KLF10在肥大心肌细胞中的表达和分布论文_李琴

广东医科大学湛江科研中心,东莞523808

摘要:目的 KLF10在肥大心肌细胞中的表达和分布。 方法 将培养的原代心肌细胞随机分为空白对照组(Con组),血管紧张素模型组(AngⅡ 组),通过Rt-PCR、western-blot等方法观察KLF10在肥大心肌细胞中的表达和分布。结果 KLF10在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中表达下调,并且呈时间和剂量依赖性。

1.2.1 心肌细胞模型的建立

取1~3天的新生SD大鼠,在超净台内用75%乙醇擦拭胸部及腹部皮肤后,开胸取出心脏并放入盛有预冷PBS的无菌平皿中;用小镊子仔细剔除心脏上的结缔组织及血块,轻轻挤压心脏,使残血流出;把心脏剪成约1 mm3的碎块,将心肌组织转移到含有磁性搅拌子的锥形瓶中,加入15 ml含0.08%的胰蛋白酶。冰上静置20 min进行冷消化,每隔5 min摇一次锥形瓶,使胰酶均匀浸入心肌组织中;冷消化结束后将锥形瓶至于磁力搅拌器上,水浴搅拌,37℃,5 min后将细胞上清液转移至3-4 ml含10%新生牛血清的DMEM培养基中。1200 rpm离心5 min,倒掉上清,加入2 ml含10%新生牛血清的DMEM培甲醛固定15min;加入0.1%曲拉通室温避光孵育30 min;PBS洗3次, 5 min/次。每孔加入100 μl配好的0.5 % rhodamine-phalloidin,避光孵育30 min;再加入DAPI染液,室温避光孵育10 min,激光共聚焦显微镜进行观察,随机选取5次实验的7个视野,每个视野包含心肌细胞约5~10个,测量100~120个细胞表面积,计算细胞表面积。

1.2.3 RT-PCR法检测细胞肥大相关基因ANF、BNP的mRNA表达

Trizol试剂提取细胞总RNA,参照Takara公司RT-PCR试剂盒说明书,用逆转录试剂(Fermentas)将提取的RNA配置20µl 反应液,,将反应液置于PCR仪中进行DNA去除和逆转录反应。ANF、BNP的引物均由英潍捷基贸易有限公司代为合成,反应体系和条件如下:

2 结果

2.1 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中KLF10的mRNA表达

原代培养的新生SD大鼠心肌细胞在无血清培养24 h 后,分别加入10nM、100nM 及1000 nM 的AngⅡ培养24 h,提取细胞总RNA,用荧光定量PCR 检测KLF10的mRNA 表达的量效关系。如图3A所示,在AngⅡ的刺激下, KLF10的mRNA表达下调。接着,我们观察了100 nM 的AngⅡ刺激下KLF10的mRNA表达的时效关系,如图3B 所示,在100 nM 的AngⅡ刺激下,心肌细胞中KLF10的mRNA表达下调,提示AngⅡ能够时间和剂量依赖性地诱导KLF10的mRNA表达下调。

2.2 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中KLF10的蛋白表达

原代培养的新生SD大鼠心肌细胞在无血清培养24 h 后, 分别加入10 nM、100 nM 及1000 nM 的AngⅡ培养24 h, 提取细胞总蛋白,采用Western blot 检测KLF10的蛋白表达的量效关系。如图4A所示,在AngⅡ的刺激下,KLF10的蛋白表达下调。接着,我们观察了100 nM 的AngⅡ刺激下KLF10的蛋白表达的时效关系,如图4B 所示,在100 nM 的AngⅡ刺激下,心肌细胞中KLF10的蛋白表达下调,提示AngⅡ能够时间和剂量依赖性地诱导KLF10的蛋白表达下调。

3. 讨论

近年来,KLFs家族成员在心血管疾病中的研究引起人们的广泛关注。在心肌肥大的发生发展过程中,KLFs家族成员也起着重要的作用。KLF10是KLFs家族成员之一,目前研究认为其主要的生物学功能是抑制细胞增殖、诱导凋亡。研究发现过表达KLF10能抑制CHO 细胞、人成骨细胞hFOB增殖,并且,在肺上皮细胞 Mv1Lu及胰腺上皮细胞PANC1中,KLF10过表达能够诱导细胞凋亡;同时还发现KLF10的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。尽管对KLF10的生物学功能研究取得显著进步,但KLF10在心血管疾病中的作用机制尚不明确。为了充分的了解KLF10在心肌肥大中的作用,我们观察KLF10在细胞中的表达和分布。结果发现KLF10在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中表达下调,并且呈时间和剂量依赖性。我们的研究将进一步揭示心肌肥大的发生机制,为其有效防治提供新理论和药物新靶点。

参考文献

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[3] McConnell, B.B. and V.W. Yang. Mammalian Kruppel-Like Factors in Health and Diseases. Physiological Reviews, 2010. 90(4):1337-1381.

论文作者:李琴

论文发表刊物:《医师在线(学术版)》2019年第09期

论文发表时间:2019/7/15

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