胡红梅1 李伟2
（1井冈山大学医学院 江西吉安 343000；2 井冈山大学临床医学院 江西吉安 343000）
【中图分类号】R699 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）33-0053-02
精子发生是男性生殖细胞增殖、分化的过程，始于青春期并维持终生。精原细胞尤其是精原干细胞是持续维持精子发生的关键因素。个体内可因缺乏精原干细胞或放疗、化疗而导致生精细胞发育障碍或产生无功能性精子等原因引起不育。新近发展的精原干细胞移植技术为研究精子发生机理提供了新的途径。本文简要综述这项技术的发展过程、主要方法以及最新进展和应用前景。
1 精原干细胞移植技术分类及发展过程
精原干细胞同源移植技术包括自体移植和同种异体移植。这项技术始于1994年Brinster等[1]将可育小鼠的精原干细胞注射到不育小鼠的曲细精管使受体鼠产生了具有受精能力的精子并产出了正常后代，这是精原干细胞移植的首次重要突破。Honaramooz等[2]在实验中，将猪的生殖细胞移入自身对侧的睾丸（自体移植）和无关另外一头猪的睾丸中（同种异体移植），结果两者都未对供者的生殖细胞发生明显免疫应答，但植入猪睾丸中的小鼠生殖细胞却很快被清除，故他们认为免疫耐受现象只限于同源移植。1996年Clonthier等[3]将大鼠睾丸细胞显微注射到无免疫应答的重度综合免疫缺陷(severe-combined immunodeficient mice，SCID)的裸小鼠的睾丸中，睾丸干细胞会继续发育，并产生带有供体细胞种属的精子发生，取得了跨物种产生精子的重大突破。1999年Ogawa等[4]将小鼠的睾丸细胞移植到大鼠的睾丸中获得成功。Sofikitis[5]等认为人类睾丸细胞移入小鼠或大鼠可使25%的受体产生精子，这似乎表明灵长类生殖细胞或多或少比其它非啮齿类、非灵长类种属与啮齿类动物生精小管的微环境更相容。Napano等[6]发现人的精原干细胞能在小鼠睾丸中至少可以存活六个月，且在移植后第一个月能保持增殖但不能分化。这种现象0gawa等认为可能是由于小鼠内源性的支持细胞缺乏足够的能力来支持系统发育距离较远的物种。但用睾丸组织块异位移植可部分解决上述问题，2002年Honaramooz等将新生小鼠、猪或羊的睾丸组织块（0.5-1mm3）移植到阉割的裸鼠的背部皮下，结果60% 以上的移植物存活，而且体积增大，并最终产生成熟的精子。
2 移植方法
利用显微注射的方法将可育供体的睾丸细胞混合物注入另一不育受体的曲细精管管腔内，从而诱导受体睾丸曲细精管管腔内出现供体精子生成过程。目前提出主要有三种移植方案：第一，直接穿过睾丸被膜注入睾丸网；第二，直接注入曲细精管管腔内。第三，通过成束的输出小管将睾丸细胞混合物注入到睾丸网。这三种方案均可以将供体精原细胞导入小鼠的曲细精管中，但后一种方案更常用。因为通过前两种方案将生殖细胞注入到牛、猴和人的睾丸中，不能成功地由注射位点注入到曲细精管的远端，而用一种超声波引导的睾丸网注射方法进行注射，可以看到在牛的睾丸网注射位点附近的间质区及曲细精管中都有被注射的生殖细胞。
3 移植步骤
3.1 供体动物和受体动物的选择
同源移植一般使用主要组织相容性抗原一致的动物，如供、受体鼠都是C57BL／6组织相容性基因型小鼠。供体动物还需带有一定标记物，如转lacZ基因（指导大肠杆菌B-半乳糖苷酶表达的基因）小鼠，1acZ基因可通过x-gal孵育染色之后呈蓝绿色，很容易就可将其鉴别出来。另外，还可用绿色荧光蛋白（GFP），或溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU) 标记异源移植应主要考虑受体动物的选择，选用裸鼠作为受体动物，另外，可选取精子形态与受体动物不同的动物作为供体细胞的来源。
3.2 供体细胞的分离、纯化和准备
供体细胞的分离、纯化是提高移植率的至关重要因素。一般多采用二步酶消化法获取单细胞悬液。利用胶原酶消化能将未消散的睾丸间质消散并释放大部分的管周肌样细胞。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆利用DNase和胰酶的消化可以释放支持细胞和精原细胞。这样就能有效分离并制备出高产量和存活率高的单细胞悬液。如果供体是成年鼠，还需用percoll不连续密度递度离心法分离纯化其精原干细胞，以提高移植率。最近Sofikitis等提出经抗-B1和抗a6-整合素抗体阳性选择的，免疫磁珠分选的精原干细胞移植可提高在受体睾丸中的克隆率，尤其a6-整合素的阳性表达可以富集到166倍的的精原干细胞。Shinohara等[7]认为富集的精原干细胞可提高克隆率，S1不育突变异种鼠和隐睾模型是富集来源，尤以后者为佳。
3.3 受体动物的处理
过去，受体动物一般是先天不育型和后天施与药物导致不育型两种。先天不育型如显性纯合的斑点小鼠。造成后天不育多使用的是白消安(busulfan)40 mg／kg 注射处理，或用10-14Gy的X射线照射2个月。白消安是一种抗肿瘤药物，注射白消安至少4周后方可进行移植，以较为彻底的灭绝内源性生殖细胞，从而在曲细精管中为植入的干细胞的发育提供了场所。由于促性腺素释放素类同物（GnRH-agonists）抑制LH、FSH的分泌从而减少睾丸激素产生、中断精子发生。故Dobrinski等[8]认为在注射白消安后移植前的4周内还应分两次注射人工合成促性腺素释放素—醋酸亮丙瑞林（leuprolide acetate）3.8mg/kg，这样可提高供体精原干细胞在受体睾丸中产生精子的数量从而提高移植效率。
3.4 细胞注射
使用一种显微注射仪，其玻璃针管的外径为1mm，针尖为40um可减少注射次数及提高注射的效果。操作时，将受体动物麻醉、固定，切开腹白线暴露睾丸，剪开睾丸白膜1～3个小裂口，每个裂口的长度不超过3 mm，使一微细管对准一条曲细精管并沿其长轴插入，该微细管与装有供体细胞悬液的注射器相连。这样，在显微操作仪的帮助下，针管中的供体细胞悬液就可以较顺利的进入曲细精管。细胞悬液的量在小受体动物中需5-100ul, 在大受体动物中则需2-5ml。目前认为每只受体睾丸注入约107的供体细胞可提高移植率。
3.5 受体睾丸检测
移植手术结束后，至少要使受体动物经历一个生精上皮周期才能对其进行分析。一般采用免疫化学、生物化学及分子生物学等手段进行多角度检测,如PAS反应，H-E染色，BrdU的免疫检测等。
4 移植前景
精原干细胞移植技术已成为研究精原干细胞的有力手段。同时也将为精子发生过程及其机理的研究提供重要材料。结合冷冻-解冻技术和体外培养技术,精原干细胞同源移植技术为那些需放疗、化疗的青年肿瘤患者保存生育能力带来曙光，异源移植技术可能会最终提供一种生产转基因动物的替代途径，因而很可能成为一种极有价值的生物工具。在理论上，此技术比转染和选择胚胎干细胞要容易。因为体外转染的胚胎干细胞只能从很少的小鼠品系中获得，而对培养的精原细胞转染和选择，移植入雄性生殖系，产生转基因精子，从而能培养更多物种中转基因动物后代。
参考文献
[1] Brinster R L，Zimmerman J W.Spermatogenesis following male germ cell transplantation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(24):11298-11302.
[2] Honaramooz A,Megee SO Dobrinski I.Germ cell transplantation in pigs.Biol Reprod,2002,66;21-28.
[3] Clouthier D E，Avarbock M R,Maika S D et a1.Rat spermatogenesis in mouse testes.Nature,1996,381:418-421.
[4] Ogawa T,Dobrinski I,Brinster RL.Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat. Tissue Cell 1999,3l(5):461-472.
[5] Sofikitis N,Mio Y,Yamamoto Y,et al.Transplantation of human spermatogonia into the seminiferous tubules (STs) of animal testicles results in the completion of the human meiosis and the generation of human motile spermatozoa. Fertil Steril 1999; 72(suppl 1):83–89.
[6] Nagano M,McCarrey JR,Brinster RL.Primate spermatogonia1 stem cells colonise mouse testes.Bio1 Reprod,2001,64:1409-1416.
[7] Shinohara, T, Orwig, K, Avarbock, M,et a1. Spermatogonial stem cell enrichment by multiparameter selection of mouse testis cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 8346-8351.
[8] Dobrinski I，Ogawa T，Avarbock MR，et al.Efect ofthe GnRH-agonist leuprolide on colonization of recipient testes by donor spermatogonial stem cells after transplantation in mice[J].Tissue Cell,200l,33(2):200- 207.
基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ10543）
论文作者:胡红梅1,李伟
论文发表刊物:《医药前沿》2013年11月第33期供稿
论文发表时间:2014-1-13
标签：睾丸论文; 干细胞论文; 受体论文; 供体论文; 小鼠论文; 精子论文; 细胞论文; 《医药前沿》2013年11月第33期供稿论文;