评价氧糖剥夺模型;采用MTT法、酶学检查观察丁基苯酞的保护作用;采用免疫细胞化学和RT-PCR方法研究NF-κB的动态变化及丁基苯酞对其靶基因蛋白ICAM-1、iNOS表达的影响。结果:(1)经形态学、免疫细胞化学(NSE)鉴定所培养的细胞为神经元;(2)OGD前后细胞形态结构变化显著,MTT法及乳酸脱氢酶的释放量测定均提示神经元损伤随氧糖剥夺时间呈时间依赖关系,与正常对照组有显著差异(P<0.05);(3)免疫细胞化学显示神经元的NF-κB p65蛋白表达在OGD4h时开始明显增加(P<0.05);R4h、R8h逐渐增加,R8h时达到高峰(P<0.05);R12h时有所下降,但仍高于正常组(P<0.05);R24h时进一步下降,稍高于正常组,与正常组无显著性差异(P>0.05)。NF-κB核转位细胞R8h达到高峰,与正常对照组有显著差异(P<0.05),且各组间(R4h、R8h、R12h、R24h)差异显著(P<0.05)。OGD/R前NF-κB p65大多数集中于胞浆,细胞呈“空泡”现象,OGD/R后NF-κBp65大多数集中于胞核,细胞呈“实心”现象;(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH的释放(P<0.05);(5)免疫细胞化学及RT-PCR检测到在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可显著降低神经元表达ICAM-1、iNOS(P<0.05);(6)不同剂量丁基苯酞(100μmol/l、10μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l)在增加细胞活力、减少LDH的释放及降低神经元表达ICAM-1、iNOS等方面,高浓度组与低浓度组有统计学差异(P<0.05),且丁基苯酞100μmol/l组与PDTC 100μmol/l组有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)成功培养出数量多、纯度高的神经元;(2)建立了一种简便、稳定和可靠的体外大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧模型;(3)氧糖剥夺导致神经元NF-κB的快速活化,NF-κB p65蛋白表达在氧糖剥夺4h到复氧24h逐渐升高,复氧8h核转位率最大(P<0.05);(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞对神经元有保护作用。(5)丁基苯酞各浓度组均可抑制NF-κB的活化,可能通过影响其靶基因的转录而抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达,从而有效保护氧糖剥夺/复氧中损伤的大脑皮质神经元。(6)丁基苯酞各浓度组间在增加细胞活力、减少LDH的释放及降低神经元表达ICAM-1、iNOS等方面,高浓度组与低浓度组有统计学差异(P<0.05),说明高浓度组比低浓度组更能发挥保护作用,且丁基苯酞100μmol/l组与PDTC 100μmol/l组有统计学差异,说明丁基苯酞100μmol/l组比PDTC 100μmol/l组在抑制NF-κB的活化上作用更强。(7)通过MTT法和LDH释放测定,证实丁基苯酞对大鼠大脑皮质神经元没有毒副作用。
种兆忠[6]1998年在《丁基苯酞的药理作用及作用机制的研究》文中研究说明丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，dl-NBP)是我们医科院药物研究所开发研制的抗脑缺血新药。L-NBP最初是自芹菜籽中分离提取的有效成分，现已由本所药物化学合成室人工合成了消旋体并拆分得到了其光学活性异构体d-NBP和l-NBP。经本组多年研究证实，dl-NBP可改善全脑缺血后脑能量代谢；缩小局灶性脑缺血后脑梗塞面积，减轻神经功能损伤症状：改善大脑中动脉阻断后纹状体血流量；保护局灶性脑缺血后动物的学习记忆功能。以往的研究只局限在对脑缺血的治疗。我们知道，脑缺血、缺氧、蛛网膜下腔出血、脑外伤往往引起相似的病理生理变化，dl-NBP对脑缺血的良好治疗效果提示它可能对蛛网膜下腔出血和脑外伤有一定的保护作用，为此，本实验初步研究了dl-NBP对大鼠蛛网膜下腔出血和小鼠闭合性脑外伤的作用。另外，脑缺血再灌注后会引起较单纯缺血更严重的脑损伤，为此对局灶性脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的变化和脑水肿的形成及其药物的作用进行了探讨。以往对dl-NBP作用机制研究表明，dl-NBP对NOS-NO-CGMP系统、细胞内钙和脑能量代谢有一定的作用，本研究进一步探讨了dl-NBP的可能作用机理。丁基苯酞对蛛网膜下腔出血后局部脑血流的改善和对血脑屏障活性的影响 侧脑室注射自体动脉血造成大鼠蛛网膜下腔出血模型，氢清除法测定尾状核血流量。结果表明，侧脑室注血后15分钟，尾状核血流量即显著降低(约为正常的50％左右)，并在3小时内基本上维持在此水平。蛛网膜下腔出血后5分钟，给dl-NBP(50-100mg／kg，po或5-20 mg／kg，ip)可明显提高30～180分钟内尾状核血流量，而对平均动脉压无明显影响。实验结果还表明，d-NBP和l-NBP的作用存在明显差异，d-NBP(10mg／kg，ip)可明显提高蛛网膜下腔出血后尾核脑血流量，但同剂量的l-NBP对脑血流无明显影响。另外，dl-NBP 10mg／kg还可保护血脑屏障，降低蛛网膜下腔出血6小时后血脑屏障对血浆蛋白的通透性的增加。 丁基苯酞对小鼠闭合性脑外伤的保护作用 研究了dl-NBP对小鼠闭合性脑外伤24小时后脑损伤的保护作用，结果表明，脑外伤后24小时可引起小鼠记忆功能下降，跳台试验发现电刺激后跳台潜伏期明显延
徐玉振[7]2011年在《丁苯酞对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马MMP-2、MMP-9表达的影响》文中指出血管性痴呆(vascular demensia,VD)是由一系列脑血管因素导致脑组织损害所引起的脑高级功能障碍综合征的总称,其诊断具有以下三项及以上的精神活动受损如语言、记忆、视空间技能、情感、人格、计算力和抽象判断力[1]。临床常见的血管性痴呆包括:多梗塞性痴呆、大面积脑梗塞性痴呆、皮层下动脉硬化性脑病(Binswanger病)、特殊部位梗塞所致痴呆及出血性痴呆等。随着社会老龄化及生活模式的改变,VD的发病率逐年提高,成为仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的第二大痴呆类型[2],是神经内科的常见病、多发病,不仅严重影响广大患者的身心健康和生活质量,也给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来,VD的发病呈现年轻化的趋势,日益受到广大科研和临床工作者的重视。目前VD的发病机制尚未完全明确,也无确切有效的防治方法,因此探讨VD的发病机制,制定有效的治疗方案,已成为医学领域研究的热点。学习记忆是大脑的高级神经生理活动之一。学习是经验和技能的获得,记忆则是经验和技能的保存和再现。学习和记忆是两个不同的神经生物过程,既相互联系,又密切合作,使生物体适应不断变化的外界环境[3]。大量研究表明,大脑海马等结构对学习和记忆的形成和保持具有重要意义。记忆分为瞬时记忆、短时记忆、长时记忆和永久记忆四种。较长时的记忆可能与脑内蛋白质的合成有关,而永久性的记忆则可能与新突触的建立有关[4]。海马独特的组织结构及神经生理功能可能参与了这种蛋白质和突触的合成和建立。人体的多种神经递质及体液因子参与了学习记忆的过程,如胆碱能系统、兴奋性氨基酸谷氨酸及其受体、NO及钙调蛋白等,已得到基础医学科学和临床科学的广泛证实,但由于其机制复杂,目前仍未完全明确。消旋3-正丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP),是由中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所合作开发的国家级一类新药,具有完全的自主知识产权,最早是从天然植物芹菜籽中分离提纯并消旋合成的黄色油状液体,具有较好的抗脑缺血疗效。丁苯酞抗脑缺血的机制极其复杂,是由多基因、多靶点、多环节参与的过程。通过减轻脑水肿,改善脑能量代谢、改善缺血脑区的微循环,抑制神经细胞凋亡,抗脑血栓形成、抗血小板聚集作用、抑制谷氨酸释放,降低细胞内钙浓度、抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制而发挥药效作用[5]。目前对丁苯酞的研究大多集中在脑缺血领域,尚缺乏对其与VD之间关系的相关研究报告。MMPs尤其是MMP-2及MMP-9在VD发病中的作用已得到越来越多科研工作者的重视,有理由认为,MMPs有可能是丁苯酞治疗VD的靶点之一。本实验研究探讨消旋3-正丁苯酞对VD大鼠的保护作用及其可能的治疗机制,进而为临床治疗提供科学的依据。目的:研究消旋3-正丁苯酞对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马MMP-2、MMP-9表达的影响,探讨丁苯酞对慢性脑缺血的治疗机制。研究方法:12—16周龄的健康雄性Wistar大鼠160只,体重约250-300g,随机分为假手术对照组(n=40),模型组(n=40),丁苯酞大剂量组(n=40)(剂量为6mg/kg),丁苯酞小剂量组(n=40)(剂量为2mg/kg)。以2-Vo法制作血管性痴呆模型,分离大鼠双侧颈动脉,假手术对照组只分离不结扎,模型组、丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组永久结扎双侧颈动脉。丁苯酞注射液大剂量组和丁苯酞小剂量组于手术当日起即腹腔注射相应剂量的丁苯酞注射液,模型组腹腔注射等量的生理盐水,假手术组不给药。在给药后的1d、3d、5d、7d、14d和30d,在各时间点分别随机选取各组大鼠3只,经心脏灌注后断头取脑,于视交叉后1mm及4mm冠状切开脑组织,去除小脑和脑干,取中间海马组织,经固定、脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片,行免疫组化染色观察MMP-2及MMP-9的表达变化。各组剩余大鼠于给药后30d行跳台回避试验和Morris水迷宫试验,测试学习记忆能力,行HE染色观察海马病理变化。数据以均数士标准差(x士s )表示,运用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差的分析,采用LSD-t检验进行各组间两两的比较,P<0.05有统计学意义。结果1.实验动物的一般情况各组大鼠术后均出现毛发凌乱、活动减少、精神萎靡和少食少饮,术后麻醉苏醒时间和精神体能恢复时间,假手术对照组明显早于模型组,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组,而丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组明显早于模型组。假手术对照组术后1天即可恢复精神,丁苯酞治疗组约需2-3天,模型组最长,约5-7天左右恢复。2.跳台回避试验和Morris水迷宫试验各组大鼠于术后第31天测试跳台回避试验和Morris水迷宫试验作为学习成绩,各组大鼠于术后第32天测试跳台回避试验和Morris水迷宫试验作为记忆成绩。跳台试验以大鼠逃避潜伏期和错误次数作为学习成绩,潜伏时间和错误次数作为记忆成绩;Morris水迷宫试验以逃避潜伏时间和错误次数作为学习成绩,以停留原平台象限时间作为记忆成绩。2.1跳台试验的结果显示:在学习能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的跳台逃避潜伏期明显缩短,分别为(85.23±12.71,56.18±11.36,57.96±11.48)秒,错误次数明显减少,分别为(4.78±0.79,2.08±0.41,2.09±0.45);在记忆能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的潜伏时间明显延长,分别为(72.84±10.26,152.27±11.70,153.19±11.58)秒,错误次数明显减少,分别为(1.86±0.13,0.53±0.05,0.55±0.06)。2.2 Morris水迷宫试验的结果显示:在学习能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的跳台逃避潜伏期明显缩短,分别为(80.71±8.27,43.25±5.29,44.74±5.82)秒,错误次数明显减少,分别为(37.53±7.69,14.76±5.01,15.68±5.32);在记忆能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的原平台象限时间明显延长,分别为(18.67±5.39,32.35±4.27,31.19±4.78)秒。3.各组大鼠海马HE染色假手术对照组:神经元变性坏死及细胞水肿不明显,细胞核大而圆,细胞排列紧密,与周围神经元界限清楚;模型组:神经元变性坏死及细胞水肿明显,核固缩,与周围神经元有明显水肿带;丁苯酞治疗组:神经元变性凋亡程度介于假手术组与模型组之间,神经元之间结构较清晰,无明显水肿带,受损神经元数量较模型组明显减少,丁苯酞大剂量组神经元受损的病理学表现较丁苯酞小剂量组为轻。4. MMP-2,MMP-9的免疫组化染色各组大鼠分别在术后的1d,3d,5d,7d,14d和30d以10%水合氯醛麻醉,断头取脑,4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行免疫组化染色,观察MMP-2,MMP-9表达的情况。用图象采集系统采图和图像分析软件对图像进行统计学分析。与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组MMP-2,MMP-9在各时间点的表达明显减少,p<0.05,有统计学意义,表明丁苯酞可减少MMP-2及MMP-9的表达。结论:1.丁苯酞可改善VD模型大鼠在跳台回避试验和Morris水迷宫试验中的学习记忆能力。2.慢性脑缺血VD大鼠海马神经元的MMP-2及MMP-9的表达明显增加。3.丁苯酞可使海马神经元的MMP-2及MMP-9的表达明显减少。4.丁苯酞对MMP-2及MMP-9的表达的影响有可能是丁苯酞对VD的治疗作用的靶点之一。
贾智若[8]2014年在《佛手散化学成分分析及其抗脑缺血作用的研究》文中研究指明佛手散,又名芎劳汤,出自宋·许叔微《普济本事方》卷十,由当归和川芎两味中药组成,既是古方,又是一著名药对。该方组方精良,配伍严谨,具有活血化瘀、气血兼顾、祛风止痛之功效。古时主治妇女月经不调、胎前产后血虚头晕、头痛,心腹诸痛等病证。现代药理研究发现该方具有抗血小板聚集、抑制血管平滑肌增生、改善血液循环、抗脑缺血及抗氧化等多种功效。近年临床上多用于治疗脑中风、脑动脉硬化、深静脉血栓等心脑血管疾病,疗效确切。尽管佛手散及其单味药、有效成分等已在临床上得到了广泛的应用,组方单味药当归和川芎的物质基础研究也取得了相当的进展,但从方剂整体水平上研究佛手散的化学物质基础、抗脑缺血的药理作用却鲜有报道。本课题以佛手散水煎剂为研究对象,建立其指纹图谱分析方法及指标成分测定方法,从定性定量的角度检测佛手散水煎剂的内在质量,获得汤剂中所含的化学成分信息。结合体内和体外不同层次的脑缺血损伤模型,分别从整体动物和细胞两个水平上研究佛手散水煎剂对缺血性脑损伤的保护作用,在此基础上,进一步对复方佛手散全方及不同萃取部位进行体外抗脑缺血药效筛选实验,探讨其抗脑缺血的有效部位及有效成分。采用优选的水提工艺对佛手散水煎剂进行制备,以10批佛手散水煎剂样品为研究对象,运用HPLC法建立该方水煎剂指纹图谱,利用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”软件对10批样品的相似度进行评价,建立佛手散水煎剂指纹图谱的共有模式,测得各批次样品与共有模式的相似度,结果表明各批样品中共有峰的相对保留时间基本一致,RSD均小于1%,相似度均大于0.94,符合中药指纹图谱的技术要求,所建立的共有模式能较好地反映出全方化学成分质与量的分布情况,并通过复方与组方药味指纹图谱的相关性分析,对其化学物质组成进行初步表征,研究结果可为该方的质量控制和化学物质基础研究提供参考依据。在此基础上应用超高效液相色谱-电喷雾-质谱(UPLC-ESI-MS)技术对佛手散的化学成分进行了定性鉴别,通过对质谱和光谱数据的解析,结合部分对照品和参考文献的比对,对标定的16个色谱峰进行了分析鉴定,成功鉴定了其中的11个组分,分别是绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、川芎酚、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、丁烯基苯酞、丁基苯酞、洋川芎内酯A、藁本内酯以及邻苯二甲酸二丁酯,初步明确了佛手散水煎剂的主要化学物质基础。据文献报道,阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A和藁本内酯被证实是对心脑血管发挥作用的有效成分,因此本研究运用UPLC法首次建立了佛手散水煎剂中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A及藁本内酯4种有效成分的含量测定方法。结果表明该方法操作简便、精密度高,可为其质量控制提供科学依据。为进一步确证佛手散抗缺血性脑损伤的疗效,本研究结合体内和体外不同层次的脑缺血损伤模型,分别从整体动物和细胞两个水平上研究该方汤剂对缺血性脑损伤的保护作用。首先采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血再灌注(middle cerebral artey occlusion,MCAO)模型,从整体动物水平上考察佛手散水煎剂对实验性脑缺血损伤的保护作用,结果显示,佛手散对实验性脑缺血所致的大鼠神经行为学障碍、脑水肿程度以及脑梗死体积均有明显的改善作用,且作用呈剂量依赖性,表明佛手散水煎剂对脑缺血再灌注损伤具有良好的保护作用,其机制可能通过增加脑组织中抗氧化酶活力、降低脂质过氧化反应等发挥效应。此外,本研究采用连二亚硫酸钠合并缺糖建立体外PC12细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose depriviation, OGD)损伤模型,从细胞水平上考察该方对PC12神经细胞缺氧缺糖损伤的保护作用,结果显示,相比于模型组,佛手散水煎剂预处理组对缺氧缺糖诱导的细胞损伤具有明显的保护作用,可剂量依赖性的减少细胞中MDA和NO含量,提高SOD活性,此可能是佛手散水煎剂发挥神经保护作用的机制之一。在体内外实验证实佛手散水煎剂具有抗脑缺血作用的基础上,本课题借助传统植化手段,采用不同溶剂对佛手散全方进行梯度萃取,分别得到乙酸乙酯、正丁醇和残余水三个萃取部位,通过UPLC指纹图谱对不同部位的化学成分进行表征,同时以体外培养的PC12细胞建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型,直接在细胞水平上考察佛手散各部位对神经细胞缺血样损伤的影响,以筛选佛手散水煎剂抗脑缺血的有效部位及有效成分。药效筛选结果表明乙酸乙酯部位对PC12细胞OGD损伤的抑制作用较强,抑制率大于50%,与全方组药效相近；残余水部位的抑制作用次之；而正丁醇部位的抑制作用不明显。推测乙酸乙酯部位和残余水部位为佛手散抗缺血性脑损伤的有效部位,其药效成分可能主要集中于上述两个部位。综合前期UPLC-ESI-MS分析结果,乙酸乙酯部位主要是阿魏酸和咖啡酸以及洋川芎内酯A、H、I、丁基苯酞、丁烯基苯酞、藁本内酯等苯酞类化合物。据此推测上述化合物可能是佛手散水煎剂抗脑缺血的主要药效物质基础,而残余水部位的主要化学成分目前尚未明确,有待进一步研究。综上所述,本研究结果可为阐明佛手散水煎剂抗脑缺血的药效、物质基础以及建立质量评价方法提供科学依据,为该方剂的二次开发和临床应用提供理论参考。
董高翔[9]1999年在《丁基苯酞对脑缺血神经细胞凋亡的抑制作用及其机理研究》文中研究指明缺血性脑卒中是临床上继心脏病和肿瘤后的第三大死亡原因，严重威胁人类健康，影响病人生活质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。对其发病机理的研究和寻找有效的治疗药物已成为当务之急。近年研究表明脑卒中后迟发性神经元死亡的主要形式是细胞凋亡，且凋亡的细胞主要集中在缺血阴影区(penumbra)。保护这部分神经元的完整性和功能是目前治疗脑卒中的目标。丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)是我所近年来开发的一个新型抗脑缺血药物，具有良好的抗脑缺血作用，目前正在进行Ⅱ期临床试验。以往实验研究表明：NBP能缩小大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)后脑梗塞面积和改善神经功能缺失。为进一步研究NBP这一作用的机理，我们提出如下假说：NBP缩小大鼠MCAO后脑梗塞面积与其抑制脑缺血后神经细胞凋亡有关。因此，本论文的研究目的是：(1)NBP对脑缺血神经细胞凋亡是否具有抑制作用；(2)如果有作用，其可能的机理有哪些。本学位论文的主要研究内容如下： 第一部分 丁基苯酞对脑缺血神经细胞凋亡的抑制作用 第一节 NBP对低氧低糖诱导的皮质神经细胞凋亡的作用 本节首先从离体水平以原代培养的大鼠胎鼠皮质神经细胞低氧低糖再复氧为模型，研究NBP对神经细胞凋亡的作用。用流式细胞术检测DNA含量及凋亡细胞百分率，透射电镜观察细胞形态学变化，DNA琼脂糖凝胶电泳和原位末段标记(TUNEL)检测DNA断裂。结果表明：低氧低糖处理的细胞随着时间的延长凋亡峰增高(6h：10％；9h：13.5％；12h：25.1％)，但
翟锴华[10]2007年在《丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠NF-κB、COX-2的影响》文中认为背景和目的随着世界人口老龄化，慢性脑缺血已经成为威胁人类的重要临床难题。但是，目前的研究多集中在急性脑缺血尤其是短暂脑缺血后再灌注方面，而在慢性脑缺血方面研究甚少，与急性脑缺血相比，慢性脑缺血具有较长的临床前期可供干预，研究慢性脑缺血的机制可能为其深入研究和临床治疗提供合适的策略。有研究表明核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是参与缺血性脑损伤的两种重要炎症反应因子。但在慢性脑缺血后NF-κB、COX-2表达的基础研究罕见报道。丁基苯酞(3-n-butylphathlide，NBP)是中国医学科学院药物研究所研制开发的一类新型抗脑缺血药物，对急性缺血性脑卒中有明显疗效。但有关丁基苯酞在慢性脑缺血中的治疗作用研究甚少。本课题关注在慢性脑缺血后转录因子NF-κ3激活和下游基因COX-2表达在慢性脑缺血的炎症反应中的作用，探讨丁基苯酞在慢性脑缺血中的抗炎作用，为丁基苯酞治疗慢性脑缺血的临床应用提供理论基础。材料与方法健康Wistar大鼠100只，体重450-550g，随机分为5组，每组20只。A组：对照组(假手术+溶剂)；B组：模型组(手术+溶剂)；C组：缺血高剂量治疗组(手术+高剂量NBP+溶剂)；D组：缺血低剂量治疗组(手术+低剂量NBP+溶剂)；E组：预防组(预防剂量NBP+手术+溶剂)。溶剂为消毒后的精制花生油。C组和D组双侧颈总动脉结扎术(2VO)后2月分别给予12mg／100g／d、6mg／100g／d丁基苯酞灌胃；A组和B组每日给予消毒后的精制花生油2ml灌胃，E组在2VO术前1月给予8mg／100g／d灌胃，连续灌胃1月。3月后，处死大鼠，常规灌注取脑，制备标本。采用光镜及免疫组织化学方法对各组大鼠海马CA1区及颞叶皮层组织形态学、NF-κB p65及COX-2的表达进行检测。统计学处理：数据以均数士标准差(x士s)表示，然后运用SPSS14.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，多个样本均数的两两比较用q检验法。取α=0.05作为检验水准。结果1．HE染色：假手术组海马CA1区及颞叶皮层神经元偶有变性、坏死，大部分细胞形态正常未发现明显的病理变化，单纯缺血组大鼠海马CA1区及颞叶皮层神经元数目明显减少，可见大量变性、坏死的神经元，大剂量丁基苯酞治疗后，变性坏死的神经元明显减少，正常细胞数低于假手术组，小剂量丁基苯酞治疗组大鼠海马CA1区及颞叶皮层变性、坏死的神经元也有所减少，但高于大剂量组。预防组和单纯缺血组大鼠比较，预防组可见较少的变性、坏死神经元，细胞数量较多，排列较规则。2．NF-κB p65免疫组化染色：取海马CA1区及颞叶皮层两个部位进行统计分析：对照组大鼠偶有细胞可见NF-κB p65在核内微弱表达，单纯缺血性大鼠在慢性脑缺血后NF-κB p65在细胞核内表达明显增加，不同剂量的丁基苯酞治疗后，NF-κB p65在细胞核内的表达明显减少。各组老龄大鼠海马CA1区及颞叶皮层中NF-κB p65的表达：A组：1.45士0.34，2.32士0.46；B组：22.72士0.56，26.18士0.54，与A组相比，NF-κB p65表达明显增高，有显著性差异(P＜0.01)；C组：8.67士0.44，12.33士0.39，与B组相比，NF-κB p65表达显著减少，有显著性差异(P＜0.01)；D组：15.20士0.46，19.96士0.38；与A组、B组和C组比较，均有显著性差异(P＜0.01)；E组：11.03士0.42，14.04士0.70，E组NF-κB p65的表达介于C组与D组之间，与A组和B组比较有显著性差异(P＜0.01)。3．COX-2免疫组化染色：取海马CA1区及颞叶皮层两个部位进行统计分析：A组：1.28士0.41，2.40士0.37；B组：26.25士0.46，32.00士0.63；与A组比较，有显著性差异(P＜0.01)；C组：9.00士0.58，16.41士0.49；与A组和B组比较，均有显著性差异(P＜0.01)；D组：15.05士0.51，24.36士0.45；与A组、B组和C组比较，均有显著性差异(P＜0.01)；E组：11.24士0.70，20.23士0.52；与A组、B组、C组和D组比较，均有显著性差异(P＜0.01)；结论丁基苯酞可以减轻慢性脑缺血老龄大鼠神经元变性、坏死；丁基苯酞减少慢性脑缺血老龄大鼠脑内NF-κB p65、COX-2的表达，可能是丁基苯酞抑制炎症反应的途径之一；丁基苯酞对慢性脑缺血损伤可能有保护作用；丁基苯酞对慢性脑缺血损伤可能存在预防作用。
参考文献：
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[5]. 丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧炎性损伤及机制[D]. 吴丽蓉. 重庆医科大学. 2007
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