关键词：植物组织培养；染菌；原因；预防措施
前言：植物组织培养技术是从本世纪开始，以植物生理学为基础发展起来的一项繁殖技术。经过了近一个世纪的发展，这项技术在科学研究和生产上得到了广泛应用，成为举世瞩目的生物技术研究重要内容之一。特别是近几年来，它的研究领域十分活跃，在国内外已引起广泛重视，应用该项技术作各种课题研究的人员与日俱增，这是由于它在生物学理论探讨和生产实践上都取得了卓越的成就。目前，在发展和应用这一技术上，各国竞相投资，已在快速繁殖培养、去除病毒、加速育种进程和次生代谢物生产、种质资源保存等多方面都取得了明显的社会、经济及生态效益。毫无疑问，它的前景是十分可观的。由于，植物组织培养技术研究结果的好坏通常会受到多方面的影响，其污染产生的原因也是多种多样的。因此，为了降低染菌现象给植物组织培养造成的影响，还需要对其进行更深层次的研究。
1污染的分类及表现
植物组织培养中染菌现象的发生是限制植物组培育苗成果的重要因素，其主要的污染病源包括细菌污染和真菌污染两类。受到病菌污染的培育苗，常常会表现出生长速度缓慢、增殖率降低、玻璃苗现象增多等现象，造成植物组织培养的失败。
1.1细菌污染
细菌污染的通常都有较长的潜伏期，前期难以用肉眼观测到。多在5～10天后，在培养基的表面、材料附近或培养基的内部出现（白色或黄色的）黏液状菌斑、鼻涕状或丝状的菌落等，水迹呈浑浊状且伴随有发酵状的泡沫。
1.2 真菌污染
与细菌污染不懂真菌污染有发展迅速及难控制的特点，在植物组织培养的环境与条件下，生长迅速，观察较为方便，通常会在接种3～5天后出现，基本表现为：在培养基表面或材料附近出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层，常见为黑色、白色和黄色。当未及时处理真菌的污染时，孢子层就会逐渐从培养基的表面开始向瓶外蔓延，最终扩散到空气中，对培养室造成的严重污染。
2造成污染的原因
植物组培污染，主要指组培的时候，由于培养的温度、湿度及营养条件等刚好符合微生物的生产需求，植物组织材料可能会在这个环节出现培养体系污染问题。一般来说，植物组培污染都是在材料表面或者附近等部位，污染痕迹各不相同，是影响植物组培种苗是否能够成功的主要因素。通常情况下，植物组培时，跟霉菌污染相比，细菌污染的比例更高一些，大约占百分之八十。在细菌污染过程中，情况更为复杂的属于内生细菌污染。产生污染的污染源比较多，有真菌、病毒，还有植物病原细菌等。以真菌为例，真菌的来源是空气，当袍子在合适的环境中落下能够迅速的繁殖，从而对组培容器产生污染；以植物病原体细菌为例，一般分布在外植体的表面部门，也有分布在内部的，而病毒基本就是在植物内部，需要有传播载体，其中细菌污染最为严重。
2.1材料带菌
在植物组培污染中，一个不可避免的污染途径就是材料带菌，这跟生长环境及取样时间等都有关系，同时也跟外植体的消灭细菌的方法有一定的关联。通过深入的分析可以发现，一般来说从一种外植体中分离出来的杂菌种类有数十种，在热带植物中表现的最为明显。而随着植物材料年龄的增加，其健康度在减小，加剧了组培污染。就内源菌污染来说，因为其污染的来源是外植体材料内部的微生物，一般的表面消毒是不能被消灭的，是随着材料带入从而产生危害。
2.2实验操作和培养环境带来的污染
这种污染的表现主要在四个方面：第一个方面，无菌室灭菌操作不到位，还有的是超净工作台滤出来的空气中带有细菌；第二个方面，培养基细菌消灭的不彻底；第三个方面，操作中可能导致的交叉污染；第四个方面，人员操作过程中可能产生的污染。具体到第一个方面，在无菌室消灭细菌不彻底的情况下，会产生其他带菌类的生物，通过媒介把真菌袍子带入到材料中产生污染问题；第二种污染情况就是培养基的表面出现了一些黏液状的物质等状况的时候，就会引发细菌污染。假如菌落只是在培养基的表面存在，就有可能是因为培养容器中瓶塞等出现了松弛，导致真菌袍子进入出现污染；第三个方面的表现是因为材料自身就带有病菌，污染的跟未污染的材料共同培养就可能导致整体污染；第四个方面是人为操作不当导致的污染，主要是因为工作人员本身就是带菌者，作为载体在操作的时候呼吸排除带菌或者使用没消毒的器械等够可能导致污染。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
3污染的预防措施
3.1灭菌要彻底
对于一切用于植物组织培养的器具都要严格进行灭菌的操作。培养基的灭菌需要采取高温灭菌的方式，并对灭菌的时间严格把控，对于部分耐高温的培养基，需要将温度控制在121-123℃条件下，时间保证在20-30min。灭菌操作完成后，还可静置一段时间，观察灭菌工作的到位与否，倘若一段时间后培养基表面有细菌性的污染产生，则说明灭菌时间不足或温度不够。一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。
3.2选择适当的外植体
所谓材料带菌，主要就是原始材料就携带的有病菌，也可能是继代培养的材料上存在病菌。跟幼嫩的材料相比多年生材料的病菌数量要高出很多；跟室内材料相比，田间材料的带菌几率大；跟水培材料比，温室材料细菌数量多；跟不带泥的材料比，带泥的材料细菌比较多；同时，那些没有经过阳光照射的材料也存在比较大的带菌几率。那些块根快茎之类的植物因为其生存环境的影响，本身就会有细菌存在，所以在选择外植体的时候尽可能的不使用这些材料。体积大的材料本身表面积就比较大，带菌的可能性也比较大，污染概率就比较高一些。在取材的时候，要选择晴天的中午，这样枝条能够在阳光下杀菌。在取材之前可以用杀虫剂进行喷洒作业，避免因为寄生虫带菌而可能产生的污染问题，可以取中上段的茎段作为合适，也可以选择新生材料，比如，新生叶、新生枝条等，可以减少污染率。
3.3外植体消毒
外植体上可能附着外生菌和内生菌。外生菌可以通过表面消毒方法杀灭；而内生菌生长的植物材料内部，表面消毒难以杀灭，培养一段时间后，病原菌自伤口处滋生。防治内生菌首先将欲取材的植株或枝条放在温室或无菌培养室内预培养，再在培养液中添加一些抗生素或消毒剂。
3.4环境消毒
就当前情况来看，要尽量减少高温天气的接种行为，要密切注意对无菌室的除湿问题，还有熏蒸消毒问题，因为无菌室的密封性能比较好，还要注重培养环境方面的管理。要定期开窗换气，定期用高锰酸钾等进行消毒，减少细菌的产生概率。对于污染的材料要定期的清除，必须要用消毒液彻底清洗污染材料，只有经过高温消毒杀菌的瓶子等器皿才能使用，要密切关注工作台是否存在污染。
3.5严格科学地执行操作程序，实现无菌操作
对无菌操作或培养过程带的菌，必须通过严格无菌操作，保持环境清洁来达到。同时分析材料污染的症状：细菌污染通常是在培养基表面或材料附近出现粘液状物体、菌落或混浊的水渍状，有时甚至是泡沫发酵状；而真菌污染是先发现菌丝，继而很快出现黑、白、黄、绿等孢予。细菌污染主要是工作人员使用未经充分消毒的工具或呼吸排出的细菌或手接触材料或器皿边缘，使微生物落入培养基造成。这主要靠严格无菌操作来防止，如通过提高操作人员的素质，对各操作人员实行承包责任制的方法，对降低污染起到了很好的作用；而真菌污染则是由于空气污染和瓶口边缘、以及取放瓶塞扬起的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成，这主要靠保持环境清洁来达到。如通过过滤室外的空气，使接种室和培养室的空气保持无菌；通过控制培养室的空气湿度来减少霉菌污染；通过使用杀螨气雾剂来杀灭肉眼看不见的螨虫等。分清了污染源，对症下药，就能取得很好的效果。
3.6加强人为污染的防治
要减少人为污染，需要工作人员在进入到接种工作之前换上专业的鞋子和衣物，这些衣物每次都要进行消毒，并定期开展衣物清洗。在接种前还要用肥皂洗手，再用乙醇擦拭，要及时修剪指甲，具体接种的时候要快速操作，在工作中避免交叉污染现象的发生，定期对工具进行消毒和更换。在工作中严禁随意交谈，还要佩戴口罩作业。
4结语
随着组物组培培养技术的快速发展，植物组培育苗的应用领域也越来越广阔。保证植物育苗的顺利进行的关键就是在其过程中对细菌及真菌产生的污染加以控制，保证外植体的无损伤且能够正常生长。
现阶段，对于组物组培培养过程中产生的污染尚且还不能根除，预防与解决的措施还不完善，对污染问题进行系统深入研究还是十分必要的，分析污染出现的可能途径，研究相应对策，进而推动组培技术更快更好地走向商业性生产。
参考文献：
[1]潘娟，李先源，李名杨.植物组织培养过程中常见问题及解决方法[J].2015(45):69.
[2]王瑛，高新一．植物组织培养技术手册[M]．北京：金盾出版社，2006．
[3]蔡炳华，陈丽娟，江文，等．植物组培生产污染控制技术[J]．中
国南方果树，2012(5)．
[4]屈云慧，杨春梅，蒋亚莲．花卉组织培养中污染的发生与防治［J］．北方园艺，2007(8):188-189．
[5]尚宏芹．植物组织培养中的三大难题概述［J］．生物学教学，2010，35(6):64-65．
[6]田新平．培养基污染防治方法研究［J］．现代农业科技，2010(13):11-13．
[7]程逸宇，郑建秋，迟卉，等．植物组织培养中真菌污染防治方法研究［J］．贵州科学，2006(9):40-42．
论文作者:何文杰
论文发表刊物:《科学与技术》2019年20期
论文发表时间:2020/4/17
标签：植物论文; 细菌论文; 材料论文; 培养基论文; 真菌论文; 组织论文; 操作论文; 《科学与技术》2019年20期论文;