王丹[1]2004年在《卵巢上皮性肿瘤Endoglin表达的初步研究》文中研究指明目前卵巢恶性肿瘤发病率居女性生殖道恶性肿瘤第叁位，而死亡率高居首位，临床上有70％的病例就诊时已届晚期，5年内死亡的病例高达70％，而卵巢上皮性恶性肿瘤(即卵巢癌)约占其中的90％。卵巢癌早期患者治疗后5年生存率约为75％，明显高于晚期患者(5％～15％)，因此卵巢癌的早期诊断成为提高患者5年生存率和降低死亡率的关键。 肿瘤血管生成是近年来研究的热点，新生血管不仅为肿瘤细胞提供所需要的营养和氧气，而且有利于肿瘤细胞进入血液循环及淋巴管道，进而扩散至全身各器官。国外卵巢癌血管生成方面的研究主要集中于血管生长调节因子和血管内皮细胞抗原两方面，血管内皮细胞抗原包括CD34、CD31、von Willebrand因子(vWF)等。Endoglin是新生血管内皮抗原之一，参与血管生成，在有血管生成的组织如损伤修复组织及肿瘤组织中的内皮细胞特异性高表达，目前已成为肿瘤诊断治疗和抑制肿瘤血管生成的一个重要生物靶分子。 为研究Endoglin与卵巢上皮性肿瘤组织中血管生成的关系，探讨其与肿瘤性质、肿瘤分期的相关性，本实验采用免疫组化、半定量反转录PCR等方法，测定了Endoglin及其相关配体TGF-β1在卵巢上皮性肿瘤中的表达。 评估实体肿瘤内血管生成状态的“金指标”是检测活检组织或术后病理标本中微血管密度(MVD)，MVD越高，整体血管表面积越大，肿瘤细胞进入血道或淋巴循环的可能性越大，发生转移和组织浸润的可能性就越大，肿瘤预后也越差。为研究Endoglin和CD34标记卵巢上皮性肿瘤中新生血管的差异性，我们分别以CD34和Endoglin的单克隆抗体标记血管内皮细胞，计数MVD，评价其与肿瘤分期分级之间的相关性，结果如下： 1．Endoglin在卵巢上皮性肿瘤的血管内皮细胞表达呈阳性，且表达阳性率高于CD34，用Endoglin标记内皮细胞，计数MVD评价卵巢上皮性肿瘤血管生成状态的意义优于CD34，且MVD值与肿瘤良恶性、肿瘤临床分期、病理分级关系密切，推测Endoglin标记计数的MVD与卵巢癌的预后有关，可能成为判断卵巢癌预后的重要指第叁军医大学硕士学位论文标。 2.Endoglin mRNA在卵巢囊腺瘤和卵巢囊腺癌组织中均有表达，但在卵巢癌组织中的表达明显增高，一方面说明卵巢癌组织的血管内皮细胞处于活跃的增殖状态，另一方面说明Endoglin有可能成为一种新的恶性肿瘤血管标志物。 3.Endoghn随着卵巢上皮性肿瘤临床分期进展和恶性程度的增高，其阳性表达逐渐增高，肿瘤细胞TGF一pl的表达则下调，两者的协同作用可能是导致肿瘤血管内皮细胞不断增殖，并促进肿瘤发展的原因之一。 本实验结果表明，Endoglin做为一种新生血管内皮细胞相关抗原，在标记肿瘤新生血管，计数MVD方面明显优于传统的全血管内皮标记物CD34，能更准确评价肿瘤血管生成状态及生成能力，且与卵巢癌肿瘤临床分期、病理分级明显相关。Endogiin与TGF一pl协同作用可能促进了肿瘤血管内皮细胞的不断增殖，进一步促进卵巢肿瘤发展。Endoglin可能成为在卵巢上皮性肿瘤诊断和生物靶向治疗的重要靶分子。
王立[2]2012年在《CD31、CD105和PTTG、ILK、Mig-7在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床病理学意义》文中认为目的卵巢癌是妇科最常见的叁大肿瘤之一,发病率仅次于宫颈癌和宫体癌,死亡率在妇科恶性肿瘤中居首位。大量研究证实,肿瘤组织的微血管密度(MVD)与多种肿瘤的发生发展及生物学行为有关。本实验用血管内皮标记物CD31和CD105来检测MVD,旨在探讨CD31和CD105在卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织中的表达情况及其与卵巢肿瘤生物学行为之间的关系,并比较同为肿瘤血管内皮标记物的CD31和CD105在标记微血管方面的差异。同时,本实验还通过检测垂体肿瘤转化基因(PTTG)、整合素连接激酶(ILK)及迁移诱导蛋白7(Mig-7)在卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织中的表达情况及其与卵巢癌生物学行为之间的关系,探讨叁者与肿瘤发生发展的关系。方法收集天津市肿瘤医院临床、病理和预后资料完整的恶性卵巢上皮性肿瘤组织标本76例,病例标本采用免疫组化En Vision法检测CD31和CD105所标记的MVD数值,MVD计数参照Weidner方法进行量化分析；PTTG、ILK和Mig-7亦采用免疫组化En Vision法检测,染色结果参考Fromowitz方法判定；采用Kaplan-Meier生存分析来分析各组生存率。实验同时取20例交界性卵巢上皮性肿瘤、10例良性卵巢上皮性肿瘤和10例宫颈癌手术中切除的正常卵巢组织作为对照。结果1.①CD31蛋白在卵巢上皮性肿瘤的微血管和大血管上均有较强表达,在正常卵巢组织血管中亦有表达,恶性卵巢肿瘤中的MVD-CD31值(5.48±0.75)显着高于交界性卵巢肿瘤(2.24±0.61)、良性卵巢肿瘤(2.24±0.41)及正常卵巢组织(1.20±0.37)(P<0.01)；在卵巢癌中,MVD-CD31值仅与有无淋巴结转移及组织学分级之间的差异有统计学意义(P<0.05),而与年龄、病理类型、肿瘤大小、腹水、有无远处转移无关(P>0.05)。②CD105蛋白在卵巢肿瘤微血管中有表达,在正常卵巢组织中呈微弱表达或无表达,恶性卵巢肿瘤中的MVD-CD105值(4.07±2.11)显着高于交界性卵巢肿瘤(2.08±0.30)良性卵巢肿瘤(1.92±1.15)及正常卵巢组织(0.68±0.39)(P<0.05或P<0.01)；在卵巢癌中(?)MVD-CD105值与组织学分级、有无腹水、有无远处转移、有无淋巴结转移有关(P<0.05),而与年龄、病理类型、肿瘤大小等因素无关(P>0.05)。③恶性肿瘤组织中的MVD-CD31值显着高于MVD-CD105值(P<0.05)。2.①恶性卵巢肿瘤中PTTG蛋白表达阳性率(63.2%)显着高于卵巢交界性肿瘤(35%)、良性肿瘤(30%)及正常卵巢组织(10%)(P<0.05或P<0.01)；恶性卵巢肿瘤组织中,组织学分级为Ⅲ～Ⅳ级组PTTG的阳性表达显着高于Ⅰ～Ⅱ级组(P<0.05)；有腹水组显着高于无腹水组(P<0.05)；有远处转移及淋巴结转移组显着高于无转移组(P<0.05；P<0.01)。而PTTG的阳性表达与年龄、病理类型和肿瘤大小无关(P>0.05)。PTTG阳性组生存时间明显短于阴性组(P<0.05)。②恶性卵巢肿瘤组织中ILK阳性表达率(69.7%)显着高于交界性卵巢肿瘤(45%)、良性卵巢肿瘤(30%)和正常卵巢组织(20%)(P<0.05或P<0.01)；恶性卵巢肿瘤组织中,组织学分级为Ⅲ～Ⅳ级组ILK的阳性表达显着高于Ⅰ～Ⅱ级组(P<0.01)；有腹水组显着高于无腹水组(P<0.05)有远处转移及淋巴结转移组显着高于无转移组(P<0.01；P<0.01)。ILK的阳性表达与年龄、病理类型和肿瘤大小无关(P>0.05)。ILK阳性组生存时间明显短于阴性组(P<0.05)。③恶性卵巢肿瘤组织中Mig-7阳性表达率(80.3%)显着高于交界性卵巢肿瘤(55%)、良性卵巢肿瘤(40%)和正常卵巢组织(0)(P<0.01),其中正常卵巢组织中没有Mig-7的阳性表达；恶性卵巢肿瘤组织中,组织学分级为Ⅲ-Ⅳ级组Mig-7的阳性表达显着高于Ⅰ～Ⅱ级组(P<0.05)有腹水组显着高于无腹水组(P<0.05)；有远处转移及淋巴结转移组显着高于无转移组(P<0.05；P<0.05)。Mig-7的阳性表达与年龄、病理类型和肿瘤大小无关(P>0.05)。Mig-7阳性组生存时间明显短于阴性组(P<0.05)结论1.在标染卵巢癌方面,CD105比CD31有明显优越性,CD105的表达与卵巢癌的生物学行为密切相关,MVD-CD105值的检测可更准确的确定肿瘤的临床分期、指导治疗及判断预后。2.PTTG、ILK和Mig-7在卵巢上皮性恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,可以作为临床判断卵巢癌生物学行为有用的分子生物学指标。
傅士龙[3]2014年在《人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞促癌作用的研究》文中指出上皮性卵巢癌是女性生殖系统叁大恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫内膜癌,居第二位,而病死率一直高居各类妇科恶性肿瘤的首位。大约75%的卵巢癌患者在诊断时已是手术无法救治的晚期;因此,探索上皮性卵巢癌发生、发展的细胞外机制,以期达到预防和治疗卵巢癌的目的,成为迫切需要解决的重要课题。卵巢癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs),作为卵巢癌间质微环境中最主要的细胞成份之一,对肿瘤的生长、浸润、转移发挥重要的调节作用,对肿瘤微环境内的其他非肿瘤细胞,如细胞外基质、其他间质细胞也产生重要影响,在维持肿瘤微环境的动态平衡中发挥着重要作用。CAFs是一种有着多种来源的细胞群体,具有广泛的异质性,是各肿瘤研究的热点,人上皮性卵巢癌相关CAFs也需进行深入的研究。第一部分上皮性卵巢癌相关成纤维细胞与卵巢癌临床病理特征的相关性研究[目的]探讨上皮性卵巢癌中癌相关成纤维细胞与临床病理特征间的相关性。[方法]平滑肌肌动蛋白(α-SMA)为CAFs特异性标志物,α-SMA表达的数量与强度可代表CAFs的存在数量,因此采用免疫组化通用型二步法检测45例非癌卵巢组织中α-SMA表达和145例上皮性卵巢癌组织中α-SMA和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,并分析两者的相关性及其临床意义。[结果]①正常卵巢组织除卵巢间质血管外,α-SMA不表达;在良性肿瘤间质中少部分阳性表达,且表达较弱;而在交界性肿瘤中,α-SMA表达强度介于良性肿瘤和恶性肿瘤之间。而在145例上皮性卵巢癌中,α-SMA均阳性表达,代表阳性的CAFs细胞在癌组织中的分布有3种方式;且Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌间质α-SMA阳性表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P = 0.016);有淋巴结转移的卵巢癌明显高于无淋巴结转移卵巢癌(P=0.049)。②正常卵巢组织中MMP-9不表达;而上皮性癌中癌细胞MMP-9阳性率为95.2%(138/145)。MMP-9在Ⅲ～Ⅳ期组明显高于Ⅰ～Ⅱ期组(P=0.028),有淋巴结转移组强阳性率高于无转移组(P=0.033)。③α-SMA在上皮性卵巢癌间质强阳性表达与癌细胞MMP-9的表达呈正相关(p = 027)。[结论]α-SMA和MMP-9两者的共同强阳性表达主要集中于Ⅲ～Ⅳ期癌患者和有淋巴结转移的患者中,CAFs的存在与数量增多提示疾病预后不良。第二部分癌相关成纤维细胞与正常卵巢成纤维细胞分离、培养及鉴定一、癌相关成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得人上皮性卵巢癌组织中肿瘤相关成纤维细胞。[方法]采用酶消化法获得原代细胞,再通过酶消化+反复贴壁法,传代获得第4代纯化细胞,并绘制细胞生长曲线,通过形态学观察和细胞免疫化学染色,对所得细胞进行鉴定。[结果]获得典型卵巢癌相关成纤维细胞。形态学上,细胞呈长梭形,胞核不明显,细胞大小不一致。其生长潜伏期较肿瘤细胞长,生长相对缓慢。免疫细胞化学上,肿瘤相关成纤维细胞中,成纤维细胞特性蛋白-1、波形蛋白、结蛋白及α-平滑肌动蛋白均表达阳性,而血管内皮细胞、间充质细胞标志均表达阴性。细胞角蛋白在较早传代的细胞中少量表达,通过纯化后基本消失。[结论]本方法可获得典型上皮性卵巢癌相关成纤维细胞,为进一步研究该细胞自身生物学特性及其与卵巢癌间的相互作用提供了必要的细胞学基础。二、正常卵巢成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得典型人卵巢成纤维细胞。[方法]采用酶消化+反复贴壁法,获得纯化成纤维细胞,通过形态学观察和免疫细胞化学染色,对所得细胞进行特征性标志及生物学特性的检测,进一步阐述细胞特征,并绘制细胞生长曲线。[结果]形态学上,正常卵巢成纤维细胞形态多样,大部分为梭状型、条索形,还有叁角型、多角型和不规则型等,并具有伪足样外形;其生长潜伏期较长,12-14天可传代;免疫细胞化学上,波形蛋白(Vimentin)表达强阳性,结蛋白(Desmin)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)表达弱阳性;在较早期传代的细胞中,CK-7及CK-P呈少量阳性,随着细胞的纯化,其阳性表达渐行减少直至完全消失;肌动蛋白α(α-SMA)部分细胞表达阳性。而雌、孕激素受体ER、PR以及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-3、MMP-9)、卵巢粘液性细胞标志CK-20、血管内皮细胞标志CD31、间充质细胞标志CD90、肿瘤标志物(CA125、CA199、CEA)、成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)均阴性。[结论]成功获得人卵巢成纤维细胞,为研究卵巢癌及其相关成纤维细胞提供了必要的细胞学工具。第叁部分癌相关成纤维细胞对卵巢癌细胞生物学行为影响[目的]进一步验证CAFs对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭特性的影响,为研究肿瘤-微环境的相互作用提供必要的细胞学基础。[方法](1)采用细胞共培养体系,通过MTT实验、细胞迁移实验、细胞浸润实验以及流式细胞仪方法检测CAFs对卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3的增殖、迁移、浸润和凋亡的影响。[结果](1)CAFs对卵巢癌细胞具有明显增殖作用;(2)CAFs影响卵巢癌细胞的凋亡;(3)CAFs共培养后促进卵巢癌细胞系的迁移;(4)CAFs共培养后增强卵巢癌细胞系的侵袭能力。[结论]CAFs可明显增强卵巢癌细胞的恶性生物学行为,为进一步研究肿瘤-微环境的相互作用提供了必要的理论基础。第四部分癌相关成纤维细胞与卵巢癌细胞共培养上清因子的检测[目的]为深入了解上皮性卵巢癌细胞与CAFs间发生相互作用后所产生的效应因子,进一步研究间质对肿瘤细胞生物学行为的影响提供必要的研究基础。[方法]采用蛋白芯片 RayBioTM Human Cytokine Antibody Array Ⅱ series Ⅰ(含有507个细胞因子)检测9份细胞培养上清中细胞因子的含量,其中CAFs培养上清3份,OVCAR-3培养上清3份,CAFs+OVCAR-3共培养上清3份;将所测定的因子含量与OVCAR-3所分泌的基础状态因子含量作比较,定义比率升高大于等于2.0或下降小于等于2.0(≥2.0或≤-2.0)者为差异有显着性。[结果]共获得差异表达因子57种,44种表达上调,13种表达下调。其中与细胞增殖相关因子17种,与肿瘤基质形成相关因子11种,与肿瘤趋化及前炎症因子相关因子19种,与肿瘤血管生成和抑制相关因子10种。[结论]肿瘤相关成纤维细胞通过与肿瘤细胞相互作用,可产生一系列细胞因子,或促进肿瘤的进展,或调节肿瘤-微环境的动态平衡,为进一步研究CAFs对卵巢癌的促进作用提供了研究资源。第五部分癌相关成纤维细胞对小鼠移植瘤促进作用的初步研究一、可视化小鼠移植瘤模型的建立[目的]建立可重复观察并且可客观定量的卵巢癌动物模型,为卵巢癌其他领域研究提供基础模型工具。[方法]采用含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转染人卵巢癌细胞株,获得稳定表达GFP的卵巢癌细胞株GFP-Ovcar3接种裸鼠皮下或腹腔,利用小动物活体成像仪系统动态观察裸鼠移植瘤的生长情况,并对移植大小、轮廓进行定量测定。[结果](1)获得稳定表达绿色荧光蛋白的GFP-Ovcar3细胞;(2)通过接种裸鼠皮下或腹腔,成功获得带有绿色荧光蛋白的小鼠皮下和腹腔移植瘤模型。[结论]建立可视化小鼠模型,可更加直观、明确地获得肿瘤的大小和轮廓,为卵巢癌其他领域研究提供了基础模型工具。二、癌相关成纤维细胞对小鼠皮下移植瘤的促进作用[目的]通过体内实验,进一步证实CAFs在体外实验中所观察到的现象和结论。[方法]通过将前述获得的能稳定表达绿色荧光蛋白的不同浓度GFP-Ovcar3细胞,与CAFs细胞混合接种裸鼠皮下,建立可视化小鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤率、测量肿瘤生长情况及远处转移情况。[结果](1)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,成瘤率明显高于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可促进卵巢移植瘤的发生,尤其当接种瘤细胞浓度较低时,促进作用显着;(2)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,肿瘤生长明显快于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可明显促进移植瘤的生长。[结论]通过体内、体外研究证实,CAFs对卵巢癌的发生和生长具有明显促进作用,为探索针对CAFs的卵巢癌新的治疗途径提供了理论依据。叁、人源性卵巢环境小鼠模型的建立[目的]将“人源性”因素加入小鼠模型,为精确模拟肿瘤发生、发展的临床病理过程提供临床前研究工具。[方法]尝试将正常人卵巢组织移植于SCID小鼠皮下,待明确移植物存活并伴有新生血管形成后,通过免疫组化分析卵巢移植物属性;将带有绿色荧光蛋白的肿瘤细胞,接种于卵巢移植物内,形成新的皮下移植瘤,观察新的移植瘤生长及转移情况。[结果](1)卵巢移植物在小鼠皮下生长良好,未见明显感染或组织排斥反应,移植物可见典型血管形成;(2)组织学检查表明:植入SCID小鼠后存活的人卵巢组织形态与植入前的原始人卵巢组织形态相似;(3)免疫组化分析表明:移植物标本为ER阳性和PR部分阳性,抗人CK-7阳性,抗人CD34阳性,表明移植物组织来源于人卵巢,有新生血管形成,仍为雌激素和孕激素依赖型;α-SMA的表达,类似于原始人卵巢组织;(4)接种于卵巢移植物的皮下肿瘤生长良好,并可见1只小鼠腹腔内转移瘤病灶。[结论]植入“人源性”卵巢组织形成新的皮下移植瘤,可模拟人卵巢癌细胞生长的人源性卵巢微环境,有利于肿瘤的生长和转移,较既往的小鼠模型更准确地模拟了卵巢癌发生、发展的临床病理过程。第六部分癌相关成纤维细胞通过PI3K/AKT/XIAP信号通路影响顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡[目的]本研究拟通过CAFs和卵巢癌细胞共培养的方法,阐明CAFs通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路,影响卵巢癌化疗效果。[方法]采用流式细胞术观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡改变;应用RT-PCR、Western-blot观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞内PI3K、AKT、XIAP传导通路中mRNA水平及蛋白水平的变化,以及通路抑制剂LY294002对CAFs引起的化疗耐药的逆转作用。[结果](1)通过流式细胞仪检测,DDP对卵巢癌细胞作用的最佳时间和浓度分别为48h,5.0μ g/ml;(2)卵巢癌细胞与CAFs共培养后,DDP诱导的癌细胞凋亡显着减少(p<0.05);(3)Real-timePCR检测卵巢癌细胞内PI3K mRNA的表达共培养组明显高于未共培养组,XIAP mRNA的表达较未共培养组也显着升高(p<0.05),AKT mRNA表达有所升高,但无统计学意义;(4)PI3K/XIAP蛋白表达共培养组明显高于非共培养组,差异有统计学意义(p<0.05),总AKT蛋白共培养组和非共培养组无明显变化,但磷酸化AKT(P-AKT)蛋白表达有显着差异,差异有统计学意义(p<0.01)。加入通路抑制剂LY294002后,共培养组XIAP蛋白表达明显降低。[结论]CAFs与卵巢癌细胞共培养后,CAFs分泌的某种生长因子可使PI3K/AKT/XIAP信号转导通路上调,影响了 DDP诱导的卵巢癌细胞的凋亡。
卢飞飞, 王黎明, 姚如永, 孙显璐[4]2011年在《RRM2在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达及其与血管生成的关系》文中研究表明目的探讨核糖核苷酸还原酶小亚基(RRM2)在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其与血管生成的关系。方法采用免疫组织化学PV-6000二步法和RT-PCR法,检测RRM2、CD105(Endoglin)在正常卵巢、良性卵巢肿瘤、低度潜在恶性上皮性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织中的表达,用CD105(Endoglin)标记微血管密度(MVD),并分析RRM2 mRNA和CD105 mRNA表达的关系。结果 (1)低度潜在恶性上皮性卵巢肿瘤组织(1.586±0.650,66.67%)和上皮性卵巢癌组织(1.870±0.618,69.35%)的RRM2 mRNA表达量和蛋白阳性表达率均高于正常卵巢组织(0.771±0.495,0)和良性卵巢肿瘤组织(0.952±0.601,26.67%)(P<0.05)。(2)低度潜在恶性上皮性卵巢肿瘤组织(2.190±0.512,23.15±4.38)和上皮性卵巢癌组织(2.735±0.636,25.27±6.91)中的CD105 mRNA表达量和MVD均高于正常卵巢组织(0.686±0.637,3.40±1.78)和良性卵巢肿瘤组织(0.763±0.547,12.15±2.29)(P<0.05)。(3)RRM2 mRNA表达量和蛋白阳性表达率在低度潜在恶性组和FIGOⅠ～Ⅱ期卵巢癌组高于正常卵巢组和良性卵巢肿瘤组(P<0.05),在FIGOⅢ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期(t=-2.370,χ2=5.937,P<0.05)。(4)RRM2 mRNA和CD105mRNA之间表达呈正相关(r=0.713,P<0.05)。结论 RRM2可能参与上皮性卵巢癌发生的早期事件,对上皮性卵巢癌的血管生成可能有一定促进作用,有望成为一个新的早期诊断指标。
卢飞飞[5]2011年在《RRM2在上皮性卵巢癌中的表达及其与血管生成关系的研究》文中研究指明目的本实验探讨核糖核苷酸还原酶小亚基(RRM2)在上皮性卵巢癌中的表达及其与血管生成的关系。方法采用免疫组化PV-6000二步法和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,在15例正常卵巢组织、15例良性卵巢肿瘤组织、6例低度潜在恶性上皮性卵巢肿瘤组织和62例原发上皮性卵巢癌组织中检测RRM2、血管内皮细胞特异标记物-CD105(Endoglin)的表达及RRM2、CD105的mRNA表达量,用CD105标记微血管密度(MVD),分析RRM2mRNA和CD105mRNA表达的关系,并对患者进行术后生存情况随访,以研究两者表达与预后的关系。结果(1)低度潜在恶性卵巢肿瘤组和上皮性卵巢癌组中的RRM2mRNA表达量(1.586±0.650,1.870±0.618)和蛋白阳性率(66.67%,69.35%),均高于正常卵巢组和良性卵巢肿瘤组中的RRM2mRNA表达量(0.771±0.495,0.952±0.601)和蛋白阳性率(0,26.67%)(P<0.05)；低度潜在恶性卵巢肿瘤组和上皮性卵巢癌组中的CD105mRNA表达量(2.190±0.512,2.735±0.636)和MVD计数(23.15±4.38,25.27±6.91),均高于正常卵巢组和良性卵巢肿瘤组中的CD105mRNA表达量(0.686±0.637,0.763±0.547)和MVD计数(3.40±1.78,12.15±2.29)(P<0.05)。(2)RRM2mRNA表达量和蛋白阳性表达率在FIGOⅢ-Ⅳ期高于Ⅰ-Ⅱ期(t=-2.370,χ2=5.937,P<0.05); CD105mRNA表达量和MVD计数与临床病理分期、癌组织分化程度和淋巴结转移有关。(3)RRM2mRNA和CD105mRNA之间表达成正相关(r=0.713,P<0.05)。(4)对卵巢癌患者术后生存的随访资料进行分析,Kaplan-Meier法比较生存曲线表明,RRM2阳性表达者术后生存时间短(P<0.05),COX多因素生存分析表明RRM2mRNA高水平表达者的死亡危险度是低水平表达者的2.378倍,RRM2是上皮性卵巢癌预后的独立影响因素。结论(1)RRM2有望成为一个新的卵巢肿瘤诊断和判断预后的指标。(2)RRM2可能参与了卵巢癌的新生血管形成。(3)RRM2对上皮性卵巢癌患者的预后评估具有一定的指导意义
张惠丹, 张瑾, 李红霞[6]2017年在《上皮性卵巢癌中CD105的表达与肿瘤侵袭性的关系》文中研究表明卵巢癌是临床上死亡率最高的妇科恶性肿瘤之一,预后差,其对化疗药物产生的耐药性被认为是卵巢癌复发的根源。相关研究表明,CD105是TGF-β家族受体蛋白,多出现在肿瘤组织中新生血管内皮细胞中,与血管形成关系密切,而新生血管的形成在肿瘤的浸润及转移中都是关键性的因素,因此,CD105的表达上调可能会相应地影响肿瘤的侵袭性,继而成为一种更为显着的特异性肿瘤标记物。目的:通过流式细胞技术和细胞侵袭性试验,比较卵巢癌紫杉醇耐药细胞OC3/TAX300和原代敏感细胞OC3中CD105及相关干细胞基因的表达程度和两者侵袭性的差异,进一步探讨两者的关系及卵巢癌细胞的耐药机制。方法:培养获得稳定的人卵巢上皮癌紫杉醇耐药细胞株OC3/TAX300和原代敏感的卵巢癌细胞株OC3,并测定耐药细胞的耐药性,再分别进行免疫荧光标记用流式细胞试验的方法检测其中CD105、CD44、VCAM-1的表达,并用Transwell小室侵袭实验观察两种细胞侵袭能力的差异。结果与结论:卵巢癌耐药细胞OC3/TAX300中CD105、CD44、VCAM-1的表达明显高于原代敏感的卵巢癌细胞(P<0.01);卵巢癌耐药细胞穿膜细胞数目显着高于原代敏感的卵巢癌细胞(P<0.01)。CD105及相关干细胞基因在卵巢癌耐药细胞株OC3/TAX300中的表达明显高于原代敏感株OC3,且前者的侵袭能力显着高于后者,说明卵巢耐药肿瘤细胞的侵袭能力的增强可能与细胞中CD105的高表达有关。CD105表达的上调可能与卵巢癌细胞的侵袭性及紫杉醇化疗耐药有一定的相关性。因CD105在血管生成过程中的促进作用,使其有希望成为抗肿瘤治疗的新靶点,有良好的研究前景。
崔亚杰[7]2017年在《miR-199a-3p在上皮性卵巢癌的发展和铂类耐药中的作用研究》文中提出卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,也是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤。根据WHO组织学分型,上皮性卵巢癌(epithelia ovarian cancer,EOC)是卵巢癌中最多见的组织学类型,EOC的标准治疗方案为“初次理想的肿瘤细胞减灭术+以铂类为基础的联合化疗”,临床工作中我们发现尽管化疗是其最重要的辅助治疗手段,但很多患者在治疗过程中出现原发或继发性化疗耐药,使化疗效果不理想,复发率和死亡率居高不下,因此对卵巢癌转移、复发及耐药过程中参与的生物分子的研究已成为卵巢癌研究热点。通过对卵巢癌生物学和代谢机制的探索,期望找出卵巢癌分子靶向治疗的有效靶点已成为目前卵巢癌研究的重要课题。研究发现,miRNA在细胞的调控方面具有重要作用,一方面miRNA通过控制癌细胞的启动,调控癌细胞的增殖、侵袭和凋亡;另一方面作为与卵巢癌细胞耐药密切相关的信号通路的上游或下游的效应因子,miRNA可以促进或抑制肿瘤细胞的凋亡从而提高或降低卵巢癌细胞的化疗敏感性。通过查阅大量文献发现miR-199a-3p在多种癌症中异常表达,如肝癌、前列腺癌或乳腺癌等,但是miR-199a在卵巢癌中作用的研究报道并不多见。在前期工作中我们通过芯片筛选并PCR验证发现miR-199a-3p在铂类耐药的卵巢癌细胞中表达水平下调,明显低于铂类敏感细胞中的表达水平,提示miR-199a-3p可能在维持或调节卵巢癌生物学行为中发挥重要作用。miR-199a-3p在卵巢癌细胞中的差异表达具有何种意义?miR-199a-3p对卵巢癌生物学行为有何影响?miR-199a-3p在卵巢癌细胞复发、转移和耐药中发挥作用的调控机制是什么?为了回答上述问题,本研究选择miR-199a-3p作为卵巢癌发展和耐药的研究靶点。通过临床、细胞及活体不同水平的研究,初步探讨miR-199a-3p在上皮性卵巢癌中的临床意义及miR-199a-3p在EOC的发展及铂类化疗耐药中的作用和可能调控机制。整合素是细胞表面粘附分子的一种,由α和β两个次级别单位通过非共价键连接形成的细胞跨膜蛋白,胞外连接基质蛋白或相邻细胞,胞内连接细胞骨架系统,从而构成肿瘤细胞赖以生存发展的空间纽带;另一方面,整合素作为受体可与多种细胞因子结合,从而向细胞内外双向传导生物信息,构成肿瘤细胞感受外界刺激并做出相应反应的的信息枢纽。近年研究发现整合素表达于恶性肿瘤表面,并在肿瘤转移、复发和化疗耐药中表达上调,整合素可能参与了肿瘤细胞的侵袭、转移和化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡过程。利用生物信息分析软件预测及双荧光素酶报告基因验证miR-199a-3p在卵巢癌中的靶基因为ITGB8(Integrinβ8,整合素β8),通过进一步实验证明miR-199a-3p对ITGB8的靶向调控在EOC发展及铂类耐药中发挥的作用,初步探讨miR-199a-3p/ITGB8信号通路参与EOC发展及铂类耐药的机制。目前,关于miR-199a-3p通过ITGB8参与EOC发展及铂类耐药的机制尚无报道,本研究将为miR-199a-3p在EOC发展及铂类耐药中的作用提供有力的直接证据。研究目的研究miR-199a-3p在EOC中的临床意义及miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞生物学行为的影响。初步探讨miR-199a-3p在EOC的发展和铂类耐药中的作用和分子机制,为控制EOC的发展和化疗耐药提供候选靶点和理论支持。研究方法1.以正常卵巢组织、良性及交界性卵巢肿瘤及EOC铂类耐药和铂类敏感病例的病理切片及临床资料为研究对象,q RT-PCR法对不同组别miR-199a-3p表达水平进行检测,统计分析miR-199a-3p基因表达差异与EOC临床病理因素、铂类耐药的相关性;2.选取卵巢癌亲本株SKOV3细胞进行细胞培养,并通过浓度递增的方法构建SKOV3/DDP(SKOV3顺铂耐药细胞)细胞株,通过MTT、Transwell和Wound healing方法检测SKOV3/DDP及SKOV3在细胞耐药指数、迁移和侵袭等方面的生物学效能,通过q RT-PCR方法检测SKOV3和SKOV3/DDP中miR-199a-3p表达水平的差异;3.脂质体法用miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor分别转染SKOV3/DDP及SKOV3细胞,通过MTT、Transwell和Wound healing方法检测转染后SKOV3/DDP及SKOV3细胞耐药指数、迁移、侵袭能力和细胞凋亡的变化,初步分析miR-199a-3p对卵巢癌细胞生物学行为的影响;4.利用生物信息分析软件预测并查阅文献总结miR-199a-3p可能靶基因,q RT-PCR和WB方法检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞中可能靶基因m RNA表达水平和蛋白表达水平;综合分析ITGB8是miR-199a-3p的可能靶基因;5.通过脂质体法分别转染miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor后检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞中ITGB8表达的变化进一步验证miR-199a-3p对ITGB8的靶向调控作用;6.通过双荧光素酶报告基因验证证实ITGB8是miR-199a-3p的靶基因,并确定了miR-199a-3p与ITGB8的结合位点;7.利用重组质粒技术构建ITGB8过表达载体:在NCBI网站查找ITGB8基因序列,找出ITGB8的ORF,根据pc DNA3.1的载体图谱选择合适的酶切位点,设计引物,通过PCR的方式克隆目的基因,被消化后插入pc DNA3.1,构建pc DNA3.1-ITGB8重组质粒;8.通过脂质体法用miR-199a-3pmimic、inhibitor和(或)pc DNA3.1-ITGB8分别转染卵巢癌SKOV3/DDP及SKOV3细胞,分析miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞生物学行为的影响;9.MTT法检测不同转染组对顺铂的化疗敏感性;Transwell检测不同转染组细胞侵袭能力;划痕实验检测不同转染组细胞迁移能力,分析miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞化疗耐药、侵袭和转移能力的影响。10.流式细胞术检测各个转染组的细胞周期和凋亡的变化,分析miR-199a-3p通过靶向调控ITGB8对卵巢癌细胞增殖和凋亡的作用。11.构建卵巢癌原位异种模型:分别注射SKOV3和SKOV3/DDP细胞悬液于裸鼠卵巢包膜下,成瘤后比较卵巢原位移植瘤大小、重量及腹腔转移结节数目等。12.通过q RT-PCR方法检测分别注射SKOV3和SKOV3/DDP细胞后成瘤的卵巢原位移植瘤组织标本中miR-199a-3p表达水平。13.通过q RT-PCR和Westen-Blot方法检测注射SKOV3和SKOV3/DDP细胞后成瘤的卵巢原位移植瘤组织标本中ITGB8的m RNA表达水平和蛋白表达量。研究结果1.miR-199a-3p在EOC中的临床意义及其与铂类耐药的关系(1)与正常卵巢组织相比,miR-199a-3p的表达在卵巢良性上皮性肿瘤中无明显差异,卵巢交界性肿瘤中轻微下降,而EOC中明显下降;(2)相对于EOC铂类敏感组织,耐药组织中miR-199a-3p的相对表达水平明显下降,提示miR-199a-3p与EOC的耐药有相关性;(3)根据手术病理分期,随着卵巢癌期别增加,miR-199a-3p的表达逐渐减少;不同组织学分级中,分化程度越差,miR-199a-3p的表达水平越低;在有无合并淋巴转移中,伴淋巴转移者较无淋巴转移者miR-199a-3p的表达明显减低;不同组织学类型miR-199a-3p的表达未见明显差异。说明miR-199a-3p的表达水平与EOC分期、分化程度及淋巴有无转移等临床特征具有相关性,随着EOC分期和恶性程度的升高,miR-199a-3p表达水平呈逐渐下降趋势,miR-199a-3p与EOC的发展相关。2.miR-199a-3p在卵巢癌细胞中的表达及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响(1)培养并构建卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP,在细胞化疗耐药、迁移和侵袭等生物学效能方面,SKOV3/DDP细胞均明显强于SKOV3细胞;(2)SKOV3/DDP细胞中miR-199a-表达水平明显低于SKOV3细胞;(3)上调miR-199a-3p的表达,SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性下降,敏感性增加,显着促进顺铂介导的凋亡,抑制癌细胞生长、迁移和侵袭能力;下调miR-199a-3p的表达,SKOV3细胞对顺铂的敏感性下降,耐药性增加,显着抑制顺铂介导的凋亡,增强癌细胞生长、迁移和侵袭能力;提示miR-199a-3p在EOC中具有抑癌基因的作用,抑制卵巢癌细胞的生长、侵袭和迁移,促进卵巢癌细胞的凋亡,并增加卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性;3.miR-199a-3p靶向调控ITGB8(1)生物信息分析及文献总结miR-199a-3p的可能靶基因,q RT-PCR和WB方法检测SKOV3/DDP及SKOV3中这些可能靶基因m RNA表达水平和蛋白表达水平,在这些可能靶基因中ITGB8表达及变化显着;(2)利用生物信息功能分析miR-199a-3p靶基因中ITGB8与miR-199a-3p关联性强,而整合素与卵巢癌的发展和化疗耐药相关;(3)miR-199a-3p表达下调时,ITGB8蛋白表达水平升高;miR-199a-3p表达上调则显着抑制ITGB8蛋白表达水平,miR-199a-3p对ITGB8呈负向调控作用。(4)双荧光素酶报告基因实验证实miR-199a-3p直接靶向调控ITGB8,ITGB8-3’UTR-2是miR199a-3p和ITGB8的靶结合位点;4.miR-199a-3p通过直接靶向调控ITGB8影响卵巢癌细胞生物学行为(1)构建pc DNA3.1-ITGB8重组质粒,过表达ITGB8;(2)下调miR-199a-3p或上调ITGB8时,卵巢癌细胞对顺铂的敏感性降低,耐药性增加,同时下调miR-199a-3p并上调ITGB8时卵巢癌细胞对顺铂的敏感性进一步降低,耐药性进一步增加,说明下调miR-199a-3p可以增强ITGB8的作用;另一方面,当miR-199a-3p表达上调,细胞对顺铂敏感性增加,耐药性减低,同时上调miR-199a-3p和ITGB8时,ITGB8的作用被抑制,说明下调miR-199a-3p可以抑制ITGB8的作用。(3)ITGB8表达上调时,SKOV3细胞的迁移和侵袭能力增加,下调miR-199a-3p可以增强ITGB8的这一作用;上调miR-199a-3p则降低ITGB8的这一作用。(4)流式细胞技术检测不同转染组细胞周期和细胞凋亡率显示:上调ITGB8的表达可以显着抑制细胞增殖和顺铂介导的凋亡,下调miR-199a-3p可以增强ITGB8的这一作用;上调miR-199a-3p则降低ITGB8的这一作用。(5)构建卵巢癌原位异种模型,与注射SKOV3组小鼠模型相比,SKOV3/DDP组裸鼠模型形成较多的腹腔转移结节,卵巢原位肿瘤的体积更大,重量更重;肿瘤组织内miR-199a-3p的表达水平明显降低,ITGB8 m RNA表达水平和蛋白含量明显升高。结论1.miR-199a-3p的表达随EOC恶性程度及分期的升高而下降,并在铂类耐药组织中表达水平下降,说明miR-199a-3p与EOC的发展和铂类耐药相关;2.miR-199a-3p通过直接靶向作用负向调控ITGB8,促进癌细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性;3.miR-199a-3p通过直接靶向作用负向调控ITGB8抑制卵巢癌细胞的生长、侵袭和转移;4.在动物模型内,与卵巢癌亲本细胞相比,卵巢癌顺铂耐药细胞原位成瘤能力及转移能力更强,其原位肿瘤组织内miR-199a-3p的表达水平下降,ITGB8的表达增加;5.miR-199a-3p/ITGB8信号通路在EOC发展和铂类化疗耐药中发挥了抑癌基因的作用。当miR-199a-3p表达下调,通过上调靶基因ITGB8的表达,增加卵巢癌细胞的生长、侵袭和转移,从而促进卵巢癌的发展;同时使癌细胞的凋亡减少,通过卵巢癌铂类耐药中的靶后机制导致化疗耐药,miR-199a-3p有望成为卵巢癌靶向治疗的新的生物分子。
刘金[8]2016年在《MicroRNA在耐药及敏感卵巢癌细胞系中的差异表达及microRNA-30a-5p在卵巢癌耐药中的作用》文中提出在女性常发的生殖器恶性肿瘤中卵巢恶性肿瘤的发病率较高,其中85~90%为上皮性卵巢癌,对女性的身心健康造成了严重的威胁。病人的5年生存率处于30~40%的范围内,由于早期的卵巢癌均没有明显的诊断指标,并且该疾病极易发生早期侵袭及转移、病人对化疗药具有耐药性,使其在女性所有恶性肿瘤中的死亡率排列第一。目前临床上治疗该病的规范化疗法为联合使用肿瘤细胞减灭术与术后使用紫杉醇和铂类等药物化疗,但铂类药物涉及的耐药性问题也值得关注。卵巢癌病人产生铂类药物耐药性的过程需要多种因素相互作用,通过研究micro RNA一方面能够从一定程度上阐述这种生物学效应,另一方面还有助于临床上预测、或干涉耐药性,microRNA除了能有效的调节细胞的生长、增殖、应激、凋亡及脂肪代谢等作用,体外研究结果同样表明在卵巢癌耐药机制中microRNA扮演着重要的角色。本实验初步的探讨了卵巢癌产生耐药性的主要机制,分析microRNA在该过程中扮演了重要的角色,以期为未来相关领域寻找并分析疾病的铂类耐药性的治疗靶点给予新的研究方向。microRNA主要存在于真核生物中,其包括的核苷酸数量约为20~25个,此类非编码小分子RNA能够介导基因转录后调控其表达水平,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等过程。超过50%的microRNA存在于肿瘤细胞基因组中变异性较高的部位,如杂合性丢失区、脆性位点和基因组断裂点等,以上区域是癌细胞发生染色体转位、替换、丢失、基因扩增的主要部位。近几年越来越多的研究发现micro RNA发挥着癌基因或抑癌基因样作用,参与肿瘤发生发展、外侵转移和转归预后等多个环节。虽然,近几年有大量的研究表明microRNA与卵巢癌的发生、发展有着密切的关系,但卵巢癌发病机制复杂,至今对卵巢癌早期诊断、治疗和判断预后仍然没有特异性的指标。本研究利用基因芯片和RT-PCR对耐药和敏感卵巢癌细胞系中microRNA的表达谱进行研究,寻找microRNA的差异表达,进一步研究差异表达显着的microRNA在化疗耐药机制中的作用,为临床逆转卵巢癌耐药、提高卵巢癌治疗效果奠定理论基础。第一部分耐药及敏感卵巢癌细胞系中microrna的差异表达目的:利用基因芯片研究两组卵巢癌细胞系skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1中microrna的表达谱,通过检测耐药及敏感卵巢癌细胞系中表达microrna的差异性,为未来相关领域寻找并分析卵巢癌的铂类耐药的治疗靶点给予新的研究方向。方法:常规培养skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1细胞株,trizol法分别抽提总rna,对microrna分别进行cy3和cy5荧光标记,将所选细胞系与包含人类和小鼠的共924条microrna成熟的序列进行杂交,最后进行microrna微阵列芯片杂交检测分析,获得microrna表达谱,利用rt-pcr方法对筛选出的microrna进行可靠性验证,鉴定出与卵巢癌耐药相关的microrna。结果:1rna的质量检测:从skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1细胞株提取出的总rna浓度值依次为:0.61、0.78、1.38及1.53(单位为μg/μl),a260/a280比值均处于1.9~2.0范围内,琼脂糖凝胶电泳实验的结果显示,清晰的条带包括18s及28s,其亮度比大概等于1:2,提取的总rna纯度符合研究要求,未发生显着的降解。2microrna芯片测定结果:本研究经过cy3及cy5荧光颜色标记、纯化、基因芯片杂交、图像采集、数据进行归一化处理后,分别以两种细胞cy3、cy5荧光标记信号强度的比值为标准来判定差异表达的microrna。结果显示:其中skov3/dppvsskov3细胞系中hsa-mir-99a-5p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-34c-5p,hsa-mir-31-3p,hsa-mir-181d等19个micrornas高表达,hsa-mir-96-5p,hsa-mir-200c-3p,hsa-mir-193b-3p等20个micrornas低表达。coc1/dppvscoc1细胞系中hsa-mir-34a-5p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181c-3p等22个micrornas高表达,hsa-mir-892b,hsa-mir-505-5p等24个micrornas低表达。其中hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181在两种耐药卵巢癌细胞系中均表达升高。结论:在耐药及敏感卵巢癌细胞系skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1中microrna的表达谱存在明显差异。在所有差异表达的micrornas中,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181在两种化疗耐药卵巢癌细胞系中表达水平均高于敏感细胞系,推测二者可能是在microrna水平与卵巢癌化疗耐药相关的指标,而且利用rt-pcr方法对mir-30a-5p,hsa-mir-181在两种化疗耐药卵巢癌细胞系中进行可靠性验证,与基因芯片的结果一致,且以mir-30a-5p升高最为显着。第二部分microrna-30a-5p对卵巢癌耐药细胞的影响目的:选择敏感及耐药卵巢癌细胞系中差异表达最显着的microrna-30a-5p作为研究因子,探讨microrna-30a-5p对卵巢癌细胞耐药的影响,进一步验证microrna芯片筛选的结果。方法:常规培养skov3/ddp及skov3细胞系,实时荧光定量rt-pcr方法测定细胞系中microrna-30a-5p的表达情况,同时检测卵巢癌敏感及耐药组织标本中microrna-30a-5p的表达情况。lipofectamin2000转染microrna-30a-5ppre-mir、inhibitors至敏感及耐药细胞中,通过荧光显微镜检测转染效率,mtt法检测细胞增殖情况,细胞计数法检测转染后对细胞活性的影响。结果:1实时荧光定量rt-pcr方法测定细胞系和卵巢癌组织标本中microrna-30a-5p的表达情况:microrna-30a-5p在耐药细胞株中的表达升高;在卵巢癌耐药的组织标本中表达也升高,结果与细胞株microrna芯片结果一致。2skov3/ddp和skov3细胞转染24h后microrna-30a-5p的表达改变:实时荧光定量rt-pcr结果显示skov3细胞转染pre-mir30a-5p24h后microrna-30a-5p的△ct为2.3,阴性对照组△ct为7.7。转染pre-mir30a-5p24h后,和阴性对照组相比,测定microrna-30a-5p的表达量高出42.2倍。实时荧光定量rt-pcr结果显示skov3/ddp细胞转染inhibitor24h后microrna-30a-5p的△ct为8.9,阴性对照组△ct为5.6。转染inhibitor24h后,和阴性对照组相比,测定microrna-30a-5p的表达量高出9.8倍(负相关),表明转染成功。3microrna-30a-5p对skov3/ddp和skov3细胞耐药性的影响:转染pre-mir30a-5p后的skov3细胞增加了对顺铂的耐药性。ic50为:3.5±0.26ug/ml;阴性对照组为:1.8±0.12ug/ml。两者差异显着(p<0.05)。转染inhibitor后的skov3/ddp细胞降低了对顺铂的耐药性。ic50为:7.6±0.38ug/ml;阴性对照组为:13±0.47ug/ml。两者差异显着(p<0.05)。4 microRNA-30a-5p对SKOV3/DDP和SKOV3水平产生的影响:转染pre-mi R30a-5p 24h后,和阴性对照组相比,细胞接种的第2天起细胞水平明显升高(P<0.05),细胞的活性显着上升。转染inhibitor 24h后,和阴性对照组相比,细胞接种的第2天起细胞水平明显下降(P<0.05),细胞的活性显着降低。结论:实时荧光定量RT-PCR的结果与细胞株基因芯片表达谱分析一致,microRNA-30a-5p在卵巢癌耐药细胞中高表达,在化疗耐药型组织标本中也有较高的表达,提高microRNA-30a-5p的表达可以增加敏感细胞的耐药性、提高细胞活性。故推测卵巢癌耐药可能与microRNA-30a-5p的表达上调有关。设想是否将来临床可以通过下调microRNA-30a-5p的表达进而逆转卵巢癌细胞的耐药,增加其对顺铂的敏感性。第叁部分microRNA-30a-5p在卵巢癌耐药细胞中的作用目的:通过上调或下调microRNA-30a-5p在卵巢癌敏感及耐药细胞中的表达,检测对卵巢癌细胞增殖、转移能力及裸鼠呈瘤能力的影响,探讨microRNA-30a-5p在卵巢癌细胞耐药中的作用机制。方法:通过转染pre-mi R30a-5p或者inhibitor,上调或下调敏感及耐药细胞中microRNA-30a-5p的表达,通过测定细胞生长曲线实验、集落形成实验及体内裸鼠成瘤实验来检测其对细胞增殖能力的影响;通过transwell迁移和侵袭实验来检测其对细胞转移能力的影响。结果:结果表明:转染microRNA-30a-5p inhibitor进入卵巢癌耐药细胞中,可以抑制细胞的增殖,减少细胞克隆形成和裸鼠成瘤能力并在体外减弱细胞的迁移和侵袭能力。而转染pre-miR30a-5p进入卵巢癌亲本株中,能促进细胞生长,促进形成细胞集落和裸鼠成瘤,提升体外细胞的侵袭及迁移作用。结论:microRNA-30a-5p能促进细胞生长、促进细胞集落形成和提高裸鼠成瘤能力,增强体外细胞迁移和侵袭能力。microRNA-30a-5p可能通过调节细胞生长及转移机制影响卵巢癌细胞耐药,为逆转卵巢癌耐药、改善卵巢癌预后提供了新的研究思路及靶点。
徐燕[9]2010年在《Endoglin基因沉默对卵巢癌微血管内皮细胞干扰效应的研究》文中认为研究背景:肿瘤血管发生依赖于血管内皮细胞的活化、增殖和迁徙。肿瘤起源的血管内皮细胞(Tumor-derived microvascular endothelial cells,TdMECs)不同于正常血管内皮细胞,因此分离和培养TdMECs对肿瘤血管发生机制和血管生成抑制的研究有重要的价值。Endoglin (CD105)是一种与内皮细胞增殖相关的细胞表面糖蛋白,它是转化生长因子(Transforming Growth Factor ,TGF-β)的受体,后者是调节细胞增殖和分化的多功能细胞因子。Endoglin对TGF-β的调节作用主要是抑制TGF-β的生物学效应,拮抗其对血管内皮细胞的抑制作用。Endoglin高表达于创伤、胚胎、炎症以及肿瘤组织的血管内皮细胞,在血管发生和血管壁的维持中有重要作用。目前,已有多项关于Endoglin在肿瘤血管发生中的研究,并用以评价Endoglin作为新的基因治疗靶点的价值。研究目的:利用自主构建的Endoglin基因siRNA的表达载体,转染并观察其对卵巢癌微血管内皮细胞(ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells ,ODMECs)的影响,探讨Endoglin基因沉默(RNA interference, RNAi)对ODMECs生长、增殖及内皮细胞管腔样结构(tubule-like structure,TLS)形成的抑制效应,深入了解Endoglin在抗肿瘤血管生成中的作用,为建立新的抗肿瘤治疗靶点奠定实验基础。研究方法:1. ODMECs分离、纯化和培养。选取卵巢上皮性恶性肿瘤组织进行原代卵巢癌微血管内皮细胞分离和培养,采用胰酶、胶原酶、dNaseI酶联合消化法获取ODMECs,并用连接有CD31抗体的免疫磁珠进行纯化。通过形态学、生化和表型特征对所获得的ODMECs进行鉴定;并检测其摄取乙酰化低密度脂蛋白(Acetylated-Low-Density Lipoprotein,DIL-acLDL)和结合凝集素Ⅰ(Ulex europaeus lectin I,UEA-Ⅰ)的能力,同时还观察到了其在体外培养中TLS的形成。2.选定Genbank号为NM_000118的Endoglin mRNA序列,作为siRNA设计的模板。设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGenesil- 1中构建重组质粒,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切和序列测定。3.利用构建成功的Endoglin基因siRNA表达质粒pGenesil-ENG1和pGenesil-ENG2,通过脂质体介导转染ODMECs,并通过半定量RT - PCR观察转染后48小时重组质粒对Endoglin mRNA表达的影响;MTT法检测转染后ODMECs细胞增殖的变化;并且通过光镜观察转染pGenesil-ENG1后,ODMECs体外二维管腔样结构形成的变化。主要结果:1.采用胰酶、胶原酶、dNaseI酶联合消化法分离人卵巢癌微血管片段,利用MACS MicroBeads免疫磁珠内皮细胞分选系统纯化ODMECs,连续两次分选,所获细胞纯度高达99.65%,生长状态良好、可传代培养。应用光镜、免疫细胞化学、细胞流式、RT-PCR等技术对所获得的内皮细胞进行了鉴定,所获细胞呈现不均一性,传代后上述情况有所减轻;细胞FⅧ-RAg、CD31、CD34、CD105表达阳性;可摄取DIL-ac-LDL和结合UEA-I;在体外培养过程中,ODMECs在有细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)和无ECM的培养条件下可形成不同特点的TLS。2.根据Genbank中报道的Endoglin基因核苷酸序列(complementary DNA,cDNA),设计出了两条阻断Endoglin基因表达的RNAi序列,通过酶切鉴定证实Endoglin真核表达载体pGenesil-ENG1、pGenesil-ENG2构建成功,插入片段测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。3.利用构建成功的Endoglin基因siRNA表达质粒pSilencer-ENG1、pSilencer-ENG2,通过脂质体介导成功转染ODMECs,其转染效率与国外文献报道相符。4.转染ODMECs细胞48h后,同阴性质粒pGenesil-H和未转染组相比,pGenesil-ENG1和pGenesil-ENG2均可引起靶基因表达水平的显着性下降。采用MTT法发现, Endoglin基因被抑制后ODMECs的生长出现明显的抑制(P<0.01)。此外,Endoglin基因被抑制后可明显减少ODMECs体外TLS的形成(P<0.01),表现为管腔数目的减少和结构上的差异。结论上述实验结果表明,酶联合消化法和免疫磁珠细胞分选技术相结合能有效地获得高纯度ODMECs,且具可传代性,在体外培养可形成TLS结构。本研究所摸索出的ODMECs分离和纯化方法为建立其它实体瘤内皮细胞培养体系也积累了经验。有助于认识肿瘤环境诱导下的内皮细胞(Endothelial Cell,EC)异质性,而且为深入研究肿瘤血管生成和抗血管生成治疗提供了更为适用的实验材料和体外模型。本实验成功构建的Endoglin基因siRNA表达载体pGenesil-ENG1和pGenesil-ENG2,可下调Endoglin在卵巢癌微血管内皮细胞中的表达,抑制ODMECs的增殖和体外二维管腔样结构的形成。结果表明通过靶向肿瘤新生血管内皮表达的Endoglin,结合RNAi技术可作为一种有效的基因调控手段,有望成为抗肿瘤血管生成的有效策略,为抗卵巢癌血管生成的治疗摸索了新的有效基因靶点。
郭海荣, 李增山, 贺帅, 王小燕, 刘萍[10]2016年在《CD105和ki67在人卵巢癌细胞中的表达并确定表达部位》文中指出目的检测CD105和Ki67在人卵巢癌细胞中的表达情况及确定其表达部位。方法采用Western blot筛选出6种人卵巢癌细胞系中CD105和Ki67均高表达的细胞系;并用免疫荧光染色法明确CD105和Ki67在细胞内的表达部位。结果CD105和Ki67在人卵巢癌OVCAR3细胞中均高表达;CD105主要表达于OVCAR3细胞的细胞质和细胞膜,Ki67主要表达于OVCAR3细胞的细胞核。结论人卵巢癌OVCAR3细胞中CD105和ki67均呈高表达,CD105定位于细胞质和细胞膜,ki67定位于细胞核,为进一步研究CD105和ki67在卵巢癌发生发展中的作用机制奠定基础。
参考文献：
[1]. 卵巢上皮性肿瘤Endoglin表达的初步研究[D]. 王丹. 第叁军医大学. 2004
[2]. CD31、CD105和PTTG、ILK、Mig-7在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床病理学意义[D]. 王立. 天津医科大学. 2012
[3]. 人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞促癌作用的研究[D]. 傅士龙. 南京医科大学. 2014
[4]. RRM2在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达及其与血管生成的关系[J]. 卢飞飞, 王黎明, 姚如永, 孙显璐. 肿瘤防治研究. 2011
[5]. RRM2在上皮性卵巢癌中的表达及其与血管生成关系的研究[D]. 卢飞飞. 青岛大学. 2011
[6]. 上皮性卵巢癌中CD105的表达与肿瘤侵袭性的关系[J]. 张惠丹, 张瑾, 李红霞. 中国优生与遗传杂志. 2017
[7]. miR-199a-3p在上皮性卵巢癌的发展和铂类耐药中的作用研究[D]. 崔亚杰. 第四军医大学. 2017
[8]. MicroRNA在耐药及敏感卵巢癌细胞系中的差异表达及microRNA-30a-5p在卵巢癌耐药中的作用[D]. 刘金. 河北医科大学. 2016
[9]. Endoglin基因沉默对卵巢癌微血管内皮细胞干扰效应的研究[D]. 徐燕. 第叁军医大学. 2010
[10]. CD105和ki67在人卵巢癌细胞中的表达并确定表达部位[J]. 郭海荣, 李增山, 贺帅, 王小燕, 刘萍. 中国妇幼健康研究. 2016
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