赵雍[1]2016年在《中药成分对细胞色素P450酶介导的药物代谢体内外抑制作用》文中研究说明植物药长期用于各种传统医学实践中,特别是在亚洲各国应用极其广泛。然而,有关植物药的安全性评价研究则多有欠缺。而且人们常常把它们当做家庭用药,与处方药联合使用,这就进一步造成了用药安全问题。这也使得有关食品或植物药引起的相互作用得到了实质性的关注,并通过大量的研究来完善这一特定领域的认知。深入了解植物药-西药相互作用的作用机制,对于评价和减少由于药物联合应用所引起的临床风险,特别对于治疗指数较窄的西药,有着不可或缺的作用。其中,中药提取物通过药物代谢酶引起相互作用的潜在性研究,有助于临床医师评估中草药治疗的安全性和有效性。本论文主要由两部分构成：文献综述和实验研究。实验研究目的主要是通过对3种中药单体成分(延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱)对细胞色素P450 (CYP)酶的体外抑制作用及其机制的研究,评价这3种中药成分与传统西药合用时产生药物相互作用的可能性。并且,在体外实验基础上,采用Cocktail探针药物法,进一步研究其延胡索乙素对CYP1A2、2D6和3A4酶探针药物在Beagle犬体内代谢的影响,以期探讨临床应用时出现相关中药-西药相互作用的可能性。1.文献综述对本论文的研究背景进行了文献综述,包括植物药应用及其植物药-西药相互作用现状,细胞色素P450酶及其介导的植物药-西药相互作用,检测细胞色素P450酶介导相互作用的方法,以及本研究中3种中药单一成分应用及其相关的药物相互作用。2.实验研究(1)延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱对人细胞色素1A2、2D6、3A4酶的体外抑制作用本实验采用了酶体外孵育方法,以3种人重组细胞色素P450酶1A2、2D6和3A4为主要CYP代谢酶,研究3种中药单一有效成分(延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱)对上述3种CYP酶代谢活性抑制作用。在体外酶反应实验中,分别以非那西丁,右美沙芬和睾酮为细胞色素P450酶1A2、2D6和3A4的特异性底物,采用HPLC方法测定其代谢产物含量,并以代谢产物的产生量来计算CYP酶活性。在本实验中,用IC50值评价抑制作用的大小,以α-萘黄酮、奎尼丁和酮康唑分别作为CYP1A2、2D6和3A4的阳性对照抑制剂。本实验结果显示,3种中药单体成分对所观察的CYP酶均具有不同程度的抑制作用。其中,CYP2D6的抑制作用最为显着,延胡索乙素和小檗碱的IC50值分别为3.04±0.261μM和7.40±0.36μM。此外,3种中药成分也对CYP3A4和CYP1A2也有一定的抑制作用,抑制作用强度依次为CYP2D6> CYP3A4>CYP1A2。在叁种中药成分中,甲基莲心碱对所检测CYP酶的抑制作用最弱。结合中药成分结构分析显示,中药成分对CYP酶的抑制作用强度可能与他们的化学结构有关。实验结果提示,延胡索乙素和小檗碱对CYP2D6和CYP3A4酶的抑制作用,可能会使其与其它药物合用时产生临床相关的代谢性相互作用。(2)延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱对人细胞色素P450酶的体外抑制机制研究在本实验中,采用了酶体外孵育方法,以3种人重组细胞色素P450酶1A2、2D6和3A4为主要CYP代谢酶,研究3种中药单一有效成分(延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱)对上述3种CYP酶代谢活性的抑制作用机制。在体外酶反应实验中,分别以非那西丁,右美沙芬和睾酮为CYP1A2、2D6和3A4酶的特异性底物,采用HPLC方法测定其代谢产物含量,并以代谢产物的产生量来计算CYP酶活性。在本实验中仍以α-萘黄酮、奎尼丁和酮康唑分别作为CYP1A2、2D6和3A4酶的阳性对照抑制剂。分别用时间依赖性、NADPH依赖性抑制作用试验和Lineweaver-Burk法,来分别评价其可逆性抑制作用和不可逆性抑制作用(机制基础性抑制作用)机制。为了进一步分析其抑制作用机制,本实验还采用了Discovery Studio CDOCKER软件进行中药成分与CYP酶之间相互作用计算机化模拟。实验结果显示,3种中药成分对CYP3A4酶均显示出相近且显着的机制基础性抑制作用。此外,延胡索乙素对CYP1A2和2D6酶也能产生机制基础性抑制作用,而小檗碱仅对CYP2D6产生机制基础性抑制作用,而甲基莲心碱和小檗碱对CYP1A2均未显示出机制基础性抑制作用。可逆性抑制研究结果提示,延胡索乙素和小檗碱均对CYP2D6和3A4酶,同时具有可逆性抑制作用。计算机化模拟酶-化合物相互作用分析结果显示,延胡索乙素和小檗碱对CYP1A2、CYP2D6和CYP3A4酶的特异性氨基酸残基均能展示出氢键和孔键结合作用。上述实验结果表明,延胡索乙素和小檗碱对CYP2D6和3A4酶活性即具有可逆性又具有不可逆性抑制作用,提示延胡索乙素和小檗碱在临床治疗中与上述两种酶底物药物联合应用时,极有可能会产生相关的中药-西药相互作用。(3)延胡索乙素对Beagle犬体内CYP1A2、2D6和3A酶探针药物的代谢影响延胡索乙素是由传统中药提取出的单一有效成分,具有多种药理作用,并频繁应用于临床实践。特别在中国一直被广泛应用,近年来其应用也显着增加。本实验中采用Cocktail探针药物法(Cocktail probe法),研究延胡索乙素单次给药和多次给药对Beagle犬体内CYP1A2、2D6和3A酶活性的影响。在体内实验中,分别以咖啡因(3.0mg/kg),美托洛尔(2.33mg/kg)和咪达唑仑(0.45mg/kg)作为CYP1A2、2D6和3A酶的Cocktail特异性底物,采用HPLC法定量检测底物及其主要代谢产物血浆浓度,以底物及其代谢产物血浆中含量的变化,显示体内CYP酶代谢活性的变化。将6只雄性Beagle犬采用随机分为对照组和给药组。实验分为2个阶段。第1阶段：延胡索乙素首次(D1)灌胃给药(12mg/kg)的同时,灌胃给予含有3种CYP酶特异性底物的Cocktail探针药物,分别于药前及药后10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、 3h、4h、6h、8h、12h和24h取血,进行24h内药代动力学研究；此后,延胡索乙素连续灌胃给药(每天给药3次,每次12mg/kg,给药间隔约8h)4天,于D6,延胡索乙素和Cocktail探针药物同时灌胃给药,再次进行24h内药代动力学研究。第1阶段结束后,经过7天洗脱期,将对照组和给药组交叉对调,进行第2阶段实验,研究方法与第1阶段相同。本实验结果采用非房室模型,模拟计算各组的代谢参数,以Cmax、Tmax、AUC0-24h和AUC0-24h比作为主要代谢参数,对比两组之间的差异,评价其给药后对CYP酶活性的抑制作用。本实验结果显示,延胡索乙素对Beagle犬体内咖啡因和美托洛尔药物代谢显示出及其微弱的影响,提示其对CYP1A2和2D6酶代谢活性无显着作用。然而,相当于临床用量的延胡索乙素,无论单次或多次给药,均能显着增加咪达唑仑AUC0-24h(单次或多次给药分别增加39%或57%)、显着降低1-羟基咪达唑仑与咪达唑仑AUC (0-24h)比(单次或多次给药分别增加29%或22%),与对照组比较均有显着差异,提示其可能是通过CYP3A酶的抑制作用而引起咪达唑仑的体内累积。这与我们前面的体外CYP3A4酶实验结果相一致。本实验结果提示,延胡索乙素及其相关中药的广泛应用于临床,可能会带来由CYP3A酶介导的中药-西药相互作用,有必要通过临床研究进一步确定其可能存在的药物相互作用。3.结论体外实验结果显示,3种中药生物碱,延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱,对人CYP3A4、2D6和1A2酶活性均能产生一定的体外抑制作用,其作用强度与生物碱的结构有关。而且,延胡索乙素和小檗碱均对CYP2D6和3A4酶,不仅具有可逆性抑制作用,而且具有不可逆性抑制作用,提示其对CYP2D6或CYP3A4酶抑制作用,均可能产生临床相关的中西药物代谢性相互作用。在此基础上,体内实验结果也证实,相当于临床剂量的单次或多次给药后,延胡索乙素可以通过CYP3A酶抑制作用而产生的咪达唑仑积累,暗示当其与其它药物合用时很可能产生临床相关的药物相互作用。
黄勇[2]2016年在《桔小实蝇细胞色素P450酶系及其在马拉硫磷抗性中的作用》文中研究指明桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是热带和亚热带地区严重危害果蔬的重要经济害虫,对农业生产带来不可估计的损失。由于长期化学防治的压力,桔小实蝇对常用杀虫剂包括有机磷类杀虫剂已产生了不同程度的抗性。前期研究表明,细胞色素P450在昆虫对有机磷类杀虫剂代谢抗性中起重要作用,而且根据增效试验以及代谢酶活性测定,桔小实蝇细胞色素P450与有机磷类杀虫剂如马拉硫磷的代谢抗性密切相关。据此,为揭示桔小实蝇细胞色素P450介导代谢抗性的分子机理,本学位论文首先克隆获得了桔小实蝇P450基因cDNA全长序列,全面了解桔小实蝇P450基因的序列信息;定量分析了P450基因在桔小实蝇体内的表达分布特点和应对外源物的反应;克隆获得桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因,定量分析了BdCPR表达分布特点,并通过RNAi和真核表达等技术,探究桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因与马拉硫磷抗性的关系,进而初步判断P450酶系在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用;通过转录组RNA-Seq技术,分析比较了桔小实蝇成虫及其中肠和脂肪体在马拉硫磷抗性品系和敏感品系间表达量的差异,筛选鉴定出桔小实蝇中与马拉硫磷抗性相关的基因;最后,结合RNAi和真核表达等技术分析P450基因在马拉硫磷抗性中的作用。本研究为桔小实蝇的代谢抗性分子机理建立理论基础,主要研究结果如下:1桔小实蝇细胞色素P450基因的克隆与序列分析通过简并引物、转录组数据库和RACE技术,共克隆和鉴定出桔小实蝇38个具有完整开放阅读框的细胞色素450基因。这38个P450基因分布于4个集团14个家族27个亚家族中,其中CYP2、CYP3、CYP4和mitochondrial集团分别有2个、19个、11个和6个P450基因,第四家族和第六家族P450基因分别为11个和12个,第12家族为4个,其他11个家族均为1个。38个P450基因的开放阅读框长度介于1350-1665 bp,编码489-554个氨基酸。编码蛋白的分子量介于57-64kDa,理论等电点介于5.88-9.62。通过对序列的分析,预测38个P450中有32个属于微粒体P450,6个为线粒体P450。桔小实蝇38个P450基因均获得细胞色素P450命名委员会命名,分别为CYP4AC4、CYP4AD1、CYP4D46、CYP4D47、CYP4D48、CYP4E9、CYP4G100、CYP4G101、CYP4P5、CYP4P6、CYP4S18、CYP6A41、CYP6A48、CYP6A49、CYP6A50、CYP6A61、CYP6A62、CYP6D9、CYP6D12、CYP6EK1、CYP6G6、CYP6G8、CYP6GX1、CYP9F6、CYP12A18、CYP12B3、CYP12C2、CYP12N1、CYP28F1、CYP302A1、CYP304A1、CYP305A1、CYP309B1、CYP310C1、CYP314A1、CYP317B1、CYP437A3和CYP3074A1,并在Gen Bank中登录,登录号依次为ADC44464、KX708477、ADC44459、ADP22308、ADP22303、ADP22302、KX708478、KX708479、ADC44461、AFH54172、KX708480、ADP22304、KX708481、KX708482、KX708483、KX708484、KX708485、ADO24531、KX708486、ADP22309、KX708487、KX708488、KX708489、KX708490、KX708491、KX708492、AFH54190、AFH54188、AFH54196、AFH54200、KX708493、KX708494、KX708495、AFH54207、AFH54210、KX708496、KX708497和KX708498。多重序列比对显示11个CYP4家族成员的氨基酸序列一致性介于25%-67%,12个CYP6家族成员的氨基酸序列一致性介于26%-60%,相同亚家族成员的序列一致性较高,而不同家族的P450基因序列一致性普遍较低。这些P450基因均具有P450大家族的保守结构域Helix C、Helix I、Helix K、Meander和血红素结合区域等。桔小实蝇P450基因与实蝇类害虫橄榄实蝇、瓜实蝇和地中海实蝇的同源P450基因氨基酸序列的一致性分别介于79%-97%、74%-95%和70%-94%,序列相似性非常高,与果蝇同源P450基因的序列一致性介于35%-78%。系统发育分析显示38个P450基因和87个果蝇P450基因按集团聚集成4个不同的分支,其中CYP3和CYP4集团的两个分支基因最多,相同家族以及同源基因距离较近。2桔小实蝇细胞色素P450基因的表达模式解析运用q PCR技术,定量检测了桔小实蝇P450基因在不同地理种群、不同发育阶段、不同组织以及雌雄成虫及其中肠间的表达量差异。结果显示,在桔小实蝇云南、海南、东莞和广州等4个种群中,CYP6P5在东莞和广州种群的表达量高于在云南和海南种群的表达量,CYP6EK1则在广州种群的表达量最高,其余6个被检测的P450基因在4个种群的表达量无显着差异。在桔小实蝇卵、幼虫、蛹和成虫中,数字表达谱数据显示不同P450基因在数据库中可以对应1-4个片段,相同基因的不同片段对应的不同发育阶段的表达量非常相似,而且与定量检测结果一致(CYP4D47除外);8个检测的P450基因均在幼虫和成虫阶段的表达量较高,其次是蛹期,而在卵期的表达量则普遍最低;相同亚家族的P450基因CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在不同发育阶段的表达模式具有差异。在桔小实蝇成虫不同组织(中肠、脂肪体和马氏管)中,相同亚家族的CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在中肠的表达量最高,表达模式非常相近;CYP4AC4和CYP4E9在脂肪体的表达量最高,CYP4P5和CYP6EK1在马氏管的表达量最高,P450基因在组织间的表达差异可达到750倍,而CYP6A41在3种组织的表达量无显着差异。在桔小实蝇3日龄雌雄成虫中,检测的15个P450基因的表达量均无雌雄差异;而在桔小实蝇雌雄成虫中肠,CYP12N1在雌虫中肠的表达量是其在雄虫中肠表达量的0.28倍,显着低于在雄虫中肠的表达量,其他14个P450基因在雌雄中肠间无明显差异。此外,检测了桔小实蝇P450基因在外源物处理下的应激反应。使用高效氯氰菊酯LD50处理成虫24 h后,15个P450基因的表达量均无显着变化;而在成虫中肠,CYP4AC4、CYP4D46、CYP4P6和CYP302A1的表达量在高效氯氰菊酯处理后均下降,分别为对照组的0.33、0.37、0.61和0.53倍,其他11个P450基因的表达量在高效氯氰菊酯处理后无明显变化。使用含3 g/L和10 g/L植物次生物质柠檬醛的饲料饲喂桔小实蝇成虫,24 h后的死亡率分别为2%和30%;CYP4D46在3 g/L柠檬醛处理后表达量下降,CYP12N1、CYP302A1和CYP314A1在两种浓度柠檬醛处理后表达量均下调,而CYP28F1在3 g/L柠檬醛处理后表达量上升,CYP4D48和CYP6D9在10 g/L柠檬醛处理后表达量升高,但增加幅度均较小。3桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因的克隆与功能研究通过简并引物、转录组数据和RACE技术,扩增出桔小实蝇细胞色素P450还原酶BdCPR的两个转录本BdCRP-X1和BdCPR-X2,开放阅读框长度为2019 bp和1674 bp,分别编码672个和557个氨基酸。BdCPR-X1和BdCPR-X2编码蛋白的理论分子量为76 kDa和64 kDa,理论等电点为5.51和7.23。两个转录本的N端序列不同,而C端则一致。BdCPR-X1含有CPR完整的功能结构域FMN、FAD和NADPH,其N端具有膜锚定区域;而BdCPR-X2具有功能结构域FMN、FAD和NADPH,但FMN不完整,且不具有N端的膜锚定序列。桔小实蝇BdCPR-X1和BdCPR-X2的氨基酸序列与其他物种的CPR氨基酸序列具有较高的一致性。其中,与瓜实蝇和地中海实蝇CPR序列的一致性超过90%,与家蝇和果蝇的CPR序列的一致性也超过了80%,与哺乳动物如人的CPR序列的一致性达到了56%。系统发育分析得出BdCPR与另外两个实蝇科昆虫的CPR距离较近,其中与瓜实蝇CPR的距离最近,与地中海实蝇CPR的距离次之。BdCPR-X1是CPR在桔小实蝇存在的主要形式。BdCPR-X1在桔小实蝇羽化前相对表达量较低,蛹期最低,在成虫阶段随着日龄增加而逐渐升高;BdCPR-X2在不同发育阶段的表达量一直很低。BdCPR-X1在羽化后3日龄雌雄成虫间的表达量相似,而在9日龄雄虫的表达量显着高于雌虫的表达量,且均高于其在3日龄雌雄成虫的表达水平;而BdCPR-X2在3日龄和9日龄雌雄成虫的表达量均很低且无明显差异。BdCPR-X1在雌雄成虫头、胸和腹部的表达水平相近,在雄虫中肠、脂肪体和马氏管的表达量相对较高,在雌虫脂肪体和马氏管的表达量较高,而在雌雄生殖器官(卵巢、精巢和雄性附腺)的表达量较低;BdCPR-X2在桔小实蝇雌虫成虫不同体段和组织的表达分布与BdCPR-X1相似,但相对表达量较低。BdCPR-X1和BdCPR-X2在桔小实蝇马拉硫磷抗性品系和敏感品系的表达量无显着差异。利用RNAi技术,体外合成BdCPR的ds RNA并注射到羽化后3日龄成虫腹部,72 h后BdCPR在成虫的表达量下降了52%,且差异显着,而注射PBS和对照的BdCPR表达量相近;注射后72 h的成虫在马拉硫磷LD50浓度下处理24 h后,对照组的死亡率为45.0%,注射PBS则为50.5%,而注射ds RNA组的死亡率达到了89.9%,且显着高于其他两组,表明BdCPR表达量下降可以增强桔小实蝇对马拉硫磷的敏感性。利用Bac-to-bac真核表达系统在Sf9细胞中分别表达BdCPR和e GFP,Western杂交显示BdCPR和eGFP在细胞中表达,且表达有BdCPR的细胞具有很高的细胞色素c还原性,而表达有eGFP以及对照组细胞的细胞色素c还原性则很低,表明BdCPR的表达产物在Sf9细胞中具有较高的活性;使用马拉硫磷处理细胞并用MTT法检测细胞活性,发现表达有BdCPR细胞的活性普遍高于表达有eGFP的细胞,表明BdCPR可能有助于增强Sf9细胞对马拉硫磷的耐受能力。4桔小实蝇马拉硫磷抗性敏感品系转录组比较分析基于转录组数据库,构建了桔小实蝇马拉硫磷抗性和敏感品系成虫和成虫中肠的数字表达谱,以及新建了马拉硫磷抗性和敏感品系成虫脂肪体的转录组数据库。6个数据库的质量整体很好,每个样品的clean reads占raw reads的93%以上。分别比较了抗性和敏感品系成虫、抗性和敏感品系成虫中肠、抗性和敏感品系成虫脂肪体间基因的表达量差异。桔小实蝇马拉硫磷抗性品系成虫相比于敏感品系成虫(RWB/SWB),表达量上调的基因有141个,下调的基因有278个;马拉硫磷抗性品系成虫中肠与敏感品系成虫中肠(RMG/SMG)相比,表达量上调的基因有50个,下调的基因有988个;马拉硫磷抗性品系成虫脂肪体相比于敏感品系成虫脂肪体转录组(RFB/SFB),表达量上调的基因有349个,下调的基因有1,192个。差异表达基因的GO分析表明这些基因涉及不同的生物过程、分布于不同的细胞组分以及具有不同的分子功能。差异基因的通路分析表明这些基因分布于代谢通路等主要通路上。马拉硫磷抗性品系成虫上调基因中包括2个P450基因CYP6G6和CYP6A2-like,以及1个GST基因,分别上升至9.8、2.2和2.8倍;下调基因中包括4个P450基因和2个CarE基因。马拉硫磷抗性品系成虫中肠下调基因包括5个GST基因、2个CarE基因和15个P450基因。马拉硫磷抗性品系成虫脂肪体上调基因包括15个P450,上升至2.3-4.3倍(CYP6G6,4.3倍;CYP6A61,4.0倍;CYP4E1-like,3.8倍;CYP6G8,3.4倍;CYP437A3,3.3倍;CYP4D46和CYP309B1,3.0倍;CYP4AC4和CYP12B3,2.9倍;CYP6A13-like,2.8倍;CYP12A4-like,2.7倍;CYP4S18,2.6倍;CYP6D9和CYP12N1,2.4倍;CYP12A5-like,2.3),cytochrome b5,上升至2.1倍,以及两个GST基因,分别上升至2.7和2.8倍;下调基因中包括有6个P450基因。5 CYP6G6在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用CYP6G亚家族与昆虫抗性密切相关,桔小实蝇CYP6G6氨基酸序列分别与果蝇CYP6G1、CYP6G2和家蝇CYP6G4氨基酸序列具有47%、51%和48%的一致性,底物结合位点SRS1-SRS6在4个CYP6G基因间相似性较高,且具有保守的氨基酸。定量结果显示CYP6G6基因在桔小实蝇马拉硫磷抗性品系成虫的表达量是其在敏感品系成虫的5.2倍,且差异显着,这与桔小实蝇成虫表达谱数据和成虫脂肪体转录组数据一致。此外,CYP6G6在桔小实蝇成虫头部的表达量较胸部和腹部高,在腹部的脂肪体表达量较高,但无雌雄差异,而其在生殖器官精巢和卵巢的表达量较低。CYP6G6在桔小实蝇成虫的表达量从羽化后3日龄开始随着日龄的增加而逐步提高。利用RNAi技术,注射CYP6G6基因的ds RNA至羽化后3日龄的成虫,在24h后对照组、注射PBS组和注射ds RNA组成虫的CYP6G6的表达量相对于内参分别为0.63、0.24和0.13,马拉硫磷处理后各组对应的死亡率分别为28.4%、33.2%和39.6%,死亡率略有升高,但由于试验重复性不够稳定,各组间差异不显着。通过真核表达系统,CYP6G6在Sf9细胞中得到表达,但通过CO差光谱法检测只在420 nm处出现吸收峰,在450
舒耀皋[3]2008年在《几种农药对鲫鱼肝脏微粒体P450酶系的影响》文中认为细胞色素P450酶又称为微粒体混合功能氧化酶(MFO),是催化药物代谢的主要酶系,不仅能够催化一些具有重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸、萜类化合物等的生物合成代谢,而且参与许多外源性物质包括除草剂、杀虫剂、杀菌剂、药物、环境污染物及其它有毒物质的生物氧化。现今,对它的研究主要集中在大、小鼠及医药领域,有关环境指示生物的报道很少,目前还未见农药对鲫鱼P450酶系影响的研究报道。本文对鲫鱼肝脏微粒体P450进行了初步研究,以为在环境毒理学领域进一步研究应用提供理论基础。取健康鲫鱼30尾,分叁组每组10尾,用差速离心法、钙沉淀法及聚乙二醇法分别提取各组鲫鱼肝脏微粒体,并测定微粒体蛋白活性及微粒体中P450活性,采用(日立7020)全自动生化分析仪测定微粒体蛋白活性,紫外分光光度法测定CYP450酶系活性.结果表明本实验所建立的叁种提取鲫鱼肝微粒体的方法及各方法提取的微粒体中细胞色素P450活性的检测方法灵敏可靠,重复性好,可用于CYP450的系统研究。氟吗啉、氧乐果、阿特拉津及多虑联苯对鲫鱼腹腔注射进行急性毒性试验。结果表明各药对鲫鱼的半数致死量分别为:氟吗啉LD50为104.6mg/kg,氧乐果LD50为246.9mg/kg,阿特拉津LD50为217.9mg/kg,多氯联苯LD50为247.2mg/kg。以多氯联苯为受试药物,采用腹腔注射法给鲫鱼连续染毒五天,分别以差速离心法、钙沉淀法和聚乙二醇法提取鲫鱼肝脏微粒体,测定并比较叁种方法提取微粒体的P450酶系活性,结果显示叁种方法提取的微粒体测定的P450及NCCR酶活性有明显的差别,且差速离心法提取的微粒体测得的P450酶活性最好,存在明显的量效关系。因此,针对P450测定结果比较叁种方法优劣顺序为:差速离心法>聚乙二醇法>钙沉淀法。在鲫鱼肝微粒体水平上研究了氟吗啉、氧乐果及阿特拉津等几种药物对鲫鱼肝脏微粒体P450酶系的影响,试验设六个剂量组。氟吗啉按10mg/kg体重、氧乐果、阿特拉津及多氯联苯都按20mg/kg体重剂量腹腔注射染毒,1次/d×5;各组末次染毒24小时后杀鱼取肝作进一步试验,结果表明,多氯联苯对P450酶及NCCR酶活性都有明显诱导作用,阿特拉津也对鲫鱼P450酶表现显着诱导作用,氟吗啉和氧乐果对P450酶系没有显着影响。
吴业辉[4]2007年在《海洋石油降解菌的分离鉴定及其降解酶基因的研究》文中研究说明当前,海洋的污染正在日趋加剧,其中海洋的石油污染尤为严重。世界日原油产量大约108barrels,其中50%经由海洋运输。即使是偶尔发生的溢油事件,也会对海洋环境和海岸生态系统造成了恶劣和长期的影响。目前普遍认为生物修复是清除海洋石油污染的有效手段。从海洋石油污染较严重的环境中进行石油烃降解微生物的分离、培养,以及对这些重要降解菌的鉴定是当前海洋环境微生物学研究的重点和热点。烷烃羟化酶是微生物降解烷烃过程中的第一步酶,也是整个降解途径中的关键酶。它们能够使极性、难溶的烷烃转变为溶解性高的醇类物质,这不仅有利于微生物本身对烷烃的降解,也有利于参与降解的其它微生物的利用。此外,烷烃羟化酶可以用作生物催化机来生产一些精细化工产品,。因此,对烷烃降解菌和烷烃羟化酶的研究具有较高的理论和应用价值。本文以柴油为唯一碳源,从马六岬海峡10个不同站点的表层海水样品中富集到了十个柴油降解菌群,并对各菌群的结构进行了分析。从10个菌群中共分离到48株细菌,分属于17个不同的属。其中许多菌株都有较强的柴油降解能力。降解菌群中可培养菌的系统发育分析表明,它们分别属于变形菌类群、放线菌类群、黄杆菌类群,多样性丰富。其中变形纲类群γ亚群(59%)、α亚群(33%)较为丰富。PCR-DGGE分析表明,食烷菌、假单胞菌、海旋菌、海杆菌、新鞘氨醇单胞菌、不动杆菌、红球菌、Parvibaculum、苍白杆菌属的细菌是优势菌。其中大多数菌已报道可以降解原油或柴油。从马六岬海峡红灯码头站点分离到的A-11-3对柴油具有很强的降解能力及很广的烷烃降解范围(C8～C36)。其16S rRNA与已报道的博克岛食烷菌SK2(Alcanivorax. borkumensis SK2T)有最高同源性为96.5%。通过生理生化特性分析、脂肪酸组成分析、G+Cmol%含量分析、ITS序列以及促旋酶gyrB序列等分析,表明菌株A-11-3是属于食烷菌属的一个新种,命名为马六岬食烷菌(Alcanivorax Malaccasis)。从该菌株中获得了一个新的烷烃羟化酶AlkB(Burkholderia xenovorans LB400,69%)和一个属于细胞色素CYP153家族的P450烷烃羟化酶的部分序列。从本实验室分离并鉴定的柴油食烷菌模式种B-5(A.dieselolei)获得了一个新的烷烃羟化酶AlkB,以前的实验证明,该基因编码一个有功能的烷烃羟化酶。本实验在B-5中对alkB基因进行了敲除,发现基因敲除后的突变株对烷烃的降解范围和降解能力与原始菌株相比,几乎没有差别,这说明了在B-5中还存在其它的烷烃羟化酶系统。用兼并引物和Tail-PCR扩增的方法获得了367个氨基酸的细胞色素P450酶,其与博克岛食烷菌SK2中CYP153 P450烷烃羟化酶有最高相似性,为84.9%。系统发育分析表明,B-5中得到的P450酶属于细胞色素CYP153家族。还获得了位于其下游且紧邻P450烷烃羟化酶的541aa的醇脱氢酶全长。在B-5及在突变株B-5△alkB中分别进行CYP 153 P450基因敲除的单双突变株已经构建好,突变株的烷烃降解能力实验正在进行中。此外B-5中已获得的两个烷烃羟化酶AlkB及P450在不同烷烃的诱导下的表达情况的研究正在进行之中。
杨芳[5]2008年在《人和鼠肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步应用研究》文中研究表明肝脏是人体重要的生物转化场所,肝细胞的光面内质网(sER)上镶嵌着丰富的代谢酶,负责内源及外源化合物的代谢。这其中包括主要的Ⅰ相药物代谢酶:细胞色素P450(CYP)及黄素单氧化酶(FMO)。破碎肝细胞后,制备人肝脏微粒体(HLM),其上保留着这些酶。因此HLM可以用来进行体外的药物代谢研究,包括ⅰ).CYP反应表型研究;ⅱ).基于CYP的药物相互作用研究,以及代谢稳定性的研究。药物代谢的体外和体内研究数据有一定的相关性,体外研究有助于解释临床数据,可用于评价药物在人体内潜在的代谢情况。采用体外研究早期发现人体内药物代谢的途径和产物,可以为临床前研究提供明确的方向。本研究的目的是建立体外药物代谢研究用的人和鼠肝微粒体药物代谢模型,并对其应用进行初探。首先用改良后的Omura法,制备SD大鼠和混合人肝微粒体。制备好的人、鼠肝微粒体经一氧化碳还原示差法对P450酶含量进行测定。之后用荧光检测技术检测肝微粒体对荧光底物CEC、DBF、AMMC和EFC的代谢情况,初步判断肝微粒是否具有P450酶催化活性。定量结果显示制备的人、鼠肝微粒体在450nm有明显的吸收峰,测得P450酶含量分别为593±27pmol/mg和964.67±32pmol/mg。通过与四种荧光底物进行多次酶活性检测。除了EFC底物无明显催化活性,人肝微粒体对AMMC的催化活性较弱外,人肝和鼠肝微粒体均可以与CEC、DBF底物作用,呈现出明显而稳定的催化活性,在一定范围内荧光信号随着酶浓度增大而增大,随着时间的延长而增强。其次用高效液相色谱技术进一步评价肝微粒体药物代谢检测平台的可靠性,将肝微粒体与特异性探针底物bufuralol、coumarin、s-mephenytoin和nifedipine反应,分析生成的产物,计算K_m、V_(max)值,根据CL_(int)=V_(max)/K_m计算内在清除率。同时用2D6、2A6、2C19和3A4特异性抑制剂奎宁丁、反苯环丙胺及酮康唑对人、鼠肝微粒体进行抑制实验,察看抑制效应强弱,求解IC_(50)值。结果显示:鼠肝微粒体对探针底物bufuralol和nifedipine有显着的催化活性,而对coumarin和s-mephenytoin无代谢;人肝微粒体则对四种特异性探针底物均有明显而稳定的催化活性,所求得的K_m、V_(max)和CL_(int)值也与文献报道的相符。特异性抑制剂对鼠肝微粒体均无抑制效应,而对人肝微粒体则显示出了较强的抑制效应,IC_(50)值较小。通过多方面的比较,证明了本研究建立的人、鼠肝微粒体体外药物代谢平台的可行性和可靠性。荧光检测和高效液相色谱检测结果表现出一致性。活性测定结果和抑制作用检测结果表明了人、鼠肝微粒体可用于CYP450酶及其相关药物代谢研究的体外模型,使实验结果相互验证。在人肝微粒体与重组人细胞色素P450酶比较中,证明了采用酶反应活性测定及其选择性抑制作用测定的结合模式具有科学性。总之本研究成功建立了人、鼠肝微粒体药物代谢检测平台,并对其应用进行了初探。
陈舒丽[6]2006年在《重组细胞色素P450nor在大肠杆菌和酵母中的克隆表达与分离纯化》文中研究表明细胞色素P450是一类能与CO结合，形成的复合物在450nm附近具有最大吸收峰的血红蛋白的总称。它含有非共价结合的血红素铁，并在细胞内通过可逆性的变化而进行电子传递。当血红素铁接受电子被还原后再与CO结合，将产生细胞色素P450的特征光谱。细胞色素P450种类繁多，功能多样，是一个庞大的超基因家族。它的化学本质是蛋白质，分子质量在43-60kD之间。细胞色素P450具有单加氧酶的作用，并能参与机体解毒、甾体激素的合成、脂肪酸代谢等重要的生理反应，并广泛分布于动物、植物和微生物中。细胞色素P450nor是一类独特的细胞色素P450，它在真菌反硝化中扮演着重要角色。P450nor起着NO还原酶的作用，能以NAD(P)H为直接电子供体将NO还原成N_2O。虽然它属于P450超家族，但没有单加氧酶活性。迄今为止，已从真菌和酵母中克隆了多种细胞色素P450nor基因，表明其存在普遍性。本研究改造了原有的未能高效表达的重组表达载体pRSET-p450nor，通过PCR方法，去除了P450nor起始密码子ATG上游的59个碱基序列，将真菌细胞色素P450nor基因首先克隆至克隆载体pBlue上，得到重组载体pBlue—p450nor。然后亚克隆到高效表达载体pET-28和穿梭表达载体pAUR123上，得到了重组表达载体pET-p450nor和重组穿梭表达载体pAUR123-p450nor。将重组表达载体pET-p450nor转化大肠杆菌BL21菌株，该基因在30℃、0.1mM IPTG诱导下获得高效表达融合蛋白His-P450nor。SDS-PAGE蛋白电泳表明在45kD处出现强特异性带。将大量表达的重组蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化，得到了单一的目的条带。将重组穿梭表达载体pAUR123-p450nor首先转化大肠杆菌BL21，经筛选鉴定后转化酿酒酵母AH22。在YEPE培养基上培养带有P450nor基因的酿酒酵母，30℃，培养36h使目的蛋白表达，SDS-PAGE电泳表明在45kD处出现表达条带。本研究还探讨了温度、IPTG浓度对重组蛋白在原核表达中的影响。结果表明：在20℃以下，不易形成包涵体，但蛋白表达量较小；在1mM的IPTG浓度和0.1mM的IPTG浓度的诱导下，蛋白表达量并无明显差异。培养基成分的不同对目的蛋白在真核中的表达也有影响，蛋白的表达量在YEPE培养基比在YEPD培养基中大。
叶旋[7]2008年在《基于药物代谢酶的藜芦与人参配伍禁忌研究》文中研究说明传统中医药理论认为藜芦与人参存在配伍禁忌,剧毒中药藜芦与人参合用毒性加大。细胞色素P450是药物相互作用的基础,作为最重要的I相药物代谢酶系统,参与一系列亲脂性化合物的代谢,包括药物、致癌物及环境污染物的代谢转化,阻止这些化合物在体内蓄积,起到解毒和保护肝脏的作用,并通过参与内源性物质的代谢,发挥独特的内源性生理作用。本研究从细胞色素P450所发挥的外源性和内源性作用两方面探讨藜芦与人参配伍禁忌的机制。本研究在整体动物水平和分子水平研究人参对细胞色素P450酶的影响及与藜芦合用后相关P450亚型的酶活性变化。选择人参主要的皂苷单体Rb1,Rg1进行了人参对细胞色素P450调控机制的初步探索。利用HepG2细胞考察了7种主要的P450酶亚型(CYP1A1,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1, CYP3A4)在人参皂苷Rb1,Rg1作用后的变化。RT-PCR结果发现,CYP1A1在mRNA水平发生上调,CYP3A4在mRNA水平发生下调,其改变都呈时间依赖性和剂量依赖性趋势,其它亚型的变化不明显。在整体水平,本研究通过检测特异性底物的代谢等生物化学方法考察人参与藜芦作用后相关细胞色素P450亚型的活性变化。研究结果显示,细胞色素P450酶的总含量呈下降趋势,CYP1A活性呈上升趋势,CYP3A活性呈剂量依赖性下降趋势,细胞色素b5的改变不明显。为了研究藜芦药理毒理过程中的P450酶的外源性代谢作用,首先考察了藜芦属植物代表性的毒性成分藜芦定碱(veratridine)在大鼠肝微粒体中的代谢特征,同时观察了5种特定P450亚型选择性抑制剂对veratridine体外代谢的影响。通过高效液相分析veratridine的体外代谢情况,并通过液质联用分析推测veratridine体外代谢产物的结构。化学抑制实验结果显示,4种P450亚型(CYP1A, CYP2B, CYP2E1, CYP3A)参与了veratridine的体外代谢。相关P450亚型的表达和功能变化将造成veratridine对机体毒性作用的改变。在与大鼠微粒体孵育后,发现了七种veratridine的代谢产物。通过对veratridine代谢途径的分析,veratridine代谢产物中存在活性中间体邻二苯酚和邻醌类物质的可能。活性代谢中间体通过与DNA、RNA以及关键蛋白等生物大分子发生共价结合造成细胞损伤,邻二苯酚和邻醌类物质被认为具有神经毒性。为了研究CYP1A1上调在内源性作用方面对veratridine药理毒理作用的影响,构建了CYP1A1的表达载体,转染血管内皮细胞HVEC304,观测veratridine在过表达CYP1A1时对细胞内钙离子水平的影响。实验发现,在过表达CYP1A1的HVEC304细胞中,钙离子的基础水平发生明显下降,veratridine可以逆转这一趋势,并呈剂量依赖性。同时发现,在转染CYP1A1的HVEC304细胞中,veratridine对钙离子的刺激作用明显强于未转染组。过表达CYP1A1使得花生四烯酸的P450代谢途径加强,羟化的花生四烯酸代谢产物生成增加,破坏了花生四烯酸环氧化产物和羟化产物的平衡,从而对离子通道的功能产生影响。veratridne本身即可以影响细胞内钙离子水平,CYP1A1通过影响花生四烯酸的代谢与veratridine联合作用,造成了细胞内钙离子的失衡。综上所述,人参单用及与藜芦合用降低了大鼠肝微粒体中的细胞色素P450酶总含量,增加了CYP1A的活性,抑制了CYP3A的活性。人参皂苷Rb1、Rg1诱导了CYP1A1的表达,抑制了CYP3A4的表达。由于细胞色素P450酶的表达和活性改变,影响到藜芦的代谢清除,藜芦中重要的毒性成分veratridine可能因细胞色素P450总含量和CYP3A活性下降发生蓄积,也可能因CYP1A活性上升,导致I相代谢活性中间体生成增多。Veratridine的药理作用也受细胞色素P450酶的表达和活性改变的影响,CYP1A1的上调使得其对细胞内钙离子的刺激作用明显增强。我们认为P450酶的表达和活性改变,影响了藜芦的代谢清除和药理毒理作用,造成人参与藜芦间的药物相互作用,产生了配伍禁忌。本研究部分揭示了中药配伍禁忌的科学内涵,并对安全合理用药有指导作用。
杨帆[8]2008年在《赤拟谷盗细胞色素P450 CYP345D3 cDNA基因克隆与序列分析》文中研究指明细胞色素P450单加氧酶系是广泛分布于生物有机体中的重要酶系,一直是生物学领域研究的一个重要对象。细胞色素P450在具有还原性辅酶Ⅱ和分子氧的情况下,能够与底物结合并进行电子传递。至今,已发现的昆虫P450的功能主要有两大类:一是催化内源性物质(如甾醇、脂肪酸及信息激素等)的生物合成和降解,维持生物体的正常功能;二是针对外源性物质(如杀虫剂、植物次生物质及诱变剂前体等)起到解毒与活化的作用。其中细胞色素P450对杀虫剂的代谢作用增强是大多数昆虫产生抗药性的主要机制。赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst)是在世界范围内广泛分布且具有重要经济意义的害虫,主要危害谷物及储藏物。其危害方式为直接取食、加速谷物霉变、粪便污染等。早在1972～1973年的全球调查中就发现其对多种药剂尤其是PH_3产生了严重的抗性。近年来,随着国际贸易的日趋频繁,赤拟谷盗的发生范围越来越广、危害越来越重,其抗性问题日益受到重视。此外,赤拟谷盗还是一种重要的模式昆虫,以模式昆虫为代表,解明其基因功能,有助于从害虫自身出发,研究害虫防治的新理论和新技术。本学位论文在国家自然科学基金的资助下,以赤拟谷盗为研究对象,对赤拟谷盗P450的基因进行克隆研究。从赤拟谷盗敏感品系中克隆获得一个新的细胞色素P450 cDNA全长序列,经国际细胞色素研究委员会命名为CYP345D3,GenBank的登陆号为EU008544。该核苷酸序列全长为1554bp,开放阅读框的范围是从第32个碱基到第1513个碱基,编码了493个氨基酸,分子量57466kD。推导的氨基酸序列中含有最为经典的血红素结合基序FXXGXXXCXG(残基:430-439)以及其它所有P450的特征基序。序列比对表明,该序列与赤拟谷盗的P450基因CYP345D1(Tribolium castaneum,XP_966774)序列相似性最高,达到91%,其次为赤拟谷盗的CYP345D2(Tribolium castaneum,XP_969536),达62%;东亚飞蝗CYP6H1(Locustamigratoria,AF115777)和黑腹果蝇CYP6G1(Drosophila melanogaster,NM_136899)为36%;家蝇CYP6A1(Musca domestica,M25367)和尖音库蚊CYP6F1(Culex pipiens pallens,AY662654)为34%;尖音库蚊CYP6E1(Culex pipiens quinquefasciatus,AB001323)、家蝇CYP6C1(Muscadomestica,U09233)、CYP6D1(U15168)和黑尾凤蝶CYP6B1(Papilio polyxenes,Z29624)为33%。而与赤拟谷盗CYP346A1(Tribolium castaneum,XP_967901)同源性为32%;褐家鼠CYP3A1(Rattus norvegicus,NM_173144)为31%;褐家鼠CYP4A1(Rattus norvegicus,M57718)为25%;家鼠CYP1A1(Mus musculus,NM_009992)和赤拟谷盗CYP315A1(Triboliumcastaneum,XP_970122)为24%。系统发育分析结果表明其他昆虫的CYP6家族的P450基因与CYP345D3的亲缘关系比哺乳动物其它家族的P450基因更近,这也证实了序列比对的结果。以已知的人类肝脏的P450基因CYP3A4的蛋白晶体结构为模板,对得到的赤拟谷盗P450基因进行同源建模,得到了赤拟谷盗P450的模拟叁维结构模型,并比对人类肝脏的活性中心,找到了赤拟谷盗P450的酶解活性中心半胱氨酸Cys437。本研究试图克隆其他赤拟谷盗细胞色素P450家族的基因全序列:利用cDNA末端快速扩增(3'RACE)技术,以简并引物扩增出的243bp序列信息为基础,设计上游特异性引物GSP和下游通用引物AP进行半套式扩增,获得2个3'RACE序列。然后以同样方法扩增5'RACE序列未获得成功。进而分析了5'RACE失败的原因,并提出相应的改进措施:(1)保证RNA的完整性;(2)在内部再设计一条特异性引物进行巢式PCR;(3)提高二次扩增的退火温度。优化扩增条件等。对赤拟谷盗P450 cDNA基因进行克隆和序列分析,为研究P450在赤拟谷盗抗药性形成及发展中的作用如过量表达、氨基酸替换等奠定了基础,充实了生物进化及遗传变异的研究内容。同时针对发生改变的分子结构设计特定的靶标杀虫剂,为农药研究和害虫综合防治提供一定的理论依据。
田宝莲[9]2008年在《异丙甲草胺及其S-对映体对植物细胞色素P450酶和土壤酶影响的差异研究》文中指出本文研究了rac-异丙甲草胺及其S-对映体对玉米和水稻细胞色素P450酶的影响;rac-异丙甲草胺及S-异丙甲草胺与Cd复合污染对土壤过氧化氢酶和脱氢酶活性的影响,以期为异丙甲草胺的合理使用和生态安全性评估提供一些依据。玉米和水稻微粒体酶,经连二亚硫酸钠还原,与CO结合后在450nm处出现特征吸收峰。用NA、解草啶、异丙甲草胺及其S-对映体处理后玉米和水稻幼苗微粒体中P450和细胞色素b5的含量提高,微粒体P450酶λmax发生一定的偏移是P450酶的诱导特异性的表现,特定的外源诱导物质只能诱导一种或几种P450的同工酶。S-异丙甲草胺对玉米和水稻细胞色素P450酶的紫外吸收的影响大于rac-异丙甲草胺,表明S-异丙甲草胺与P450酶的结合大于rac-异丙甲草胺。土壤酶活性测定结果表明,rac-异丙甲草胺和S-异丙甲草胺单一处理对过氧化氢酶活性表现为先激活后抑制,对脱氢酶活性表现为激活-抑制-激活。Rac-异丙甲草胺和S-异丙甲草胺对过氧化氢酶活性的影响表现出一定的手性差异,而对脱氢酶活性影响的手性差异不显着。相同异丙甲草胺浓度下,Cd的浓度越大对供试土壤酶活性的影响越大,rac-异丙甲草胺和S-异丙甲草胺与Cd的复合污染对土壤过氧化氢酶和脱氢酶活性的影响表现出一定的交互效应。
徐莉[10]2017年在《棉铃虫细胞色素P450CYP6B7基因过量表达及调控机制研究》文中提出棉铃虫已对多种杀虫剂产生不同程度的抗药性,对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性问题最为突出。细胞色素P450酶系(简称P450)介导的代谢能力增强是棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的重要原因。国内外大量文献表明,多个和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的P450基因在抗性种群棉铃虫中过量表达。基因的过量表达主要由转录水平调控。本论文以相对敏感种群和田间抗性种群棉铃虫为研究对象,探究了细胞色素P450 CYP6B7基因与其他抗性相关P450基因的表达水平,通过基因组步移技术克隆了 CYP6B7基因的5'非翻译区(5'UTR)序列,并鉴定了和2-十叁烷酮、氰戊菊酯诱导表达相关的顺式作用元件和响应区,并用转录组测序的方法从整体角度分析了棉铃虫对氰戊菊酯产生抗药性差异表达的代谢相关基因和转录因子,旨在探究棉铃虫CZP6B7基因过量表达的调控机制。主要研究结果如下:1、田间棉铃虫抗性水平及抗性相关P450基因表达水平测定从北京、河北、河南和山东等地田间采集多个棉铃虫种群,用点滴法测定其对常用杀虫剂的敏感性,与相对敏感种群相比,田间种群棉铃虫对氰戊菊酯具有较高水平抗性,抗性倍数在5.4-114.7倍之间,对高效氯氟氰菊酯、辛硫磷和灭多威抗药性水平较低,抗性倍数均小于10倍。增效试验表明PBO对氰戊菊酯增效倍数最高,增效倍数在91.5-4497.2倍之间,DEF和DEM的增效效果较弱。采用实时荧光定量PCR方法测定不同种群棉铃虫抗性相关P450基因相对表达水平,结果表明,田间抗性种群棉铃虫中CYP6B7、CYP332A1和CZP9A12存在高水平的过量表达。2、CYP6B7基因5'非翻译区序列的克隆和分析根据CZP6B7基因的编码区序列设计特异性引物,采用基因组步移技术克隆得到相对敏感种群HDS棉铃虫CYP6B7基因起始密码子(ATG)上游长度为1934bp的5'UTR序列,GenBank登录号为KY196470。在NCBI上比对结果显示,该序列与棉铃虫CYP6B2、CYP6B6、CYP6B7等P450基因的串联序列以及钠离子通道α亚基部分序列有很高的相似性。在线预测转录起始位点是一个腺嘌呤碱基,也预测到一些转录因子结合位点,包括蜕皮激素响应元件(EcRE)、芳香烃受体外源物质响应元件(XRE-AhR)、Oct-1、Dfd、ftz、Eve和ZEN等。在Beijing种群中克隆得到一段ATG前1395 bp的CYP6B7基因5'UTR序列。序列比对发现,HDS种群和Beijing种群棉铃虫CYP6B7基因5'UTR中存在较多碱基差异,其中HDS种群在732-791 bp之间有一处短片段缺失,Beijing种群在961-1013 bp之间有一处长片段缺失。3、2-十叁烷酮对CYP6B7基因的诱导和顺式作用元件的鉴定植物次生物质2-十叁烷酮对棉铃虫中肠CYP6B7基因的相对表达量有显着的诱导作用。将CYP6B7基因5'UTR的5个长度缺失片段与无启动子的pGL3-Basic载体分别连接,构建重组质粒 pGL3-(-1703/+232),pGL3-(-680/+232),pGL3-(-320/+232),pGL3-(-238/+232)和pGL3-(-72/+232),细胞转染和双荧光酶活性测定发现2-十叁烷酮对重组质粒pGL3-(-320/+232)有显着的诱导,诱导倍数为3.56倍,对重组质粒pGL3-(-238/+232)无诱导。在-320和-238 bp之间进一步构建5'UTR长度缺失的重组质粒pGL3-(-292/+232)和pGL3-(-256/+232),发现2-十叁烷酮对重组质粒pGL3-(-292/+232)有显着的诱导,诱导倍数为2.15倍,对重组质粒pGL3-(-256/+232)无诱导作用。将-292和-257 bp之间的序列分成M1、M2和M3,分别对其进行碱基突变,发现M1中的碱基突变对2-十叁烷酮的诱导效果无显着影响,M2和M3中的碱基突变显着降低了 2-十叁烷酮诱导后pGL3-(-320/+232)的荧光活性。确定介导2-十叁烷酮过量表达的顺式作用元件位于M3,即CYP6B7基因5'UTR的-280 到-257 bp 之间。4、氰戊菊酯对CYP6B7基因的诱导和响应区的鉴定以含有0.1 mg/g氰戊菊酯的人工饲料饲喂棉铃虫,处理48 h后发现对幼虫中肠CYP6B7基因表达量有显着的诱导作用。对已构建的五个重组质粒的诱导试验表明,氰戊菊酯对重组质粒pGL3-(-320/+232)有显着的诱导作用,诱导倍数为1.91倍。对重组质粒pGL3-(-320/+232)、pGL3-(-292/+232)、pGL3-(-256/+232)和 pGL3-(-238/+232)进行进一步的诱导,发现氰戊菊酯对重组质粒pGL3-(-292/+232)有显着的诱导作用,诱导倍数为1.75倍,对重组质粒pGL3-(-256/+232)无显着诱导作用,但重组质粒pGL3-(-292/+232)的基础相对荧光活性和诱导相对荧光活性均显着低于重组质粒pGL3-(-320/+232),说明CYP6B7基因5'UTR中介导氰戊菊酯诱导表达的响应区位于-320到-257 bp之间。与重组质粒pGL3-(-292/+232)的基础相对荧光活性相比,2-十叁烷酮、氰戊菊酯以及二者的联合诱导倍数分别为2.52、1.59和2.03倍。5、氰戊菊酯抗性和敏感种群棉铃虫转录组测序分析将Beijing种群在室内用氰戊菊酯多代汰选后得到BJR种群,其抗性倍数比HDS种群高至少1275倍。将这两个种群进行转录组测序分析,发现BJR种群中有6130个上调表达的unigene,选取33个和代谢相关的unigene进行实时荧光定量PCR验证,发现10个P450基因、1个酯酶基因、1个GST基因和5个UGT基因显着上调。对转录组测序得到的转录因子进行分析,发现BJR种群中有199个上调和158个下调的转录因子unigene,在上调的转录因子unigene中包括已被报道调节P450基因表达的转录因子Maf和Arh核转运蛋白,分别属于TF_bZIP和bHLH转录因子家族。
参考文献：
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[8]. 赤拟谷盗细胞色素P450 CYP345D3 cDNA基因克隆与序列分析[D]. 杨帆. 西南大学. 2008
[9]. 异丙甲草胺及其S-对映体对植物细胞色素P450酶和土壤酶影响的差异研究[D]. 田宝莲. 浙江大学. 2008
[10]. 棉铃虫细胞色素P450CYP6B7基因过量表达及调控机制研究[D]. 徐莉. 中国农业大学. 2017
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