贵阳中医学院第一附属医院神经外科 贵州 贵阳 550001
基金项目：
贵州省卫生计生委科技基金，gzwjkj2015-1-059
贵州省科技厅联合基金，黔科合LH字[2015]7281
贵阳市科技计划项目[项目编号：筑科合同20141001(24)号]
贵阳市高层次创新型青年卫生人才基金项目(2013筑卫科技合同字创9号)
【摘要】目的 探讨水通道蛋白-4（AQP-4）、C-反应蛋白（CRP）及血管内皮生长因子（VEGF）在大鼠脑出血后的表达与炎症反应的相关性。方法将90只健康大鼠分为实验组72只。对照组18只。实验组72只，采用自体血制作尾状核脑出血模型，观察大鼠术后行为变化，分别在术后6h、24h、48h、3d、7d及14d处死动物。对照组18只，采用相同方法注入等量生理盐水。HE染色观察组织病理变化，ELISA法检测血清CRP、VEGF表达，免疫组织化学方法检测AQP-4蛋白的表达。结果 实验组Longa评分6h及14d高于对照组(P＜0.05)，24h、48h、3d及7d评分明显高于对照组(P＜0.01)。AQP-4、CRP在6h即升高，24h、48h、3d、7d明显升高，VEGF的表达随出血时间的延长而增加，3d明显增高，7d达高峰，对照组：术后CRP、VEGF无明显增高，AQP-4术后3d内升高，7d、 14d升高不明显，差异具有显著意义(P＜0.01)。结论 脑出血后AQP-4、CRP、VEGF呈现过度表达，其动态变化与炎症反应的相关性具有正相关性。推没三者以不同的方式参与脑出血后损伤修复的炎症反应。
Study on Correlation of AQP-4, CRP and VEGF Expression with Inflammatory Response in Rats after Intracranial Hemorrhage
Zhang Bo；Wu Huajun；Zhong Zhijun；et al
Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine (Guiyang, Guizhou) 550001
【Abstract】 Objective To investigate the correlation of aquaporin-4 (AQP-4), C-reactive protein (CRP) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression with infammatory response in rats after intracranial hemorrhage (ICH). Methods A total of 90 healthy rats were divided into treatment group (72 rats) and control group (18 rats). Seventy-two rats in the treatment group used the autologous blood to make the caudatum ICH model in order to investigate postoperative behavioral changes of rats. Those animals were executed at 6h, 24h, 48h, 3d and 7d, respectively after operation. Eighteen rats in the control group were infused the equivalent normal saline (NS) using the same method. Pathological changes of tissues were observed by HE staining; serum CRP and VEGF expression was tested by ELISA; and AQP-4 protein exression was tested by immunohistochemistry. Results Longa scores at 6h and 14d in the treatment group were higher than those of control group (P＜0.05), significantly higher at 24h, 48h, 3d and 7d than those of control group (P＜0.01). AQP-4 and CRP were rising at 6h, particularly significant at 24h, 48h, 3d and 7d. VEGF expression was increased along with prolonged bleeding time (BT)，particularly significant at 3d and reached the peak at 7d. Postoperative CRP and VEGF were not significantly increased in the control group. AQP-4 was increased within 3d after operation，not particularly significant at 7d and 14d. The difference has statistical significance (P＜0.01). Conclusion AQP-4, CRP and VEGF overexpression is shown after intracranial hemorrhage. The dynamic changes and inflammatory response are positively correlated. It is speculated that those three factors have participated in the inflammatory response of wound repair after intracranial hemorrhage in different approaches.
关键词：脑出血；水通道蛋白-4；C-反应蛋白；血管内皮细胞生长因子；炎症反应
【中图分类号】R458.3【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0344-02
欧洲卒中组织（ESO）2014年发布的《自发性脑出血诊疗指南》及美国心脏病协会/美国卒中协会（AHA/ASA）2015年发布的《自发性脑出血最新诊疗指南》示在世界范围内，自发性、非创伤性脑出血(ICH)仍然是致死、致残的重要原因[1-3]。对于该病的治疗方法及治疗效果一直是神经内外科研究的重要课题 [1]。除血肿本身的占位效应诱发脑疝引起死亡外，即使通过及时止血、降低颅内压、控制血压、通窍醒脑、神经保护、清除自由基等内科治疗和清除血肿、去除骨瓣减压等各种外科治疗。其死残率仍居高不下,2015年国家卫生计生委脑卒中防治工程委员会发布的《中国脑出血诊疗指导规范》示ICH1个月内死亡率高达35%-52%, 6个月末仍有80%左右的存活患者遗留残疾,自发性ICH，约占所有ICH的80%-85%。主要原因与脑出血后血肿压迫周围脑组织，引起血液循环障碍、血脑屏障受损、细胞代谢紊乱，及血肿分解产物所释放多种活性物质及有害物质等，对脑组织产生的继发性损伤是导致死亡和残疾的主要病理机制。AQP-4为水在脑组织内流动提供关键通道，是反应脑水肿的主要指标[6]，在脑出血中的作用是参与水盐代谢、分布和渗透压的调节[7]；CRP是一种主要由肝脏产生的急性时相蛋白，是重要的炎症反应物及标志物。与脑出血后血肿扩大及神经功能恶化显著相关[8]；VEGF是一种血管形成和改变血管通透性的诱导因子具有保护神经元、营养神经细胞、促进新生血管形成等作用[9]。本试验通过对AQP-4、CRP及VEGF在脑出血后的表达进行动态研究，探讨AQP-4、CRP及VEGF在大鼠脑出血后出血灶周围区的表达与炎症反应相关性。
材料与方法
1.1实验动物
清洁、健康的Wistar大鼠90只，由贵阳医学院动物实验研究中心提供，周龄为22周左右大鼠，体重284.7±7.3g。将大鼠分为实验组（脑出血组）及对照组(假脑出血组)。实验组72只，共6组，每组12只；对照组18只，共6组，每组3只。
1.2主要药品和试剂
兔抗大鼠多克隆AQP-4抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，CRP试剂(美国rndsystems(RD)公司分装)，VEGF试剂(美国rndsystems(RD)公司分装)，免疫染色一抗稀释液（南京碧云天试剂公司），免疫染色二抗稀释液（南京碧云天试剂公司），水合氯醛(武汉市和昌化工有限公司)。
1.3主要仪器与器械
68025型鼠专用立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，LEICA RM2235切片机，LEICA HI1220摊片机，LEICA HI1210烤片机，LEICA ASP300脱水机，LEICA EG1150H包埋机,电热恒温培养箱，医用图像分析管理系统，Olympus显微镜，NL1-9602酶标仪(北京恒奥德仪器仪表有限公司)，微电钻，微量注射器。
２.实验方法
2.1对照组予用灭菌空针按300mg/kg 抽取10%水合氯醛行腹腔内麻醉、麻醉生效后，将大鼠俯卧置于专用立体定位仪手术台上，固定头部，调节门齿托的高度，保持呼吸道通畅，使大鼠的前后囱处于同一水平。于右腹股沟区用理发器剪除毛发，常规消毒，切开约1cm，钝性分离腹股沟区组织，找到股动脉，用肝素抗凝过的空针抽0.5ml动脉血，并轻轻摇匀，防止血液凝固，备用。切口处1号线间断缝合，并再次消毒。用理发器剪除头顶部毛发后，常规消毒，在中线处作1cm左右直切口，分离皮肤及皮下组织，暴露前囟点，取前囟点右侧中线旁开3mm、前1mm，用自制微钻头钻孔，钻透颅骨至硬脑膜处，停止钻孔，骨孔大小约1.5mm，用50μl微量注射器垂直从颅骨小孔进入,深度为颅骨下5.5mm (即尾壳核位置)，缓慢注入生理盐水20μl，注射针停留2min后，再缓慢注入生理盐水30μl，注射针再次停留10min后，缓慢退出，用骨腊封闭骨孔后，缝合大鼠头皮。形成假脑出血模型。实验组运用相同方法对大鼠麻醉、备皮、钻孔，缓慢注入自体血20μl，注射针停留2min后，再缓慢注入自体血30μl，注射针再次停留10min后，缓慢退出，用骨腊封闭骨孔后，缝合大鼠头皮。建立大鼠脑出血模型。
2.2行为学观察。手术过程中观察大鼠的呼吸、心率变化。手术中及术后6h内死亡的大鼠不记入本组实验。待麻醉作用消失后，观察大鼠行动变化。如：爬行步态、进食情况、翻正反射及对周围环境的反应，并采用足印迹试验评价其行为能力：用纸板折成等三边形周长90cm,长120cm，中空的三角体。水平放置，底内面放置白纸。将4足沾有印油的大鼠从三角体一头放入，在另一头用食物引诱，使其从内通过。根据大鼠爬行的足印行神经学评分。足印较对称（1分）；足印部分对称（2分）；足印不对称（3分）；足印一侧不明（4分）；两侧足印不明（5分）；正常大鼠为1～2分，分数越高脑出血后症状越重。
2.3实验组和对照组分别于手术后6h、24h、48h、3d、7d及14d从大鼠的心脏取血备血清。方法为从前胸剪开胸壁，9号粗针头于左心室插入，针尖升至主动脉，用止血钳钳夹固定针头，剪开右心房。快速灌注生理盐水(常温)150ml～200ml,待肝脏变白，血液颜色变清后,灌注4％多聚甲醛（4℃）400ml左右。先快后慢，待肝脏和肢体变硬，变苍白后停止灌注。立即处死，断头，解剖取脑，取血周围组织制作解剖切片。
2.4采用ELISA法,严格按说明书使用及操作，对实验组和对照组不同时期血清中CRP、VEGF的检测。
2.5 AQP-4免疫组化染色: 严格按说明书使用及操作，对实验组和对照组不同时期免疫组化；每组取4张切片，随机选取6个不相同观察视野，应用Image-pro Plus 6.0图像分析软件进行统计分析。
2.6统计学分析
应用SPSS17.0统计软件行资料分析，正态分布数据用均数±标准差()表示，组间各参数指标均数，采用两样本t检验， P≤0.05差异有统计学意义，P＜0.01差异显著。
3.结果
3.1大体解剖形态观察：模型成功后6h，解剖大鼠脑组织进行大体形态学观察，见血肿边界清楚，形态较规则，呈椭圆形，有明显占位效应。
3.2神经功能评价：脑出血术后6h，进行神经功能评价，脑出血大鼠均不同程度表现出神志较差、饮食困难、对侧前肢小能伸直、同侧“划圈样”行走现象、左侧后肢收缩延退。足印迹试验：对照组与一组（实验组术前）足印基本对称，足印较一致，为便于统计，将对照组全部18只归为一组，统为对照；2组、3组（6h组、24h组）足印不对称、一侧不明现象；4组、5组（48h组、3d组）足印更不对称、足印间距不一致，一侧不明现象更加明显，可见双侧不明现象；6组、7组（7d组、14d组）足印紊乱、不对称，足印间距不一致，一侧不明或双侧不明现象；足印迹试验评分表示实验组从6h组到14d组其评分明显高于对照组，而实验组3d及7d其评分最高。
3.3 ELISA法检测大鼠实验组CRP、VEGF含量在与对照组比较不同时间段均出现升高，24h、48h、3d及7d明显升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.001)，CRP、VEGF含量动态变化进行相关性检验，发病第3d二者血浆中含量呈正相关(P＜0.01)，疾病全过程仍具有相关性(P＜0.05),详见表1。
4.讨论
ICH病情急、变化快、预后差，已成为全人类残疾和死亡的一个重要疾病[10]。其病理生理为血肿压迫周围组织，影响血液循环系统，进而激活纤溶酶原激活物、凝血酶等，引起脑组织炎症反应及血脑屏障破坏，导致诱导血管源性脑水肿形成。并在3d～7d内达到高峰。之后，血脑屏障破坏，炎症反应诱导神经细胞破坏及红细胞溶解，使红细胞内血红蛋白及其衍生物释放。引起细胞毒性脑水肿。再加上基质金属蛋白酶、白介素及其他损伤产物持续增加，维持细胞毒性及血管源水肿[11]。但以血管源性水肿为主[12]。另一方面，ICH后直接导致中枢神经受损，使机体产生应激反应，激活机体内各种应激因子，诱发炎症反应在脑出血继发性脑损伤中起着十分重要的作用，也是活体组织对损伤因子所产生的防御和炎症反应[13]。目前，ICH后脑缺血、炎症反应的研究己成为脑出血后病理损伤机制的研究热点。AQP-在生理和病理状况下，脑组织中的AQP-4在调节中枢性渗透压、形成及消除脑水肿、维持体内液体平衡等方面具有重要作用[14]。Tang等将小鼠的纹状体注射自体全血以建立脑出血动物模型后,敲除AQP-4基因,小鼠神经功能缺失程度、血肿周围脑组织含水量、伊文思蓝渗出量、毛细血管超微结构损害程度均高于AQP-4未敲除组，因此其认为给予上调AQP-4表达的药物将有利于脑出血后脑水肿的消退[15]。本组实验显示，血肿周围脑组织中AQP-4的表达在24h内就出现升高，在3d～7d达到最高，ICH脑组织中AQP-4的表达与对照组相比具有统计学差异(P＜0.05)，而48h、3d及7d差异具有显著统计学差异(P＜0.01)。AQP-4的增加可促进IL-6和TNF-a等细胞因子释放，促进肝脏分泌CRP。CRP通常作为独特的炎性标记物来检测，也是脑部血管疾病的相关性因素。CRP经其受体活化后通过直接浸润、聚集或间接作用造成细胞损伤。
此外CRP水平增高，一方面可以导致血小板的凝集和释放功能异常，从而影响
止血和凝血过程，产生的血肿对周围脑组织及微血管的压迫，使局部脑血流量进一步下降[16]，另一方面，CRP的过度增加，再加上组织损伤时，体内炎性反应系统会被激活，CRP可通过经典途径激活补体系统，产生大量终末产物，损伤脑血管内膜，从而加重脑水肿，炎症加重，又进一步加重脑水肿，从而出现神经功能恶化[6、17]，Mario等在研究中指出:C反应蛋白升高的可能机制为机体在脑出血后的非特异性炎症反应。尽管早期C反应蛋白位置在缺血性和出血性损伤均出现，但是高密度弥漫性神经纤维网染色物只出现在自发性脑内出血病人体内并且在接近出血部位时尤其明显。提示血浆C反应蛋白的产生在自发性脑内出血后48小时到72小时期间明显上升并且与其预后相关。Di Napoli等[16]研究认为，CRP除了引起IL-6等炎症特质增加，还可活化的小胶质细胞和补体c3,直接引起血脑屏障破坏和脑水肿的形成[18],本实验数据显示，血清CRP的表达在6h升高，在3d达到最高值，第7d开始降低，与对照组相比差异具有显著统计学意义(P＜0.001)。CRP可刺激血管内皮细胞促进内皮素(ET)及白细胞介素-6（IL-6）的释放[8、19]还可使内皮细胞一氧化氮合酶（NOS）mRNA的稳定性降低，致使内皮细胞NOS表达的下降，从而诱发VEGF增加。另外，急性脑水肿时，CRP与其他炎性因子协同作用使脑血管痉挛加重，血肿周围局部脑血流量显著下降，严重缺氧缺血，诱导VEGF增多[20]。相关研究[9]表明，在生理性和病理条件下，缺氧诱导内皮细胞有丝分裂原、血管渗透因子和VEGF在脑血管新生的调节过程中起关键作用。本实验数据显示在术后第6h开始升高，3d～7d维持在高水平，7d后开始下降，其表达水平与脑出血引起的病情严重程度一致。通过本实验发现，AQP-4、CRP、VEGF的水平在各个不同时间段与对照组比较均升高，24h、36h、48h升高较明显,差异据有统计学意义(P＜0.05)，以后逐渐回落，AQP-4、CRP到第14d仍高于对照组。对Longa评分与AQP-4、CRP、VEGF含量动态变化进行相关性检验，发病48h、3d显著相关(P＜0.01)，6h、24h、7d及14d具有相关性(P＜0.05)。
综上所述， AQP-4、CRP及VEGF升高，参与了脑出血后炎症反应的病理生理过程；其动态变化与大鼠脑出血后行为变化、炎症反应具有正相关性。推测三者参与了脑出血反炎症的形成与消退。
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论文作者:张波 伍海军 钟志军 杨华 钱朝智 王盛 潘政 陈永顺
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/11/2
标签：脑出血论文; 实验组论文; 足印论文; 大鼠论文; 炎症论文; 对照组论文; 血肿论文; 《中国医院药学杂志》2016年9月论文;