温建新[1]2003年在《带有HIS标签的重组EIAV感染性分子克隆的构建》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。我国的EIAV弱毒疫苗是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，成功地控制了我国EIA的流行。该毒株是将EIAV L株（EIAV L）通过驴体传代，使其毒力明显增强，然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。由于我国马传贫弱毒疫苗存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题，目前尚未得到欧美等发达国家的认证，如要进入国际市场，急需建立一种EIAV强、弱毒快速鉴别诊断方法。目前我国使用的马传贫弱毒疫苗未进行克隆纯化，如果用带有分子标签的马传贫弱毒疫苗感染性克隆衍生的病毒作为疫苗代替现有疫苗，将有利于现地使用和推广。本研究应用已构建好的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆载体（pOK8266）为模板，通过SOE PCR方法在感染性分子克隆载体的S2基因独特区内引入突变点，形成含有酶切位点（NspV）的突变体（P1P4）。将突变体（P1P4）亚克隆至pBluescript SK（M13-）质粒，形成pB-P1P4中间载体；人工合成两条六个组氨酸的引物，作为标签，将其插入pB-P1P4中间载体的NspV位点，形成带标签的中间载体；用ApaI酶切pOK8266和中间载体，连接转化，构建带标签的重组感染性分子病毒克隆载体（EIAV-pOK8.2-HIS），经PCR、酶切和测序表明，六个组氨酸已插入pOK8266的S2基因内。分别转染驴皮肤细胞（FDD）和驴白细胞，将转染驴皮肤细胞收获物传至第六代，电镜下未观察到EIAV病毒；而将转染驴白细胞收获物传代至第六代时，电镜下观察到了典型的病毒粒子。提取前病毒DNA，PCR扩增P1P4片段，亚克隆至pMD18-T载体，测序证明前病毒DNA含有六个组氨酸，从而在体外获得了感染性克隆病毒株。本研究通过SOE法巧妙地对S2基因引入突变，插入HIS标签，成功地获得了标记感染性分子克隆，证明S2基因缺失突变株在体外巨嗜细胞上培养不影响其复制力，为野毒株和疫苗毒的鉴别诊断打下基础。但病毒的致病性、免疫原性和标签的表达情况尚需作动物实验做进一步的探索。
涂亚斌[2]2005年在《马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)属反转录病毒科慢病毒属,是马传染性贫血(EIA,简称马传贫)的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗,该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行,是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列(LTR)对病毒复制有重要的调控作用,影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白,由于其基因的高度变异性,受到病毒学研究的普遍关注,通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析,发现二者的LTR和env基因(尤其是gp90编码区)差异较大。 为了研究env基因gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用,我们以EIAV强毒辽宁株(L株)接种健康马,从不同时期发热期马血清中以RT-PCR扩增包含完整S2基因和gp90基因片段;同时以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段,将所得的强弱毒共30个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒(如HIV、SIV)研究过程中发现,糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现,gp90基因V3到V5区在强毒和弱毒之间差异显着,而在各自内部相对保守,变异较小。对27个S2基因进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,S2基因中也存在着3个非常一致的点突变,没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV-DLA env基因变异研究的基础上,我们将马传贫强、弱毒gp90全长及部分(V3-V5区)分别连接到逆转录病毒载体pBABE-puro,通过转染将马传贫强、弱毒env基因整合到包装细胞系PA317中,利用抗性筛选到稳定表达细胞系;然后将马传贫强、弱毒gp90全长及V3-V5区分别连接到高效真核表达载体pcDNA3.1(+),转染293T细胞系并经抗性筛选及亚克隆后获得高效稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-V5区基因的细胞系,为研究gp90及V3-V5区结构与功能打下了良好的基础。然而,我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为主的慢病毒研究表明LTR和env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,构建了一系列N-连接糖基化突变分子克隆,力图对N-连接糖基化在我国马传染性贫血病毒致弱过程中的作用进行阐述,通过转染驴白细胞并盲传10代后仍未获得N-连接糖基化突变病毒,我们推测可能的原因是由于N-连接糖基化的突变均位于env基因的V3-V5区,影响了在驴白细胞上的细胞嗜性。 为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,我们在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆和EIAV-L株前病毒DNA全基因组分子克隆的基础上,用EIAV-L株的LTR和gp90编码区分别替换EIAV-DLA株感染性分子克降的相应片段,
温建新, 童光志, 王金宝, 仇华吉, 涂亚斌[3]2005年在《EIAV标记感染性克隆分子的构建》文中研究说明应用已构建好的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆载体(pOK8266)为模板,通过SOE PCR方法在感染性分子克隆载体的S2基因独特区内引入突变点,形成含有酶切位点(NspV)的突变体(P1P4)。将突变体(P1P4)亚克隆至pB luescript SK(M13-)质粒,形成pB-P1P4中间载体;人工合成两条6个组氨酸的引物,作为标签,将其插入pB-P1P4中间载体的NspV位点,形成带标签的中间载体;用ApaI酶切pOK8266和中间载体,连接转化,构建带标签的重组感染性分子病毒克隆载体(EIAV-p8.2-H IS),经PCR、酶切和测序表明,6个组氨酸已插入pOK8266的S2基因内。分别转染驴皮肤细胞(FDD)和驴白细胞,将转染驴皮肤细胞收获物传至第六代,电镜下未观察到EIAV病毒;而将转染驴白细胞收获物传代至第6代时,电镜下观察到了典型的病毒粒子。提取前病毒DNA,PCR扩增P1P4片段,亚克隆至pMD18-T载体,测序证明前病毒DNA含有6个组氨酸,从而在体外获得了感染性克隆病毒株。本研究通过SOE法巧妙地对S2基因引入突变,插入H IS标签,成功地获得了标记感染性分子克隆,证明S2基因缺失突变株在体外巨嗜细胞上培养不影响其复制力,为野毒株和疫苗毒的鉴别诊断打下基础。
温建新, 仇华吉, 涂亚斌, 王柳, 彭金美[4]2005年在《带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建》文中指出马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题。本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266_HIS。将pOK8266_HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子。提取pOK8266_HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础。本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制。
高华[5]2009年在《马传贫病毒中国株S2基因原核表达及多克隆抗体制备》文中提出马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一,在基因组结构和抗原性上与人艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)十分相似,可以引起马属动物的一种重要传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染。EIAV是结构最简单的慢病毒,其基因组RNA包括叁个结构基因,依次为gag、pol和env,此外还有叁个辅助基因tat、rev和S2。Tat和rev基因存在于所有慢病毒,而S2基因目前仅存在于EIAV中。在EIAV感染马体内能够持续检测到S2蛋白抗体的存在,但其作用目前尚不完全清楚。对我国多株EIAV强毒株和疫苗株的S2基因核序列进行分析后发现,S2基因是强毒株和疫苗株之间差异最大的基因,核苷酸和氨基酸的差异率分别是4.1%和10.4%。同时国外已有报道,构建S2失活的致病性感染性分子克隆,其体外复制动力学指标没有受到影响。但该感染性克隆的体内感染实验发现,与亲本病毒相比,缺失S2基因显着降低了病毒的复制水平和致病性。以上结果提示EIAV的S2基因是影响病毒在体内复制和致病特性的重要因素。因此,对S2相关生物学特性进行深入研究,有助于进一步了解EIAV的致病机理和机体对该病毒的免疫应答机制。本研究旨在为S2反向遗传研究提供行之有效的检测手段,并为S2蛋白的功能研究打下基础。本研究以EIAV感染性分子克隆pLGFD3-8为模板扩增S2基因,将其克隆于pMD-18T载体,测序证明为EIAV S2基因阳性克隆(pMD-18T-EIAV-S2)。将S2基因克隆入pET-30a表达载体,构建出S2基因的重组表达质粒(pET-30a-EIAV-S2)。然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的约20kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体。表达产物经镍离子亲和树脂纯化后,得到了纯度较高的带有6×His标签的目的蛋白。用所获得的纯化产物经四次肌肉注射新西兰白兔,制备兔抗S2多克隆抗体。经对EIAV病毒颗粒的Wester blot检测表明,本研究制备的S2多克隆抗体可以与EIAV的S2蛋白发生良好的特异性结合。该抗体的制备对进一步研究EIAV的生物学特性,特别是S2基因的功能,提供了重要的研究手段。
尹岚岚[6]2008年在《伪型EIAV病毒的制备》文中认为马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus, EIAV)是一种非灵长类慢病毒,而且是基因组结构最简单的慢病毒,可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上并在感染细胞和子代细胞中表达病毒基因,可作为将外源基因引入细胞的载体。本研究的目的在于利用我国在马传染性贫血病毒(EIAV)研究上的成果,在EIAV感染性克隆(pLGFD3-8和pOK8266T)的基础上,构建EIAV包装盒表达载体,选择EIAV基因转移载体的最佳表达条件,完成有效的EIAV基因转移载体四质粒系统构建,获得具有感染性的复制缺陷型伪型EIAV病毒。本实验利用反向遗传操作技术,以EIAV感染性克隆质粒(pLGFD3-8和pOK8266T)为基础,将EIAV gag/pol基因片段和rev基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了EIAV包装盒表达载体,即囊膜缺失的EIAV gag/pol表达质粒pCDFGP和rev表达质粒pCDREV;优选了EIAV基因转移载体pcPPTWCAG作为EIAV基因转移载体四质粒系统中的基因转移载体,确定了载体系统质粒共转染所用方法为脂质体转染法;完成了EIAV基因转移载体四质粒系统的有效构建,即包括EIAV基因转移载体质粒、EIAV包装盒表达载体gag/pol表达质粒与rev表达质粒、以及VSV-G表达质粒的四质粒基因转移载体系统。通过对EIAV基因转移载体系统的四质粒共转染,获得了具有感染性的复制缺陷型伪型EIAV病毒。该伪型病毒能够有效转导HEK293细胞系和NIH 3T3细胞系,完成转基因过程,表达报告基因。但获得的伪型病毒滴度较低,转导效率不高。本研究成果将为中国EIAV基因转移载体四质粒系统的构建提供理论基础和技术支持,为获得高滴度的EIAV伪型病毒奠定基础,也将为人类的基因治疗、转基因动物的制备及结合RNAi技术研究基因功能提供一个新的方法,同时也为理解慢病毒自身及其致病机制和基因表达调控的理论提供依据,为基因治疗、疫苗开发等提供一个新的研究手段。
张淑琴[7]2008年在《马传染性贫血病毒受体选择剪接变异体的鉴定及功能性研究》文中研究说明病毒特异性的细胞受体是病毒入侵细胞的门户,决定病毒的宿主范围、组织及细胞嗜性。从受体角度阐明病毒入侵机制,是病毒性疾病的药物研发及疫苗研制的重要方面。选择性剪接可使同一基因编码出功能不同蛋白,选择性剪接对满足生物体复杂性所需蛋白多样性具有重要意义。鉴定不同选择性剪接变异体的功能已成为生物学界研究的热点。马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)受体(ELR1)是2005年Zhang等通过克隆表达技术发现的,其属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)蛋白家族,本研究在原代培养的马的单核巨噬细胞上克隆ELR1的过程中,发现其mRNA基因序列存在选择性剪接形式,即其cDNA序列除所报导的序列ELR1外,还存在插入序列ELR1-IN和缺失序列ELR1-DE,ELR1-IN在已公布的序列的786-787位之间插入153bp,ELR1-DE型序列缺失了所公布序列415-478位64bp。不论序列的插入还是缺失均导致编码框的移位,而产生截短的受体多肽片段。为定量各种形式受体在体内的表达比率,本研究建立了可以特异性检测各种形式受体表达比率的SYBR Green real-time RT-PCR方法。该方法通过在不同的位置设计引物来分别定量叁种形式剪接体(ELR1+ELR1-IN+ELR1-DE)、两种形式剪接体(ELR1+ELR1-IN)及插入型剪接体(ELR1-IN)的拷贝数,通过运算就可以定量出每种剪接体的拷贝数并确定它们之间的表达比率。同时为减少实验误差,本研究仅采用插入型序列质粒来构建标准品,每对引物均应用这个标准品来定量各自所扩增基因的拷贝数,这样就减少了标准品之间差异所造成的误差。并通过比较了叁对不同引物扩增同一标准品的符合程度确定这种方法可行。应用这种方法定量出每种形式受体的表达比率为ELR1-IN:ELR1-DE:ELR1=3:1.7:1。为确定各种形式选择性剪接变异体的蛋白表达形式,本研究将每种剪接变异体序列均连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建成真核表达质粒,转染入293细胞和Hela细胞,通过间接免疫荧光和Western-blot证明各种形式受体均可表达,膜结合型受体ELR1表达蛋白49ku,且均表达在细胞膜上,插入型受体ELR1-IN表达蛋白大小在38ku左右,以可溶性形式表达,缺失型序列ELR1-DE可以以第二个编码区编码蛋白,表达蛋白大小在36ku左右,表达在细胞膜上。为研究可溶性受体的功能,本研究分别构建了稳定表达膜结合型受体和稳定表达插入型受体的293细胞系,分别命名为293-ELR1和293-ELR1-IN,通过real-time RT-PCR和RT酶活性检测,结果表明293-ELR1细胞系可以支持EIAV的驴胎皮肤细胞弱毒FDDV毒株的进入及复制,而对于293-ELR1-IN细胞系,推测仅可以支持病毒的进入,并不能支持病毒的复制。将插入型序列的真核表达质粒转染293-ELR1细胞并以真核表达载体pcDNA3.1(+)及未转染的空白293-ELR1细胞为阴性对照,转染后接种FDDV毒株并应用RT酶活性检测病毒活性,结果表明转染插入型序列质粒的受体组病毒活性明显低于转染真核表达载体pcDNA3.1(+)及未转染的空白293-ELR1细胞中病毒的活性,说明插入型序列表达的可溶性受体可以明显抑制FDDV毒株的感染表达膜结合型病毒受体的细胞系。为进一步研究病毒与受体相互作用的机制,针对病毒受体的特异性抗体是后期实验所必需的,故本实验又构建了ELR1基因的完整编码区及胞内区的原核表达体系,并实现了其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备ELR1蛋白多克隆抗体及从受体角度阐明EIAV减毒活疫苗的免疫保护机制奠定了基础。
马建[8]2012年在《EIAV中国弱毒疫苗株的抗原多态性及超感染抵制现象在其诱导保护性免疫中的作用研究》文中研究说明马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)是感染马属动物的慢病毒。EIAV中国弱毒疫苗株,是可诱导针对同源或异质EIAV毒株的良好免疫保护并唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗。以该弱毒疫苗系统作为慢病毒疫苗的研究模型,明确其致弱和诱导免疫保护的机制,将对慢病毒免疫机制研究和有效疫苗研制提供有益参考,具有重要的理论意义和应用价值。本文选择马传染性贫血中国驴胎皮肤细胞适应性弱毒疫苗株EIAVFDDV13作为研究对象,对其生物学特性在已有研究基础上做进一步深入探讨。关注的重点放在对该弱毒疫苗的病毒种群构成与诱导保护性免疫、弱毒疫苗诱导的超感染抵制现象(Super-infection resistance, SIR)与固有免疫激活和特异性免疫应答建立之间是否具有相关性等问题的回答。首先,我们比较了弱毒疫苗株EIAVFDDV13和一株拯救于EIAVFDDV13前病毒DNA的分子克隆毒株EIAVFDDV3-8在诱导免疫保护上的差异。基于攻毒试验和对攻毒后无症状马匹进行免疫抑制的试验结果,我们发现EIAVFDDV13免疫马匹诱导出了5/6的发病保护和3/6的完全保护,而EIAVFDDV3-8仅诱导出了2/7的发病保护和未能实现完全保护。同时,前者免疫马匹的血清对致病毒株的中和能力要明显优于后者。上述研究表明,疫苗感染性克隆毒株显然丢掉了亲本疫苗弱毒株诱导免疫保护的能力。此外,比较二者对体外培养巨噬细胞(Monocyte derived macrophage, MDM)的固有免疫激活特征时,发现二者在固有免疫相关分子Toll样受体和I型干扰素(IFNα/β)的诱导上存在差异,而已有研究证明这些差异与特异性免疫应答的建立具有联系。这提示病毒株可能通过对感染早期固有免疫的激活影响最终建立的特异性免疫应答,而疫苗弱毒株和疫苗感染性克隆毒株通过何种机制诱导差异的固有免疫激活,以及进一步影响后续的特异性免疫应答,则需要进一步的研究予以阐明。而在病毒株方面,考虑到两毒株在体内、外复制特性上不存在显着差异,我们进一步对二者的gp90基因进行了分析,以探讨感染性克隆毒诱导免疫保护能力丢失的原因。分析结果提示,EIAVFDDV13抗原构成呈高度多样性特征,而EIAVFDDV3-8则构成相对单一且其基因背景源于亲本疫苗多样性的组成成分。由此,我们推测上述差异,是EIAVFDDV3-8未能复制亲本疫苗诱导免疫保护能力的原因。拯救带有疫苗多样性组分囊膜基因的多个感染性克隆毒株,并进行免疫诱导差异比较,是用于验证上述推测所需开展的进一步试验研究。而该差异是否与固有免疫激活存在相关性,亦需要做进一步探讨。其次,本研究中我们开展了有关EIAV中国弱毒疫苗诱导超SIR的相关研究。SIR是指一种病毒感染宿主细胞后,可以诱导细胞产生抵抗相同和近似病毒超感染的能力。包括HFV、EIAV在内的慢病毒可诱导SIR。本研究中,我们使用EIAVFDDV13和有致病力的EIAV感染性克隆毒株EIAVUK3作为慢病毒强、弱毒株的模式毒株,就二者在诱导SIR能力上是否存在差异进行了比较研究。基于可特异性区分强、弱毒株的病毒定量PCR (qPCR)和病毒RNA原位杂交技术(ViewRNA)证实,EIAVFDDY13体外感染宿主细胞MDM后诱导的针对EIAVUK3株的SIR,要强于EIAVUK3诱导的针对EIAVFDDY13的干扰作用。基于分支链DNA检测技术(Branch DNA)进一步证实,EIAVFDDY13感染MDM后,相对于EIAVUK3感染组,其上调了细胞内可溶性病毒受体ELR-IN、TLR3、INFβ和Tetherin等分子的表达。这些分子可对EIAV在MDM内的感染和复制过程通过不同机制产生抑制作用。通过适量Poly I:C激活MDM内的TLR3,可在MDM细胞中模拟出近似于EIAVFDDY13感染MDM后细胞内上述分子的表达水平,且该状态细胞获得了抵抗EIAV感染的能力。据此,推测TLR3通路的激活,在EIAVFDDY13诱导更强的SIR中发挥重要作用。此外,考虑到Toll样受体、I型干扰素等在激活固有免疫和调节特异性免疫应答中发挥的重要作用,EIAV强、弱毒株间诱导的SIR差异与二者激活固有免疫应答时的差异,并借由该差异进一步影响到特应性免应答的建立,尤其是疫苗诱导的保护性免疫应答建立的相关性和作用机制,是需要进一步关注和阐明的问题。本论文获得的上述研究结果,将促进我们对EIAV中国弱毒疫苗株生物学特性的更多了解。同时,基于对该疫苗株诱导保护性免疫机制的探讨,也将为如何设计可诱导保护性免疫的慢病毒疫苗提供参考。尽管把弱毒疫苗作为慢病毒疫苗的设计策略应用于HIV疫苗的研究,还存在争议。但在全世界投入了巨大的人力、物力,耗费了近30年的时间用于HIV相关研究,而取得的结果却只是在攻克疫苗诱导免疫保护难关上举步维艰时,对作为AIDS动物模型的EIA的研究,特别是成功的诱导了免疫保护的中国EIAV弱毒疫苗的作用机制研究,这种“从成功中学习”的策略,无疑具有其不可替代的价值。
王明杰[9]2006年在《猪瘟兔化弱毒疫苗株cDNA分子克隆与嵌合分子克隆的构建》文中提出猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性和致死性传染病，以发热和出血为主要特征，世界动物卫生组织将其列为A类16种法定传染病之一。猪瘟的流行给世界养猪业的发展和贸易造成了巨大损失。猪瘟兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized virus，HCLV)是我国自主研制成功的有效疫苗，在猪瘟的防制中发挥了巨大作用，但由于疫苗接种猪与自然感染猪不易从血清学上予以区分，不利于猪瘟的净化和消灭，研制标记疫苗有助于解决这个问题。 本研究旨在构建HCLV基因组全长cDNA克隆，以建立猪瘟病毒反向遗传操作平台。参照已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了覆盖全基因组的9对引物，经过RT-PCR、克隆、测序、拼接，获得了HCLV全基因组序列(GenBank登录号AY805221)。通过与另外7个国内外发表的HCLV基因组全序列比较分析发现，HCLV基因组在遗传学上是相当稳定的。将9个片段分成两个部分(F1、F2、F3、F4、F5和F6、F7、F8、F9)，运用多片段一步连接法，分别克隆到载体pOK12后，得到两个半长基因组cDNA克隆pOK12／F1-5和pOK12／F6-9，再将其连接成全长基因组cDNA克隆pOK12／F1-9(pOKHCLV)。通过插入、替换、缺失等对pOKHCLV进行改造，获得了pOKHCLV／EGFP(插入EGFP基因)、pOKHCLV／EIAVep(插入马传染性贫血病毒抗原表位)、pOKHCLV／3′UTR(用石门强毒株的3′非编码区替换HCLV相应区域)、pOKHCLV／Shimen(用石门强毒株的3′半段替换HCLV的相应区域)、pOKShimen／HCLV(用石门强毒株5′半段替换HCLV的相应区域)、pOKHCLVdel4764(缺失HCLV编码区4764bp)、pOKCIHCLV(将HCLV基因组置于CMV启动子控制之下)等一系列猪瘟病毒嵌合分子克隆。这些分子克隆和嵌合分子克隆为研究HCLV致弱机制和标记疫苗奠定了基础。
陈巧林[10]2002年在《金属硫蛋白-3（MT-3）相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及性质研究》文中研究说明Alzheimer’s病(Alzheimer’s disease，AD)最显着的神经病理特征是神经突形成以淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)为核心的老年斑(senile plaque，SP)，由双股螺旋微丝(paired helix filament，PHF)构成的神经元纤维缠结(neorofibrillary tangles，NFT)以及大量的神经元丧失。尽管目前还无法确定AD的病因，许多证据已经表明，MT-3(又叫神经生长抑制因子，GIF)含量下降是造成AD脑大量神经元丧失的主要因素。MT-3主要分布于脑部中枢神经系统，在Alzheimer’s症脑提取物的存在下，对培养的神经元细胞具有特异的生长抑制活性。值得注意的是，单独的MT-3或单独的脑提取物均不具有生长抑制活性，这表明，MT-3可能是与脑提取物中的其它因子协同作用而发挥其抑制功能的。迄今，对于MT-3发挥抑制功能的分子机制仍不为人知。为深入研究MT-3对AD的作用机理，首次利用酵母双杂交系统(yeast two hybridization，又称相互作用陷阱，interaction trap)在正常人脑cDNA文库中对GIF相互作用蛋白(growth inhibitory factor interacting protein，GIFIP)进行了快速筛选，并通过GST融合表达系统对筛选到的GIFIP基因进行了表达，再从蛋白质的水平上进一步分析，确证表达产物与MT-3的相互作用及细胞生物学协同活性。 酵母双杂交系统技术是近年来发展起来的一种用于检测蛋白与蛋白间相互作用的灵敏的分子生物学方法。以MT-3为诱饵，构建成诱饵质粒pHyblex-MT-3(bait1)；采用基于LexA的酵母双杂交系统对正常人脑cDNA文库进行了大规模筛选，筛选了4.6×10~6个酵母文库转化子；得到12个较强的双阳性(His~+、lacZ~+)酵母克隆。分离阳性酵母中的文库质粒，经初步假阳性排除实验、DNA序列分析和网上DNA序列同源检索，表明其中1个阳性文库质粒的插入片段编码细胞核dUTPase的部分蛋白序列。 经初步分析认为，细胞核dUTPase可能具备与MT-3相互作用的条件。通过聚合酶链式反应(PCR)，自AD病人脑cDNA文库中扩增得到了包含蛋白全编码区的细胞核dUTPasecDNA。双杂交系统实验表明，完整的细胞核dUTPase可与MT-3相互作用，但不与MT-1相互作用。此外，我们还将细胞核dUTPase cDNA克隆于原核融合表达载体pGEX-4T-1，在大肠杆菌BL21中进行了诱导表达、纯化及酶活性测定研究。 为了进一步证实dU叮pase与州叮.3相互作用的真实性和特异性，通过免疚共沉沈实脸来脸证它们在哺乳动物细胞293中的相互作用.将州叮.3克隆于带F吨标签的真核表达载体PPlag-CMv一中，获得能表达Flag-州叮.3的真核表达质粒MT.3/PFI吧.cMv.2.将细胞核dUTpase cDNA克隆于带HA标签的真核表达载体Psv一HA中，获得表达HA一LjTpase触合蛋白的真核重组表达质拉dUTpas‘Ps从HA.使用L咖介c切mine将MT.3/pFI昭-C Mv.2和dtJI，as以Psv-HA共同转染293细胞，并以州汀.llPrlag心Mv.2和dUTPaS帅sv-HA共同转染293细胞为对照，结果表明dU即ase可在哺乳动物细胞内与州叮.1不发生相互作用，可与州汀.3特异性结合. 实脸证明在研究神经营养因于(NGF)的功能及其作用机制、神经元的细胞凋亡等方面，啥格细胞瘤株PC12可充当神经元模型.因此选用PC12作为模型，运用基因转染手段将dL厅pase、G一蛋白Rab3a和MT.3基因以不同组合方式共转染PC12细胞，同时将表达的重组细胞核dU汗吸、Rab3a和州汀.3蛋白进行不同的组合培养PclZ，运用M仃方法研究dUTPase、Rab3a对M叮‘3抑制PC12生长作用的影响.结果显示重组dUTpase和凡由3a均可与重组MT.3共同抑制PC12的生长，且其抑制曲线与MT.3的神经元生长抑制曲线极为相似，但其中任何单个成分都不能对PcIZ产生抑制作用，说明dUTPase和Rab3a是BE中与MT-3相互作用的蛋白因子. dUTpas。具有催化水解脱氧尿替叁磷嗽duTP)的特性，其作为细胞内dUTp浓度的重要调节子，很大程度上防止了d甘即通过DNA聚合酶错误掺入到DNA中而最终导致产生DNA碎片及细胞死亡.本文还就MT.3对d甘即ase保护由dUTp引起的正常细胞损伤的影响进行了研究与讨论. 为了将来研究MT.3及其相互作用蛋白性质和功能的需要，鉴于蛋白单抗制备的困难，以大耳家兔为免疫动物，对MT.3及其相互作用蛋白的多抗进行了制备，进一步利用硫酸盐沉淀法分离纯化多杭IgG，通过一定的测定方法和相关研究实验初步证明，制备的多杭符合蛋白性质研究的一般需要.
参考文献：
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[4]. 带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建[J]. 温建新, 仇华吉, 涂亚斌, 王柳, 彭金美. 中国预防兽医学报. 2005
[5]. 马传贫病毒中国株S2基因原核表达及多克隆抗体制备[D]. 高华. 内蒙古农业大学. 2009
[6]. 伪型EIAV病毒的制备[D]. 尹岚岚. 新疆农业大学. 2008
[7]. 马传染性贫血病毒受体选择剪接变异体的鉴定及功能性研究[D]. 张淑琴. 内蒙古农业大学. 2008
[8]. EIAV中国弱毒疫苗株的抗原多态性及超感染抵制现象在其诱导保护性免疫中的作用研究[D]. 马建. 中国农业科学院. 2012
[9]. 猪瘟兔化弱毒疫苗株cDNA分子克隆与嵌合分子克隆的构建[D]. 王明杰. 新疆农业大学. 2006
[10]. 金属硫蛋白-3（MT-3）相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及性质研究[D]. 陈巧林. 扬州大学. 2002
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