1.山东大学附属千佛山医院 济南 250014；2.济南大学生命科学学院山东省医学科学院 济南 250012；
3.山东大学医学院生物化学与分子生物学系 济南山东 250012
摘要：目的 研究淋巴细胞对表达乙肝标志物的人肾小球系膜细胞（NHMC）凋亡的影响。初步探讨乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）肾损伤中的作用机制。方法 采用脂质体转染法将C基因型重组全长乙型肝炎病毒（PHY106-CHBV）转染至NHMC细胞后与人外周血淋巴细胞共培养。收集24 h，48 h和72h培养上清液，通过E-LISA进行HBsAg与HBeAg的定性检测；MTT法检测NHMC细胞增殖率；流式细胞仪检测NHMC细胞凋亡率。结果 实验组细胞培养上清液中可检测到HBsAg和HBeAg的高表达；MTT结果显示NHMC细胞增殖受抑制；流式细胞仪检测结果显示NHMC细胞凋亡率增加。结论 淋巴细胞与表达乙肝标志物的NHMC细胞共培养可导致NHMC细胞凋亡增加。
关键词：肝炎病毒，乙型；人肾小球系膜细胞；细胞凋亡；淋巴细胞；共培养
Abstract：Objective To investigate the effects of lymphocyte on apoptosis in NHMC cells which express HBVAg.The purpose of the study can explore the mechanisms of renal injury in patient with hepatitis B associated glomerulonephritis（HBV-GN）.Method Recombinant full length C genotype hepatitis B virus were transfected into NHMC cells by Liposomes carrying method；Culture supernatant of NHMC cells was collected at 24h，48h，72h after transfection，HBsAg and HBeAg were detected by the ELISA method；The proliferation rate of NHMC cells was measured by MTT assary；The apoptosis rate of NHMC cells was measured by flow cytometry. Results The HBsAg and HBeAg were detected high expression after PHY106-CHBV transfected into NHMC cells.Lymphocyte inhibit the proliferation of the co-cultured NHMC cells（p<0.01）；Detected by flow cytometry，the apoptotic percentage of NHMC cells were increase.Conclusion Lymphocyte promote the apoptosis rate of the co-cultured NHMC cells which express HBsAg and HBeAg.
Key words：Hepatitis B virus；NHMC；Apoptosis；Lymphocyte；co-cultured
乙型肝炎病毒相关性肾炎（hepatitis B virus associated glomerulone-phritis，HBV-GN）是乙型肝炎病毒感染引起的常见肝外损害之一，其发病机制尚不十分明确，目前已知乙型病毒性肝炎发病过程中细胞毒性T细胞是引起病理损伤的重要免疫活性细胞。推测在肝外病变中，细胞毒性T细胞介导的细胞免疫同样会引起相应的免疫损伤。本实验为研究外周血淋巴细胞在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用，将表达乙肝标志物的NHMC细胞与人外周血淋巴细胞共培养，观察人外周血淋巴细胞对表达乙肝标志物的NHMC细胞凋亡的影响。
1材料和方法
1.1材料 C基因型重组乙型肝炎病毒（PHY106-CHBV，由北京地坛医院成军教授惠赠）；NHMC为人肾小球系膜细胞株（本实验室保存）；质粒提取试剂盒、脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；DMEM低糖培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青有限公司；注射用重组人白介素-2（rIL-2）购自江苏金丝利药业有限公司；植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）购自Sigma公司；Model 680 酶标仪为美国Bio-Rad公司产品；流式细胞仪为美国BD公司产品。
1.2方法
1.2.1细胞培养
人肾小球系膜细胞培养，使用DMEM低糖培养基（含10%新生牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/L链霉素）。在37℃、5%CO2 、饱和湿度条件下，培养瓶内常规培养，每隔2-3天用0.25%胰蛋白酶消化并传代，待进入对数生长期后进行实验。
人外周血淋巴细胞的分离与培养，无菌抽取肝素（125 u/mL）抗凝静脉血10 mL，加入PBS对倍稀释并混匀，吸取稀释血液缓慢加入含有淋巴细胞分离液的离心管中（血液∶淋巴细胞分离液为1∶1），1500 r/min水平离心15 min，小心取出离心管，用平口吸管小心吸取中层白色雾状的淋巴细胞层，PBS洗涤2遍，2000 r/min离心10 min，弃上清，加入DMEM低糖培养基（含有10%灭活新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素，60 µg/ml PHA和100 U/ml rIL-2）1 mL混匀。台盼蓝染色测定细胞存活率＞95%，倒置显微镜下进行细胞计数，计数后将细胞稀释至1×106 cells/mL，放入37℃、5%CO2培养箱内培养，每周2次半量换液。
1.2.2 PHY106-CHBV的提取与鉴定 取2 µlPHY106-CHBV转化感受态细菌DH5α，在具有Amp抗性培养板中，37℃温箱培育过夜。挑取单克隆加入20 ml具有Amp抗性的LB培养基中，37℃温箱培育过夜。质粒提取试剂盒提取质粒。采用HindⅢ和NsiⅠ双酶切质粒，琼脂糖电泳鉴别片段大小。并由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.2.3将转染PHY106-CHBV的NHMC细胞与外周血淋巴细胞共培养待NHMC细胞进入对数生长期，以1×104 cells /ml接种于6孔板中，在37℃、5%CO2 、饱和湿度条件下培养至80%~90%融合。取PHY106空载体和PHY106-CHBV各4 µg分别加入250 µL opti-MEM中，轻轻混匀。取脂质体10 µl稀释于250 µl opti-MEM中轻轻混匀，室温放置5 min。将上述稀释的质粒DNA加入稀释的脂质体中混匀，室温放置20 min。弃净孔板内细胞培养基，加入1500 µl DMEM低糖培养基。正常对照组加500 µl DMEM低糖培养基，阴性对照组加500 µl脂质体-PHY106 DNA复合物，实验组加500 µl脂质体- PHY106-CHBV DNA复合物。6小时后换液，加入含10%灭活新生牛血清的DMEM低糖培养基继续培养。每孔按1×106 cells /ml加入外周血淋巴细胞，继续培养48 h。
1.2.4 培养上清液HBsAg与HBeAg的定性检测 于转染后48 h收集各组细胞培养上清液送本院检验科进行HBsAg与HBeAg的定性检测。
1.2.5 MTT检测细胞增殖率 将共培养后48 h的各组细胞，接种于96孔板中，每组设6个复孔。待细胞贴壁，每孔加入MTT 10 µl，继续孵育4 h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入100 µl二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min待紫蓝色结晶完全溶解。酶标仪检测OD值，波长630/570。以只加培养液孔为空白对照，比色时以空白对照校零。
1.2.6细胞凋亡率的检测 AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡细胞比率。取对数生长期的NHMC细胞，按实验处理各组细胞。 离心收集共培养后48 h的各组细胞。用冷PBS洗涤细胞两次。加500 μl 1×Binding Buffer 悬浮细胞，浓度大约为1×106 cells/mL。在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞仪检测。
1.3 统计学处理 采用spss17.0统计软件进行统计学处理，数据以 ±s表示。方差齐性分析及t检验比较各组之间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PHY106-CHBV质粒的鉴定结果
2.1.1酶切鉴定结果使用Hind Ⅲ和Nsi I两种限制性内切酶，酶切得到5400 bp和920 bp两条DNA片段可证实PHY-l06真核表达载体上含有C基因型HBV的基因序列（图1）。
2.1.2 基因测序结果进一步证实，PHY-l06真核表达载体上的C基因型HBV的序列正确。（图2）
2.2上清液中HBsAg与HBeAg的定性检测结果 将PHY106-CHBV转染至人肾小球系膜细胞，培养至24、48和72 h后收集各组细胞培养上清，定量检测HBsAg与HBeAg的表达。结果显示各时相正常对照组和阴性对照组培养上清液中HBsAg与HBeAg的表达为阴性，实验组48、72 h培养上清液中HBsAg与HBeAg的表达为阳性。经统计分析，同时相的阴性对照组与正常对照组比较，24、48和72 h培养上清液中HBsAg与HBeAg的表达差异无统计学意义（P>0.05）；实验组分别与同时相的正常对照组及阴性对照组比较，24 h培养上清液中HBsAg与HBeAg的表达差异无统计学意义（P >0.05），而48、72 h培养上清液中HBsAg与HBeAg的表达差异有统计学意义（P <0.05）（见表1）
2.4 淋巴细胞对表达乙肝标志物的NHMC细胞凋亡率的影响 AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测NHMC细胞的凋亡率，利用流式细胞仪检测，细胞可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的红色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有蓝色和（或）红色荧光双重染色。下图中位于第四象限的细胞为早期凋亡细胞。实验组细胞早期凋亡率为（5.35±0.67）%明显高于正常对照组（0.93±0.17）%及阴性对照组（1.22±0.22）%。经统计学分析，差异有统计学意义（P <0.01），见图3。
3 讨论
自从Combes[1]首次报道与乙型肝炎病毒感染有关的肾小球肾炎以来，HBV感染与肾脏疾病之间的联系及发病机制始终是不断探索的课题。研究认为活化的CTL可通过两条途径清除病毒：1）胞溶途径：通过分泌穿孔素、颗粒酶（胞质颗粒中参与靶细胞损伤过程最主要的蛋白）等细胞毒分子直接杀伤病毒感染的靶细胞或通过Fas／FasL途径介导靶细胞凋亡；2）非胞溶途径：通过分泌细胞因子抑制病毒复制[2，3]。活化的CTL通过胞溶途径在清除病毒的过程中势必会造成靶细胞（例如：感染HBV的肝细胞、肾细胞等）的凋亡，导致靶器官的组织结构重建。若损伤较重，即使重建后仍会引起靶器官的病理及病理生理损伤，导致其功能受损，出现相应的临床症状。有研究曾在肾组织中找到乙肝病毒标志物及病毒颗粒的沉积[4]，提示HBV可感染肾细胞，同时马路等[5]在乙型肝炎病毒相关性肾炎患儿的肾活检组织中发现，肾间质中存在局灶CD4+和CD8+细胞的浸润。另外，采用免疫组化法在乙肝病毒相关性肾炎患者肾活检组织中也检测到穿孔素在肾间质、肾小球及肾小管的表达[6]。因而推测由穿孔素介导CD8+CTL 特异的细胞毒效应，可引起靶细胞的损伤和凋亡，导致肾脏的损伤。也有学者报道肾小管间质区HBcAg阳性与T细胞浸润程度有关，并且肾小管病变、间质炎症及纤维化程度较阴性者重[7]。以上研究提示肾组织中HBV不仅仅是通过形成抗原-抗体免疫复合物导致免疫复合物性肾小球肾炎，还可引起细胞毒性T细胞的浸润，造成肾脏损伤加重，但都缺乏相关的实验证据。为证明致敏淋巴细胞对肾细胞损伤的作用，本实验采用转染乙型肝炎病毒基因的肾细胞与接种过乙肝疫苗并产生抗体的健康人外周血淋巴细胞共培养，观察肾细胞凋亡情况，为阐明乙型肝炎病毒相关性肾炎发病机制提供细胞水平上的实验证据。研究发现表达乙肝标志物的实验组NHMC细胞在共培养时凋亡率明显增加，与对照组相比其差异有统计学意义。
既往认为特异性CTL主要通过胞溶途径发挥作用，乙型肝炎病毒可诱导肝细胞及外周血淋巴细胞Fas、FasL的高表达，在控制病毒感染的同时会引起肝细胞的大量破坏。也有研究表明非溶胞机制也起着同样重要的作用。活化的CTL可分泌某些细胞因子抑制病毒复制，同时募集大量的非特异性T淋巴细胞到肝脏局部，加重肝细胞的损伤。因而肝组织的病理损伤不仅仅由于Fas系统介导凋亡所致，病毒产物及免疫细胞因子等因素也参与肝细胞的损伤[8]。因而我们认为细胞因子在乙肝相关性肾炎发病中的作用也不可忽视。有研究发现HBV转基因小鼠过继转移HBsAg特异性CTL克隆，CTLs快速进入肝脏活化后，通过细胞接触诱导肝细胞凋亡的同时，分泌大量的IFN-γ。IFN-γ以非胞溶的形式既可以抑制HBV基因表达和复制，也会清除肝细胞胞浆中的病毒核衣壳，并且以SSB/La依赖的方式动摇胞核中整合的病毒RNAs，最终肝脏和体液中所有的病毒基因产物都减少[9]。采用慢性乙型肝炎患者血清体外培养肾小管上皮细胞可导致该细胞凋亡增加，并且慢性乙型肝炎患者血清中TGF-β1升高及病毒复制活跃程度有关[10]。研究发现TGF-β1能诱导小鼠肾小管上皮细胞凋亡，引起肾小管损害加重。其对肾脏的损伤作用有可能是通过与肾小管上皮细胞表面受体结合，经Smad和p38丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路介导，导致肾小管上皮细胞凋亡[11]。
基于以上的研究，我们推测在HBV-GN的发病中，外周血淋巴细胞既发挥细胞毒作用直接攻击靶细胞，也可通过免疫机制产生相应的细胞因子，进而激活细胞凋亡的信号通路，引起肾脏细胞的凋亡，从而加重肾脏损伤。至于在HBV-GN的发病中究竟通过那个信号通路发挥主导作用，尚有待进一步的研究。
参考文献：
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[9]Deng CL，Song XW，Liang HJ，et al.Chronic hepatitis B serum promotes apoptotic damage in human renal tubular cells[J].World J Gastroenterol.2006.12（11）：1752-6.
作者简介：孙晓军（1967-），女，主管技师，从事临床检验工作。
通讯作者：王义国（1965-），男，主任医师，硕士生导师，主要从事病毒性肝炎的基础与临床研究。
基金项目：山东省科技发展计划资助项目（2007GGWZ02054）。
论文作者:孙晓军,,王义国, 洪森,,刘长虹,, 张鹏举
论文发表刊物:《健康世界》2015年2期
论文发表时间:2015/10/10
标签：细胞论文; 淋巴细胞论文; 乙型肝炎论文; 凋亡论文; 病毒论文; 损伤论文; 肾小管论文; 《健康世界》2015年2期论文;