李爱红[1]2002年在《人参皂甙对缺血神经元的保护作用研究》文中进行了进一步梳理目的：研究人参的主要生物活性物质——人参皂甙(Ginsenosides,Gs)的叁种单体成分GSRb_1、GSRb_3、GSRg_1对培养小鼠皮层神经细胞缺血损伤的保护作用。 方法：①将离体培养的ICR小鼠胎鼠神经细胞缺血培养以模仿缺血对中枢神经元的损伤，观察不同缺血时间神经元形态及活性变化。②利用MTT比色法观察不同终浓度(0、20、40、60、80、100μmol／100ml)的GS单体对缺血神经细胞的作用。③利用离体培养的ICR小鼠胎鼠皮层神经元缺血模型，从形态、生化、细胞凋亡率方面观察了GSRb_1、GSRb_3、GSRg_1对缺血神经元的保护作用。 结果：①培养的小鼠胎鼠皮层神经元随着缺血时间的延长，神经元活性逐渐降低，缺血时间越长，神经元活性下降越多，细胞受损越明显，死亡率增加。②在所研究GS单体浓度范围(20-60μmol／100ml)中，对神经细胞的保护作用呈现浓度依赖性，以60μmol／100ml终浓度的GS单体能明显提高缺血神经元的活性和生存能力，减轻细胞的形态学损伤，随着浓度的再进一步升高，保护作用减弱，100μmol／100ml的GS单体对缺血神经元无保护作用。③药物组加用60μmol／100ml的人参皂甙单体后，与缺血组比较能明显减低细胞死亡率(P＜0.01)，使培养上清液中LDH及NO释放量下降(P＜0.01)，细胞匀浆中丙二醛(mDA)含量下降及细胞凋亡率下降(P＜0.01)，提高抗氧化酶SOD的活性(P＜0.05)，保护作用以Rb_3最明显。电镜观察人参皂甙保护的神经细胞损伤明显减轻，部分细胞形态基本趋于正常。 结论：人参皂甙单体对缺血培养的小鼠胎鼠皮层神经细胞具有保护作用，其作用机制可能与其提高抗氧化物质SOD含量，减少脂质过氧化物生成，拮抗兴奋性氨基酸毒性作用有关。
李源莉[2]2007年在《人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注致小鼠皮质神经元损伤的保护作用及其机制探讨》文中研究说明脑血管疾病(Cerebrovascular disease, CVD)是各种血管源性脑病变引起的脑功能障碍,是神经系统的常见病和多发病,死亡率约占所有疾病的10%,是目前人类疾病叁大死亡原因之一,50%～70%的存活者遗留瘫痪,痴呆及失语等严重残疾,给社会和家庭带来沉重负担。而缺血性脑血管病是脑血管病中最常见的一种,约占脑血管病70～80%。痴呆是CVD后期的常见并发症,有研究报告发现,78%的脑血管病人伴有不同程度的认知能力下降,痴呆也是老年人致残的常见原因,在65～70岁老年人发病率为1.4%,85岁以上达到23.6%。痴呆的典型病理变化为大脑皮质、海马等与认知记忆有关部位的神经元大量变性死亡,数目明显减少。目前脑血管疾病发病率呈逐年上升趋势,因此防治CVD后期所引起的神经细胞损伤方面的研究具有重要的现实意义。以往研究发现大脑短暂性缺血可导致皮质海马部位神经元大量变性凋亡,从而引起了患者认知功能障碍。近年来研究发现线粒体功能障碍在神经细胞凋亡过程中具有关键性作用,线粒体是细胞内的能量工厂,细胞缺血缺氧时可引起线粒体氧化呼吸链电子传递障碍,线粒体内部细胞凋亡信号转导通路启动。Caspase凋亡信号通路是目前认为比较经典的路径,线粒体功能障碍时可激活Caspase家族蛋白,首先活化的Caspase-9,依次活化下游蛋白,最终导致细胞不可逆死亡。因此探索抑制Caspase相关家族蛋白活化,对于防止细胞凋亡具有重要意义。人参皂甙Rg1(Ginsenoside Rg1)是人参重要的活性成分之一,近年来人参皂甙Rg1的的神经营养和神经保护作用受到人们的关注,研究表明其对帕金森病(parkinson,s disease,PD)发病过程中黑质多巴胺能神经元变性凋亡具有一定的抑制作用,提示其可能在防治PD病变中具有积极作用,然而人参皂甙Rg1对于大脑皮质神经细胞损伤是否也具有保护作用,值得进一步研究。NKs是一个结构相似的速激肽家族,主要包括P物质(Neurokinin-1,NK1)、神经激肽A(NK2)、神经激肽B(NK3),其生物学效应由相应的NK1、NK2和NK3受体(G蛋白偶联受体)来介导。研究表明神经激肽-神经激肽受体在中枢神经系统分布十分丰富,提示神经激肽在神经元生理和病理过程中可能具有重要作用。NK-4R是研究发现的一种新型神经激肽受体,目前对于其在中枢神经系统的分布特征还不清楚。因此本课题的主要目的在于以前几个方面:(1)观察NK-4R在大脑皮质部位神经细胞上是否有分布以及分布特征;(2)观察人参皂甙Rg1是否对缺血再灌注致皮质神经元损伤具有保护作用;(3)探讨人参皂甙Rg1神经保护作用机制是否与抑制Caspase家族蛋白活化有关。这些问题的研究将为脑血管疾病后期神经细胞损伤凋亡以及痴呆的防治提供一些实验依据。本课题所采用的实验方法包括:采用动物实验研究、短暂反复结扎小鼠双侧颈总动脉制备脑缺血再灌注损伤模型、给予人参皂甙Rg1进行药物干预、采用免疫细胞化学染色,荧光双标及激光共聚焦显微镜技术等方法,主要探讨和分析NK-4R在大脑皮质的分布特征;NK-4R标记的大脑皮质神经元在人参皂甙Rg1药物干预组,模型损伤组以及空白对照组之间是否存在数目变化差异;人参皂甙Rg1的神经保护机制是否与粒体功能障碍时Caspase家族蛋白活化有关。主要实验结果包括:(1) NK-4R免疫阳性产物在大脑皮质的锥体细胞层(Ⅲ、Ⅵ层)分布最多,在皮质内、外颗粒层、多形层(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ层)也有分布,其阳性产物表达于神经元胞体和突起的膜表面,是一种细胞膜受体。免疫荧光双标结果观察到NK-4R与神经元胞核特异性标记物NeuN共存(100%,146/146,双标细胞数目/NK-4R阳性细胞数目),且不与星形胶质细胞标记物GFAP共存,证实NK-4R确实是分布于神经细胞膜上。(2)人参皂甙Rg1对小鼠脑缺血再灌注致皮质神经元损伤存在一定的神经保护作用。人参皂甙Rg1能够增加神经细胞活力,减少皮质大脑皮质神经元的死亡数目。而模型组小鼠神经细胞活力降低,存活的神经元的死亡数目明显少于给药组。(3)人参皂甙Rg1神经保护机制可能与Caspase凋亡通路中一个非常重要的因子,Caspase-9活性的抑制有关。模型组动物大脑皮质神经细胞核Caspase-9表达数目增加,显着多于空白组和人参皂甙Rg1中剂量组。主要结论:(1) NK-4R免疫阳性产物在大脑皮质神经元的分布表达,提示NK-4R可能参与了哺乳类动物大脑皮质神经元功能调节和病变过程。(2)人参皂甙Rg1能够抑制大脑皮质神经元缺血导致的损伤凋亡,表明一定剂量的人参皂甙Rg1可能具有阻止脑血管疾病中神经细胞损伤的作用。(3)人参皂甙Rg1神经保护机制可能与降低Caspase-9的表达有关,此机制还有待于进一步探讨。本实验为NK-4R的进一步研究提供了一些形态方面的依据;同时也为人参皂甙Rg1防止脑血管疾病后期的神经病变的防治给出了一些实验参考;神经细胞凋亡是一个由多个因素参与的非常复杂病变过程,我们的实验观察到人参皂甙Rg1可能是通过了抑制caspase-9的表达,此作用机理仍需进一步探讨。
李爱红, 柯开富, 包仕尧, 吴小梅[3]2003年在《人参皂甙Rb_1、Rb_3、Rg_1对培养小鼠皮层细胞缺血损伤的保护作用及浓度—效应关系》文中进行了进一步梳理目的:研究人参皂甙(Ginsenosides,Gs)的叁种单体成分GSRb_1、GSRb_3、GSRg_1对培养小鼠皮层神经细胞缺血损伤的保护作用。方法:①将离体培养的ICR小鼠胎鼠神经细胞缺血培养以模仿缺血对中枢神经元的损伤,观察不同缺血时间神经元活性变化。②利用MTT比色法观察不同终浓度(0、20、40、60、80、100μmol/L)的GS Rb_1、Rb_3、Rg_1对缺血神经细胞的作用。③检测细胞外液LDH释放量以观察60μmol/L浓度的GSRb_1、Rb_3、Rg_1对缺血神经细胞存活的影响。结果:①培养的小鼠胎鼠皮层神经元随着缺血时间的延长,神经元活性逐渐降低,缺血时间越长,神经元活性下降越多、细胞受损越明显、死亡率增加。②在所研究GS浓度范围(20～60μmol/L)中,对神经细胞的保护作用呈现浓度依赖性,以60μmol/L终浓度的GS单体能明显提高缺血神经元的活性和生存能力,减轻细胞的形态学损伤,且这种保护作用以GSRb_2最明显,随着浓度的再进一步升高,保护作用减弱,100μmol/L的GS单体对缺血神经元无保护作用。结论:适宜浓度人参皂甙单体对缺血培养的小鼠胎鼠皮层神经细胞具保护作用。
罗天飞, 刘姗姗, 葛鹏飞, 张纪周, 洪敏[4]2008年在《人参皂甙Rb1对短暂脑缺血后神经元损伤的保护作用》文中研究说明目的探讨人参皂甙Rb1对缺血后神经元损伤的保护作用。方法Wistar大鼠36只,随机分为假手术组、对照组和人参皂甙Rb1组,每组12只。对照组和人参皂甙Rb1组采用双侧颈总动脉暂时夹闭法制备大鼠全脑缺血模型,假手术组仅行手术而不进行缺血。人参皂甙Rb1组模型制备前3d给药30mg/kg,持续给药至缺血后3d,共6d。叁组大鼠均在缺血后3d处死。采用HE染色及光镜观察计数CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡数量。蛋白印迹分析bcl-2及bax的表达。结果缺血组中海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡率分别为:(98.2±1.1)%、(95.5±2.2)%、(54.3±11.5)%、(11.7±4.3)%、(23.1±8.6)%;人参皂甙Rb1组各脑区的死亡率分别下降至(55.2±9.7)%、(5.4±2.4)%、(4.3±3.1)%、(2.4±1.2)%、(3.7±1.9)%,与缺血组相比较死亡率显着下降(均P<0.01)。与对照组相比,缺血后的CA1、DG及皮层区神经元内bcl-2表达显着减少,而bax表达显着增加。与缺血组相比较,Rb1组中CA1、DG及皮层神经元内的bcl-2表达显着增加,而bax表达显着减少。结论人参皂甙Rb1通过上调bcl-2的表达及下调bax的表达来实现对缺血后神经元损伤的保护作用。
张云峰, 姜正林, 曹茂虹, 柯开富[5]2005年在《人参皂甙Rb1对模拟缺血环境中的大鼠神经元胞内游离钙的影响》文中研究说明目的探讨人参皂甙Rb1(GSRb1)对模拟缺血环境中的大鼠神经元胞内游离钙的影响。方法对大鼠胚胎脑海马神经元进行体外培养,将其置于正常细胞外液(正常对照组)、模拟缺血的细胞外液(缺血组)、无钙的模拟缺血液(缺血+无钙组)、以及模拟缺血液+不同浓度的GSRb1溶液[缺血+GSRb1(20、40、60、80μmol/L组)],采用激光共聚焦技术测定各组细胞内钙荧光强度,并计算与正常对照组相比荧光强度变化百分比。结果与正常对照组相比,荧光增强度缺血组为(73.5±10.31)%,缺血+无钙组为(4.5±2.58)%,缺血+不同浓度GSRb1组(20、40、60、80μmol/L组)分别为(20.2±3.41)%、(13.6±2.98)%、(10.5±3.62)%和(12.7±4.51)%;缺血+各浓度GSRb1组的荧光增强度明显小于缺血组(均P<0.01)。结论缺血缺氧时神经细胞内游离钙的上升主要是来自细胞外钙离子内流;GSRb1可通过抑制细胞外钙离子内流,减轻细胞内的钙超载,保护缺血神经元;保护作用呈浓度依赖性,在60μmol/L时达到最大。
刘慧琳[6]2013年在《人参皂甙Rb_1对血管性痴呆大鼠认知功能障碍的防治作用》文中认为研究背景：老年痴呆(Senile dementia)是一种易发生在高龄人群的以逐渐加重的进性认知功能障碍为主要表现的神经系统退行性疾病。我国已成为全世界老年人数量最大的国家，统计显示我国老年人群中老年痴呆的平均患病率为3.7%～7.8%，我国老年痴呆的患病人数已超过五百万。老年痴呆严重影响患者生活质量，并威胁到患者生命，给家庭、社会造成巨大的人力及经济负担，由于缺乏有效的治疗手段，该疾病已成为危害人类健康的主要致死性疾病之一，目前已经成为备受社会关注的社会热点问题之一。老年痴呆有多重致病原因，其中血管性痴呆（vasculardementia，VD）是其最常见的形式之一，约占其发病总数的20-30%。其主要发病机制是各种原因导致的脑供血不足导致中枢神经系统功能逐渐减退，进而出现进行性加重的认知功能障碍。多年来广大科研工作者长期致力于该疾病的机制及防治研究，世界卫生组织已将此血管性痴呆列为21世纪的重点研究项目，虽取得了较大进展，但目前仍无有效防治该疾病的药物或措施。人参是一种具有悠久历史的传统中药，已有上千年药用历史，已被以单独或作为一种成分广泛应用于临床，具有抗自由基、抗凋亡、改善微循环等多种功效，已被运用于心肌梗死、中风等多种疾病的治疗，并取得了肯定疗效。人参皂甙（Gnsenoside，GS）是人参主要药理活性成分，Rb1是人参二醇组皂甙。在人参的众多皂甙成分中以Rb_1含量高，活性强，具有人参的大部分药理作用。前人的研究结果提示人参皂甙可减轻颞叶癫痫所致的大鼠认知功能障，但人参皂甙Rb_1对血管性痴呆所致的认知功能障碍是否有治疗作用尚不明确。故本实验拟利用双侧颈总动脉永久结扎大鼠模型复制大鼠血管性痴呆模型，运用行为学、膜片钳技术、分子生物学等多种技术研究人参皂甙Rb_1对大鼠血管性痴呆是否有治疗作用。实验目的：1．证实人参皂甙Rb_1对VD大鼠的治疗作用；2．初步探索人参皂甙Rb_1防治VD的机制。实验方法：1．实验动物、分组及模型复制雄性健康SD大鼠60只，体质量200～250g，将动物随机分为叁组。对照组(Control group)、模型组(Model group)、人参皂甙Rb_1治疗组(Ginsenoside Rb1group)。Ginsenoside Rb1group大鼠进行双侧颈总动脉结扎(2-VO)，结扎后给予人参皂甙Rb_1，腹腔注射，2mg/kg·d，1次/日，模型组进行双侧颈总动脉结扎后每日给予等量生理盐水腹腔注射，对照组手术过程同前，但不结扎颈总动脉，术后给予等量生理盐水。术后28天，先进行Morris水迷宫行为训练及测试，然后麻醉后断头处死并取海马组织，检测相应指标。2．Morris水迷宫行为测试术后28天进行Morris水迷宫训练，共5天，每天训练2次，具体训练方法为：分别从4个不同象限的中点将大鼠头朝池壁放入水池，任其在水中自由游泳，如大鼠在60s内找到并爬上平台，让其在平台上停留30s，以强化记忆效果，逃避潜伏期为实际寻找平台所用的时间，如在60s内大鼠未能找到平台，则由实验者用工具将其引导至平台，同样让大鼠在平台上停留30s，以强化记忆效果，同时以60s为逃避潜伏期。上述运动轨迹被设在水池正上方的摄像记录系统实时记录。取每天训练所记逃避潜伏期的平均值作为当日的逃避潜伏期。②空间探索试验：在开始训练前和训练5天结束后进行实验，具体方法为：撤除平台，从原平台所在象限对侧象限的中点面朝池壁放入大鼠，任其在水中自由游泳120s，用设在水池正上方的摄像记录系统实时记录大鼠运动轨迹，并计算大鼠在平台所在象限活动的时间。3．海马脑片制备异氟烷吸入麻醉后断头处死大鼠，低温条件下快速取脑，然后将其浸入冰浴人工脑脊液中，该脑脊液已被预充氧气、二氧化碳混合气（O295%、CO25%）达饱和状态，其主要成份为(mmol/L)：glucose (11)，NaCl (126)，CaCl2(2.4)，MgCl2(1.2)，NaH2PO4(1.2)，KCl (2.5)，NaHCO3(26)(用NaOH滴定pH至7.35-7.45)。持续供氧并冰浴条件下，利用震动切片机将鼠脑切为厚度400μm的脑片，取海马位置佳的脑片置于预充氧气、二氧化碳混合气的人工脑脊液中，34℃恒温条件下孵育1h，以恢复脑片活性。孵育后，小心将脑片移至记录浴槽，浴槽中持续灌流氧饱和的人工脑脊液（2ml/min），以维持脑片活性。4．海马CA1区长时程增强(LTP)记录记录电极内液为NaCl溶液（3mol/L），外液为人工脑脊液。测试脉冲参数：波形为方波，频率0.05Hz，波宽100μs，刺激强度以能诱发50%最大兴奋性突出后电位（fEPSP）为准。高频强直刺激（HFS）参数为：强度、波宽同测试脉冲，频率100Hz，时程1s。记录位点：利用倒置显微镜，将电极间距约300μm的激电极置于海马Schaffer侧支纤维处，将记录用玻璃微电极置于海马CA1锥体细胞层。测试步骤：给予适当强度的测试脉冲，开始记录fEPSP，待记录基线平稳后，继续记录fEPSP30分钟以上，给予间隔20s的两次HFS刺激，然后继续给予测试脉冲并记录fEPSP，持续1h以上。将刺激后的fEPSP斜率标准化为刺激前fEPSP斜率的百分比，该数值可作为评价fEPSP强度的定量客观指标。5．海马组织中Bcl-2、Bax及活化的caspase-3表达水平的检测实验结束后，断头取脑，取海马组织，制成匀浆，3000r／min离心20分钟(4℃)后，取上清，改良Lowry法测定蛋白浓度，-70℃保存备用。取总蛋白量一致的各样品，加入1μL的β-巯基乙醇及一定体积的1×SDS加样缓冲液，混匀，煮沸10分钟后，4℃条件下离心5分钟(10000r／min)，加样，聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离蛋白，半干式电转印至聚偏二氟乙烯膜上。将聚偏二氟乙烯膜置于5％牛奶封闭液中，室温2h。加一抗（Bcl-2抗体，1:400；Bax抗体，1:1000；活化的caspase-3抗体，1:500），4℃过夜。氨基丁叁醇缓冲液漂洗3次，每次10分钟。加二抗（羊抗兔IgG），室温孵育2h后，用氨基丁叁醇缓冲液漂洗3次，每次l0分钟。增强化学发光法显色，扫描拍照。6．氧化应激相关指标的检测取左侧海马组织在电子天平上称重，匀浆，在4℃低温离心机中4000r/min离心10分钟，取上清液，按照试剂盒说明书测定脑中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醇(MDA)。7．统计学分析实验所得数据结果以x±ｓ表示，用spss13.0进行统计学分析，fEPSP斜率和寻找平台潜伏期的组间比较采用重复测量的多因素方差分析及Tukey-Kramer检验，其余数据均用单因素方差分析进行统计学分析。以P <0.05为有统计学意义。实验结果：1人参皂甙Rb1可显着减轻慢性缺血对大鼠寻找平台潜伏期的影响在Morris水迷宫实验中模型组大鼠寻找平台的潜伏期明显长于健康对照组，有显着统计学差异(P <0.05)，人参皂甙Rb1治疗后大鼠寻找平台潜伏期较模型组显着缩短(P <0.05)(Fig1)，提示人参皂甙Rb1可显着减轻慢性缺血导致的大鼠寻找平台潜伏期延长，减轻慢性缺血对大鼠记忆力的损害。2人参皂甙Rb1可明显延长VD大鼠在目标象限的停留时间如Fig2所示，空间探索试验中，模型组大鼠在目标象限的停留时间显着短于对照组(P <0.05)，人参皂甙Rb1治疗组大鼠在目标象限的停留时间较模型组明显延长(P <0.05)，人参皂甙Rb1可显着延长慢性缺血大鼠在目标象限的停留时间，再次证实人参皂甙Rb1可减轻慢性缺血对大鼠记忆力的损害。3人参皂甙Rb1可显着减轻慢性缺血导致的大鼠海马LTP抑制电生理实验证实，给予HFS后各组大鼠海马fEPSP均较前增强，即各组均可诱发LTP，并持续1小时以上。与对照组相比HFS刺激后模型组LTP被显着抑制（P<0.05），人参皂甙Rb1治疗可显着减轻慢性缺血导致的大鼠海马LTP抑制，人参皂甙Rb1治疗组LTP较模型组显着增强（P<0.05），从脑片电生理水平再次证实人参皂甙Rb1可减轻慢性缺血对大鼠记忆力的损害（Fig3）。4人参皂甙Rb1对VD大鼠海马Active-caspase-3水平的影响Western blot结果显示，模型组海马组织的Active-caspase-3表达水平较正常对照组明显升高，人参皂甙Rb1治疗后海马Active-caspase-3表达水平显着下降。提示：人参皂甙Rb1可以显着减轻VD大鼠海马组织的Active-caspase-3水平升高，提示其可抑制海马细胞的凋亡（Fig4）。5人参皂甙Rb1对VD大鼠海马bax/bcl-2表达水平的影响如图5A所示，模型组海马bax蛋白表达水平较正常对照组显着升高，bcl-2蛋白表达水平较正常对照组明显下降，人参皂甙Rb1治疗后bax蛋白表达水平显着下降，bcl-2表达水平显着升高。利用Biosens凝胶分析系统进行图像分析，计算bax/bcl-2灰度比值，结果示：与对照组相比，模型组海马bax/bcl-2比值明显升高（P <0.05），人参皂甙Rb1治疗组bax/bcl-2比值较模型组下降（P <0.05）（图5B）。上述结果证实：人参皂甙Rb1可以显着减轻VD大鼠海马细胞的凋亡。.6人参皂甙Rb1对VD大鼠海马氧化应激水平的影响由tab1可见，模型组大鼠脑组织SOD、GSH-Px、GSH均较正常对照组显着降低（P<0.05），MDA较正常对照组明显增高（P<0.05），人参皂甙Rb1治疗后可显着提高VD大鼠海马组织SOD、GSH-Px及GSH的水平（P<0.05），并降低海马组织MDA水平（P<0.05）。上述结果提示：人参皂甙Rb1可显着减轻VD大鼠氧化应激反应水平。结论：1．本课题从动物行为学及脑片电生理两个不同水平证实人参皂甙Rb_1对VD大鼠认知功能障碍的治疗作用。2．人参皂甙Rb_1对VD大鼠认知功能障碍的治疗作用可能和其轻海马神经元的凋亡有关。3．人参皂甙Rb_1对VD大鼠认知功能障碍的治疗作用可能和其降低海马氧化应激水平有关。
黄飞[7]2012年在《人参皂甙Rb1调节AQP4表达在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中作用的实验研究》文中研究指明脊髓缺血再灌注损伤（Spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCII）一直是神经科学研究的难点之一，SCII是指在某种损伤因素作用下脊髓经过一定时间缺血后得到血液再灌注后出现明显的功能障碍，甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象。脊髓缺血再灌注的主要损伤因素在于再灌注后的继发性损伤，决定了脊髓缺血再灌注损伤的预后。继发损伤的发病机制主要涉及脊髓水肿、神经细胞凋亡等机制，因此保护脊髓神经元，避免脊髓水肿，是治疗脊髓缺血再灌注损伤的关键所在。水通道蛋白4（Aquaporin4,AQP4）广泛分布于脊髓之中，特异性介导水分子的双向转运，对维持细胞内外渗透压起着关键的作用。脊髓缺血再灌注损伤的具体发病机制虽不清楚，但早期脊髓组织水肿是得到广泛公认的病理改变，因此推测水通道蛋白4在脊髓缺血再灌注损伤中表达异常，而调控水通道蛋白4表达无疑有希望成为治疗脊髓缺血再灌注损伤的新型特异性靶点。人参作为一种名贵的中药，药性温和，药理作用广泛，其作为药物使用已有近3500年的历史。人参具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、减少细胞凋亡、保护神经等作用。其发挥功效的主要成分之一是人参皂甙，人参皂甙是从人参在地表以上部分的茎叶中提取的有效成分，目前已提纯的单体成分有50多种。近年来，我国学者尝试将人参皂甙用于治疗神经系统疾病及神经损伤，已取得一定疗效，但人参皂甙对中枢神经系统的保护作用机制尚不清楚，缺乏系统深入的研究。在众多的人参皂甙单体中，人参皂甙单体Rb1具有显着的神经修复，抗氧化，清除氧自由基，减少细胞凋亡等效应，而脊髓缺血再灌注损伤中也涉及上述损伤机制，因此推测人参皂甙Rb1可能在脊髓缺血再灌注损伤中发挥重要治疗效应。本研究拟通过建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，应用The Basso BeattieBresnahan（BBB）评分系统评价脊髓神经功能；HE染色，尼氏体染色，Tunel凋亡检测等方法明确神经细胞形态变化及凋亡情况；应用免疫荧光，western blot，Real-time PCR等手段检测水通道蛋白4的表达情况。同时给予人参皂甙Rb1干预，观察人参皂甙Rb1干预对上述观测指标的影响，明确AQP4、人参皂甙Rb1和SCII叁者间的作用及其可能机制，为临床研发新型治疗SCII的药物提供理论基础。1.人参皂甙Rb1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的干预作用目的：明确人参皂甙Rb1对SCII的治疗作用，寻找适宜治疗剂量方法：SD大鼠120只，随机分为空白对照组，脊髓缺血再灌注组，人参皂甙5mg/kg·d治疗组，人参皂甙10mg/kg·d治疗组，人参皂甙治20mg/kg·d治疗组。采用腹主动脉夹闭法建立SCII模型，不同组别给予相应剂量的人参皂甙Rb1腹腔注射。给予腹腔注射人参皂甙后即刻记为0点，24小时后记为1d，分别在1d、3d、5d和7d四个时间点处死大鼠，采用BBB评分系统评价神经功能，HE染色观察病理组织结构和细胞形态改变，Tunel方法检测细胞凋亡情况。结果：脊髓缺血再灌注组，人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组，人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组，人参皂甙Rb120mg/kg·d治疗组均不同程度存在后肢功能障碍。人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组的BBB评分在1d后明显优于脊髓缺血再灌注组（P＜0.05）和人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组（P＜0.05）；但与人参皂甙Rb120mg/kg·d治疗组的BBB评分无显着差异（P＞0.05）。HE染色显示脊髓缺血再灌注组部分神经元受损，一些神经元胞体膨大，结构不清，可见细胞胞核固缩，组织间充血。人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组，人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组，人参皂甙Rb120mg/kg·d治疗组的镜下病理组织结构和细胞形态与脊髓缺血再灌注组比较均有一定的改善。Tunel检测显示空白对照组很少有细胞凋亡，脊髓缺血再灌注组的神经细胞凋亡率较高。在3d，5d和7d叁个时间点，脊髓缺血再灌注组的细胞凋亡率较空白组细胞显着增高（P＜0.05）；与脊髓缺血再灌注组相比，不同剂量的人参皂甙Rb1干预均会显着减少细胞凋亡（P＜0.05）；人参皂甙Rb15mg/kg·d治疗组的细胞凋亡率显着高于人参皂甙Rb110mg/kg·d治疗组（P＜0.05）；但是给予人参皂甙Rb110mg/kg·d和20mg/kg·d比较，细胞凋亡率没有显着性差异（P﹥0.05）。结论：人参皂甙Rb1对大鼠SCII有治疗作用，适宜剂量为10mg/kg·d。2.水通道蛋白4在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的动态表达变化目的：探讨水通道蛋白4在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用方法：SD大鼠72只随机分为空白组，假手术组和SCII组，每组24只。建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，并于1d、3d、5d、7d四个时间点分别处死6只。BBB评分评价神经功能，Western blot和免疫荧光方法检测AQP4的表达情况。结果：空白对照组和假手术组在不同时间点的BBB评分均为21分，SCII组的BBB评分在1d时最低，随时间推移逐渐增加，3d明显优于1d（P＜0.05），5d明显优于3d（P＜0.05），5d明显优于7d（P＜0.05）。Western blot在34KD及43KD分子量处可见特异性条带，SCII组早期AQP4的表达水平显着下降，即在1d、3d、5d、7d四个时间点AQP4的表达显着低于空白对照组和假手术组，但呈逐渐增加趋势；但在7d仍显着低于正常空白组和假手术组（P＜0.05）。免疫荧光检测AQP4的表达变化趋势与Western blot的检测结果相似。结论：SCII会导致AQP4低表达，这可能是造成SCII神经功能障碍的重要原因。3.人参皂甙Rb1通过调控AQP4环节治疗脊髓缺血再灌注损伤的机制研究目的：探讨人参皂甙Rb1对SCII大鼠AQP4表达的调控作用方法：SD大鼠96只，随机分为正常组，假手术组，SCII组和人参皂甙Rb1治疗组，每组24只。建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，治疗组每日给予腹腔注射人参皂甙Rb110mg/kg·d。所有组别分别在1d、3d、5d、7d四个时间点处死6只大鼠。BBB评分系统评价神经功能。HE染色、尼氏体染色检测脊髓组织结构和细胞形态变化，Tunel方法检测细胞凋亡情况。分别采用Western blot、real timePCR和免疫荧光法检测AQP4的蛋白和mRNA表达变化。结果：与SCII对照组比较，人参皂甙Rb1治疗可显着增加大鼠BBB评分，改善神经细胞形态，减少细胞凋亡。人参皂甙Rb1可以显着增加SCII模型的AQP4蛋白和mRNA表达，并且在人参皂甙Rb1干预7d后AQP4蛋白和mRNA表达水平恢复至正常水平，与空白对照组比较无显着差异（P﹥0.05）。结论：人参皂甙Rb1对大鼠SCII具有治疗效果，其作用机制可能是上调AQP4表达，减少神经水肿及细胞凋亡。
罗天飞[8]2015年在《自噬及GEF-H1通路对缺血再灌注后神经元损伤的影响及人参皂甙Rb1的干预研究》文中研究说明缺血性脑血管病是严重影响人类健康的主要疾病，其发生原因主要是由于血管重度狭窄或堵塞导致的脑组织血液供应不足。目前，临床上多选择颈内动脉内膜剥脱术、血管内支架置入术及颅内外血管搭桥术等方法恢复缺血脑区的血液供应，但是再灌注性脑损伤已经成为影响缺血性脑血管病疗效的主要因素之一。所以，探讨缺血再灌注性脑损伤的发生机制以及防治措施对提高缺血性脑血管病的治疗效果具有积极的意义。在本研究中，我们从“神经元”及“突触联系”两个方面探讨了缺血再灌注性脑损伤的发生机制及潜在的防治措施。主要做了叁部分实验，分别研究了自噬对缺血再灌注神经元损伤的影响，以及人参皂甙Rb1的干预作用和机制；人参皂甙Rb1的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系；以及GEF-H1通路对脑缺血再灌注后神经元可塑性功能恢复的影响。第一部分自噬在缺血再灌注性神经元损伤中的作用及人参皂甙Rb1的干预研究目的：探讨自噬对缺血再灌注神经元损伤的影响及人参皂甙Rb1的干预作用和机制。方法：采用体外研究和体内研究相结合的研究模式。体外研究采用SH-SY5Y细胞糖氧剥夺模型模拟缺血再灌注性神经元损伤。采用MTT法测定细胞生存率、AO和MDC染色观察自噬的发生、锇铀铅染色透射电镜观察自噬的形成、AO染色流式细胞仪计数、蛋白印迹分析自噬相关蛋白表达。体内研究采用雄性Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭结合股动脉抽血降压法制作全脑缺血再灌注模型。采用HE染色、免疫组织化学染色、激光共聚焦显微镜、锇铀铅染色透射电镜、蛋白印迹分析等方法检测自噬相关蛋白的表达变化。结果：体外研究结果，MTT法测定结果显示，人参皂甙Rb1处理组，细胞存活率增加；透射电镜检查显示，糖氧剥夺组细胞的胞浆内较广泛地形成了具有双层膜特点的自噬泡；MDC染色荧光显微镜观察发现，同对照组相比较，糖氧剥夺组细胞核周围呈斑点状的绿色荧光强度增高，但是人参皂甙预处理组的斑点状荧光强度显着下降；蛋白印迹分析显示，人参皂甙Rb1不仅抑制了糖氧剥夺所致自噬相关蛋白Becklin1和LC3的表达，还抑制了LC3I向LC3II的转化。体内研究结果，HE染色光镜下所见15分钟全脑缺血72小时再灌注组神经元呈死亡神经元的形态学特点，人参皂甙预处理组神经元的形态学特点介于假手术组和缺血再灌注组之间；光镜下计数人参皂甙Rb1干预后存活率增加；透射电镜检查显示，同假手术组相比较，海马CA1区神经元的胞浆内形成了自噬泡；LC3免疫组化染色激光共聚焦显微镜观察发现，再灌注24小时后海马CA1区神经元中自噬相关蛋白LC3蛋白的表达较假手术组显着增加，但是20mg/kg和40mg/kg人参皂甙预处理显着抑制了缺血再灌注所致LC3蛋白在海马CA1区神经元中的表达；蛋白印迹分析显示，同假手术组比较，再灌注24小时后自噬相关蛋白Beclin1和LC3I的表达显着提高，而且LC3I向LC3II的转化增多，然而20mg/kg和40mg/kg人参皂甙预处理不仅抑制了Beclin1和LC3I的表达，而且抑制了LC3I向LC3II的转化。结论：缺血再灌注后的海马CA1区神经元的死亡是过度激活了自噬；人参皂甙Rb1对缺血再灌注性神经元死亡的保护作用与其抑制自噬的过度激活有密切的关系。第二部分人参皂甙Rb1抑制缺血再灌注后神经元自噬性死亡中PI3K/Akt信号通路的作用目的：探讨人参皂甙Rb1抑制缺血再灌注后神经元自噬性死亡中PI3K/Akt信号通路的作用。方法：采用体外研究和体内研究相结合的研究模式。体外研究采用SH-SY5Y细胞糖氧剥夺模型模拟缺血再灌注性神经元损伤。体内研究采用雄性Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭结合股动脉抽血降压法制作全脑缺血再灌注模型。采用MTT法检测细胞增殖活力，蛋白印迹分析检测自噬相关蛋白及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达变化。结果：体外研究部分，MTT法检测细胞增殖活力显示，人参皂甙Rb1组细胞存活率显着增加，LY294002+人参皂甙Rb1组的细胞存活率较人参皂甙Rb1组显着下降；蛋白印迹分析显示，OGD后复氧12和24小时OGD组磷酸化Akt、Beclin1和LC3II的蛋白水平较对照组均显着升高；在人参皂甙Rb1预处理组，除外磷酸化Akt的表达水平较OGD组显着升高，自噬相关蛋白Beclin1和LC3II的蛋白水平较OGD组均显着下降；但是，PI3K抑制剂LY294002逆转了由人参皂甙Rb1所调节的磷酸化Akt高表达、Beclin1和LC3II低表达的情况。体内研究部分，HE染色光镜下计数结果显示，LY294002+人参皂甙Rb1组显着低于人参皂甙Rb1组海马CA1区存活的神经元以及DMSO+人参皂甙Rb1组。蛋白印迹分析显示，缺血再灌注组磷酸化Akt、Beclin1和LC3II的蛋白水平较假手术组显着升高；人参皂甙Rb1组和DMSO+人参皂甙Rb1组的磷酸化Akt蛋白水平较缺血再灌注组显着升高的同时，自噬相关蛋白Beclin1和LC3II的蛋白水平却较缺血再灌注组显着下降；但是，LY294002逆转了由人参皂甙Rb1所调节的磷酸化Akt高表达、Beclin1和LC3II低表达的情况。结论：人参皂甙Rb1是通过激活PI3K/Akt信号通路，对缺血再灌注后海马CA1区神经元自噬性死亡产生抑制作用。第叁部分GEF-H1通路对短暂性脑缺血再灌注后神经可塑性恢复影响的研究目的：研究脑缺血后GEF-H1通路的变化及作用机制，为神经元在经受缺血损伤后的功能恢复寻找新的治疗靶点。方法：本实验首先建立Wistar大鼠的双侧血管结扎的短暂性前脑缺血（2VO）模型。于麻醉状态下结扎双侧颈总动脉20分钟，然后恢复血流供应，分别选择0.5，4，24或者72小时的再灌注时间。对不同恢复时间脑组织的组织学研究采用HE染色，Western Blotting检测，免疫组化及共聚焦显微镜，电子显微镜，脱磷酸化以及pull-down分析等研究方法，来研究在脑缺血发生后GEF-H1通路的相关蛋白表达变化。结果：HE染色光镜下计数结果显示，20分钟的脑缺血在这个模型中主要在72小时的再灌注时发生迟发性神经元死亡，相比较DG区，CA1区和皮层区的神经元更容易受到损伤，皮层的神经元也会发生迟发性神经元坏死，尽管相对于CA1区程度更小；蛋白印迹分析显示，总GEF-H1含量未见明显变化，但是却在脑缺血后从P3转移至P1和P2部分，并从上带转移至下带。CIP处理后的分析表明，GEF-H1蛋白在脑缺血发生后很有可能从神经微管上解离并紧密合并进入了PSDs中；GEF-H1蛋白活性或是脱磷酸化作用在缺血再灌注的早期，在损伤和修复的区域同样的发生着显着的上升。然而，在缺血再灌注的后期，在迟发性神经元死亡的区域，GEF-H1蛋白是下降的，但是却在同样经历了缺血损伤后存活下来的神经元内发生了显着的升高。免疫组化及共聚焦显微镜结果显示，在脑缺血再灌注后30分钟和4小时，GEF-H1蛋白水平在所有大脑区域内基本没有改变或者只是发生了微小的下降，同时在皮层区转移至细胞核内。但是在24小时和72小时再灌注时间点上，与对照组相比，在易受损的CA1和一些皮层区，发生了进一步的下降，但是在抵抗脑缺血损伤能力较强的DG区，发生了明显的增高。在72小时再灌注组中，大部分的海马背侧CA1区的神经元发生了死亡，它们都发生了细胞核固缩并呈多角形的形态学变化；锇铀铅染色透射电镜结果表明神经微管在脑缺血发生后发生了持续的解离，RhoApull down检测发现，与对照组相比较，有活性的RhoA在脑缺血后发生了显着性增高，而总量基本没有变化。结论：GEF-H1在缺血再灌注后的不同时期作用不同，初始阶段GEF-H1的增高可能加重神经元损伤，恢复阶段GEF-H1蛋白的增高可以提高神经元可塑性，促进神经元功能恢复。
任小巧[9]2003年在《老龄大鼠脑缺血/再灌注细胞凋亡及相关基因表达和脑脉通对其影响》文中指出缺血性脑血管病是老年人常见病，随着老年人口的增多及老龄化社会的到来，发病人数将进一步增加。其病理基础与缺血后引起的神经元坏死和迟发性神经元死亡密切相关。其治疗主要是溶栓、应用神经保护剂（包括谷氨酸拮抗剂、钙通道阻滞剂等）、外科治疗等，虽然取得了一定疗效，但因缺乏满意效果或安全性使其临床应用受到限制。新的神经保护剂正在试验中。中医认为正虚血瘀，浊毒内蕴是老年缺血性卒中发生的前提，肝风旋动，挟浊毒损伤脑络是老年脑缺血损伤的发展的关键；解毒降浊、益气活血法是治疗老年脑缺血/再灌注损伤的主要方法。而目前中医药、西医药及中西医结合方法防治缺血性脑血管病的实验研究中多以青年动物为对象，忽视了人类脑血管疾病中增龄因素的重要性。这对于探讨老年缺血性脑血管病病理生理特点及用于指导临床防治方面有一定的差距。因此，本课题以老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征、细胞凋亡调控基因表达变化及其与中医气虚血瘀，浊毒损络的关系为研究的切入点,用“益气活血”、“解毒降浊”的脑脉通进行干预以阻断缺血损伤因果转换、恶势循环，保护神经细胞。采用大脑中动脉栓塞（线栓）致缺血3h、再灌注3 h、6h、12h、24h、72h为模型，用病理形态学、免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学技术等实验方法，从整体、细胞、分子、基因表达水平上，动态观察不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征及凋亡调控基因表达的异同,并进一步研究了脑脉通对老年脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡及凋亡调控基因表达的影响。主要实验内容与结果如下。1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡特征及脑脉通的保护作用应用整体观察包括神经功能评分、脑组织含水量、梗塞面积等及一般形态学方法包括HE染色、尼氏染色、透射电镜,琼脂糖凝胶电泳等技术对比研究了老龄与青年大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点整体和形态学变化特征的异同及脑脉通对其影响。结果发现老龄大鼠容易遭受缺血/再灌注损伤, 其损伤出现的时间早，损伤程度重,缺血损伤后梗塞面积大,其损害可随着缺血及再灌注时间的延长而加重,凋亡细胞数、凋亡小体呈现先少再多后少的变化规律，坏死细胞数随再灌注时间延长而增加。缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有坏死细胞增多,凋亡细胞减少，这些特征可能与增龄导致的细胞衰老有关。脑脉通中、大剂量可明显改善脑缺血/再灌注所致的神经元损伤，表现为改善神经功能、减轻脑组织含水量、缩小梗塞面积、减轻神经细胞损伤，保护神经元。其可能机理是合成自身修复所需的内源性蛋白，从而有利于神经元的修复；或可保护神经胶质细胞及血管内皮细胞，上调星形胶质细胞的活化状态,而有利于神经元的修复。这些作用可能与其益气扶正，解毒降浊的作用有关。2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡基因表达的变化及脑脉通对其调节作用。在取得上述结果的基础上，进一步应用免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学等实验方法，动态观察了不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡调控基因表达的异同及脑脉通对其影响。结果如下。<WP=3>2.1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞膜Fas、Fasl的表达及脑脉通的作用 脑缺血后Fas、Fasl均在缺血后注定死亡的细胞上表达，以半暗带区表达最强，缺血中心区及周边区亦可见弱表达； Fas、Fasl均随再灌注时间的延长而表达增强。老龄大鼠Fas、Fasl表达的增强时间均较青年大鼠早，其高表达持续时间较长。脑脉通解毒降浊，可以下调Fas、Fasl的表达，从而抑制细胞凋亡的发生，其效果等同于尼莫地平。2.2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞浆Bcl-2、Bax的表达及脑脉通的作用老年脑缺血后Bcl-2可见弱阳性表达，但其表达无时间规律性。青年大鼠脑缺血后Bcl-2均呈全脑性的增高,以缺血损伤侧为强，并随着缺血时间的延长先升后降，至再灌注72h时与假手术组比较无明显差异，其与缺血后细胞凋亡成负相关。青年或老龄大鼠脑缺血/再灌注后诱发Bax持续表达, 其表达与细胞凋亡成正相关。老龄大鼠Bax表达的增强时间及高峰时间均较青年大鼠早，其高表达持续时间较长。Bcl-2是抑制凋亡的基因，Bax是促进凋亡的基因，表达Bcl-2的细胞其形态多正常，表达Bax的细胞其形态多异常。老年脑缺血再灌注后Bcl-2的低表达或不表达及Bax的早表达和高表达可能与增龄导致的内源性保护能力降低有关，从而使老年脑缺血后神经元损伤较青年大鼠重。脑脉通益气扶正，解毒降浊可以上调Bcl-2的表达，抑制Bax基因表达，对缺血神经元有保护作用。其对缺血前期的保护效应等同于尼莫地平，晚期的保护效应优于尼莫地平。2.3 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞核caspase-3活性变化及脑脉通的作用Caspase-3是缺血后神经细胞凋亡的关键蛋白酶，其活性变化与缺血后神经元凋亡密切相关。 caspase-3的激活位于Fas、Fasl的下游。老龄大鼠缺血/再灌注后 caspase的激活早于青年大鼠。本实验显示应用脑脉通可降低脑缺血/再灌注后脑组织caspase－3的活性，说明脑脉通可能通过作用于caspase－3前酶或调节其上游基因的表达，抑制其激活；或直接抑制caspas
陈勇, 孙爱民, 陈智贤, 刘英, 陈龙华[10]2010年在《人参皂甙Rg1对NOS的调控在海马神经元放射性损伤防护中的意义》文中研究说明目的研究人参皂甙Rg1对原代培养大鼠海马神经元放射性损伤的保护作用及机制,为放射性脑损伤的预防提供理论依据及新的方法。方法 30Gy的X射线单次照射培养至12d的海马神经元,用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况,用NOS测定试剂盒测定细胞培养液NOS活性。结果 30Gy组在照射后24h核固缩百分数为(25.3±3.57)%,较0Gy组(1.95%±0.78%)有显着性差异(P<0.01);30Gy+人参皂甙Rg120mol/L组在照射后24h核固缩百分数为(7.43±1.51)%,较30Gy组(P<0.01)及0Gy组(P<0.01)均有显着性差异。30Gy组在照射后24h细胞培养液NOS活性为(6.46±0.95)U/ml,较0Gy组[(3.20±0.70)U/ml]有显着性差异(P<0.01),30Gy+人参皂甙Rg120mol/L组在照射后24h NOS活性为(3.85±0.69)U/ml,较30Gy组(P<0.01)及0Gy组(P<0.05)均有显着性差异。结论应用人参皂甙可以通过降低X线照射后NOS活性而显着减少神经元的凋亡。
参考文献：
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