杨美雅
（温州医科大学附属第三医院<瑞安市人民医院> 325200）
【摘要】目的：研究薯蓣皂苷（Dioscin，Dio）抑制人结肠癌细胞增殖的作用及机制。方法：采用人结直肠癌细胞SW480、SW620、RKO和Caco-2，MTT和集落克隆实验分析Dio对细胞生长、增殖的影响；流式细胞术检测Dio干预对细胞凋亡的影响，Western blot法检测Dio干预后细胞凋亡执行蛋白表达的变化。结果：与空白对照组相比，Dio呈剂量依赖抑制人结直肠癌细胞SW480、SW620、RKO和Caco-2的生长，IC50剂量干预细胞显著减少克隆数；IC50剂量的Dio干预24h，SW620和RKO细胞凋亡率分别由8.3%±4.2%、10.7%±6.4%上升至62.6%±6.3%和53.2%±7.5%，凋亡执行蛋白cleaved caspase3和cleaved PARP表达显著上调。结论：Dio具有抑制结直肠癌细胞增殖的作用效应，诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一。
【关键词】薯蓣皂苷；结直肠癌；增殖；凋亡
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）13-0099-03
结直肠癌（Colorectal Carcinoma，CRC）居我国恶性肿瘤发病率的第四位，且新发病例逐年显著增加[1]。因多数患者确诊时已处于中晚期，手术治疗已无法彻底清除病灶，放化疗仍是结直肠癌主要的治疗手段；但当前化疗方案存在客观反应率低、疗效差、毒副反应严重等问题[2，3]。因此，从传统药材提取寻找高效低毒的活性成分杀伤结肠癌细胞以改善患者的预后具有重要意义。
薯蓣皂苷（Dioscin，Dio）是甾体总皂苷的一种，提取自薯蓣科植物（Dioscorea polystachya Turcz.）[4]。中医学认为薯蓣科植物具有“活血舒筋、消食利水、祛痰和截疟”等功效[5]。研究发现其活性成分Dio具有抗肿瘤、改善心血管功能、调节免疫、降血脂等多种药理作用[4]。本研究以体外培养的人结肠癌细胞为研究对象，观察Dio对细胞生长的影响，并分析Dio干预对肿瘤细胞凋亡和凋亡执行蛋白cleaved caspase3和cleaved PARP表达的影响，探讨Dio抑制人结肠癌细胞增殖的作用及机制。
1.材料
1.1 药物和细胞株
薯蓣皂苷购自成都曼思特生物科技有限公司（纯度≥98%）；用DMSO配成50mmol?L-1的母液，-20℃保存，应用时用培养液稀释至目标浓度。人结直肠癌细胞株SW480、SW620、RKO和Caco-2购自中国科学院细胞库。
1.2 试剂
胎牛血清、高糖DMEM培养液、0.25%胰酶-0.02%EDTA购自Gibco公司；噻唑蓝（MTT）购自Amersco公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自BD Pharmingen公司；兔抗人cleaved-caspase3、cleaved-PARP和GAPDH多克隆抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体均购自为Cell Signaling Technology公司产品；ECL化学发光试剂购自BIO-RAD公司。
1.3 主要仪器
细胞培养箱（Thermo公司），iMARK酶标仪（Bio-Rad公司），Canto II流式细胞仪（BD公司），垂直电泳及蛋白转膜装置（BIO-RAD公司），凝胶成像系统（BIO-RAD公司）。
2.实验方法
2.1细胞培养
SW480、SW620、RKO和Caco-2细胞以含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养液， 培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。
2.2 MTT分析Dio的细胞毒作用
细胞按每孔1×104个接种于96孔培养板，细胞贴壁后弃去上清，加入100μL含0.5、1、2.5、5、7.5和10μmol?L-1 Dio的含药培养液，每组设3个复孔，空白对照组加入等体积的完全培养液。药物作用24h，MTT法分析Dio对细胞增殖的影响，酶标仪测定各孔490nm处吸光度值（A），计算细胞存活率（%）和半数抑制浓度（IC50），实验重复3次。IC50分析软件计算Dio对不同细胞的IC50。
2.3 集落克隆
SW620和RKO细胞以每孔2×104个细胞接种于6孔板。细胞贴壁后，实验组加入IC50浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液，置于细胞培养箱中培养7d；4%多聚甲醛溶液固定细胞，0.1%结晶紫染色10min，观察各组细胞集落形成的情况。
2.4 流式细胞术检测凋亡率
SW620和RKO细胞以每孔3×105个细胞接种于6孔板。细胞贴壁后，实验组加入IC50浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液，Dio作用24h后收集各组细胞，PBS洗涤2次，1×结合缓冲液重悬细胞。取100μL细胞悬液加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀，室温避光孵育15min，再加入400μL 1×结合缓冲液，上机检测细胞凋亡情况。
2.5 Western-Blot法检测凋亡执行蛋白的表达
细胞培养及药物处理同2.4。抽提Dio作用24h的各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。取各实验组50μg蛋白行PAGE-SDS电泳，300mA恒流电转移至PVDF膜。10%脱脂奶粉溶液封闭1h，多克隆抗cleaved capase3（1:1000）、cleaved PARP（1:1000）和GAPDH（1:1000）抗体室温作用2h，TBST缓冲液洗膜3次，HRP标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1h，TBST缓冲液洗膜。滴加ECL发光试剂于凝胶成像系统内曝光，分析目的蛋白的表达。
2.6 数据分析
采用SPSS20.0统计软件包分析实验数据，各组数据采用x-±s表示。采用t检验对数据进行统计学分析。
3.结果
3.1 Dio抑制结直肠癌细胞的增殖
结果如Fig 1所示，Dio作用24h，明显抑制SW480、SW620、RKO和Caco-2细胞的增殖，呈剂量依赖关系，2.5、5、7.5和10μM组细胞存活率与空白对照组比相比均有统计学差异（P<0.05）；半数抑制浓度（IC50）如Tab 1所示。
Fig1 Effect of Dio with various concentrations on proliferation of colorectal cancer cells.
Tab1 Dio inhibit colorectal cancer cells IC50 concentrations.
SW480SW620RKOCaco-2
IC50（μM）4.0 3.7 3.9 3.8
3.2 Dio抑制结直肠癌细胞的集落克隆形成
IC50浓度的Dio作用7d，显著抑制结直肠癌SW480、SW620、RKO和Caco-2细胞集落克隆的形成，结果如Fig2所示。
Fig2 Effect of Dio with IC50 concentration on colony formation of colorectal cancer cells.
3.3 Dio诱导结直肠癌细胞发生凋亡
IC50浓度的Dio作用24h，SW620和RKO细胞凋亡率（含早期凋亡和晚期凋亡）分布为62.6%±6.3%和53.2%±7.5%，与空白对照组（8.3%±4.2%和10.7%±6.4%）相比显著上升（P<0.05），如Fig 3所示。
Fig3 Dio induces apoptosis in SW620 and RKO cells by Flow cytometric analysis.
3.4 Dio促进结直肠癌细胞凋亡相关蛋白的表达
Western Blot实验检测细胞表达凋亡相关蛋白的情况，Dio干预24h后SW620和RKO细胞caspase3和PARP剪切活化片段cleaved caspase3和cleaved PARP表达明显增加，如Fig 4所示。
Fig4 Expression of apoptosis related factors cleaved caspase3 and cleaved PARP in SW620 and RKO cells treated with Dio.
4.讨论
薯蓣皂苷（Dioscin，Dio）是一种天然的甾体类化合物，由于甾体类药物独特的临床疗效，深入研究薯蓣皂苷的药理作用具有广阔的临床转化应用前景。Dio主要存在于薯蓣科、百合科、石竹科和蔷薇科等植物中，其中以薯蓣科中的含量最为丰富，如穿龙薯蓣（Dioscorea nipponica Makino）、盾叶薯蓣（D. Zingiberensis C.H.Wright）等。近年来随着对薯蓣皂苷研究的深入，发现Dio具有抗肿瘤、改善心血管功能、调节免疫、降血脂等多种药理作用[4]。
研究发现，薯蓣皂苷可以通过抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、调控细胞周期进程等途径发挥抗肿瘤作用[6-8]。目前，未见研究报道Dio具有抗结直肠癌的生物活性，我们以人结直肠癌为研究对象，通过体外活性评价证实Dio在体外具有良好的抗结直肠癌细胞增殖的活性，对不同结直肠癌细胞的IC50在3.7～4.0μM之间。
我们发现，Dio干预24h后实验组细胞凋亡率和凋亡相关蛋白cleaved caspase3和cleaved PARP表达水平均显著增高，提示Dio的抗结直肠癌活性与诱导细胞凋亡相关。在凋亡信息传递途径中，caspase3处于信号通路的枢纽位置，起到整合执行凋亡信号的作用。caspase3以酶原形式存在于细胞内，当被上游活化形式的caspase8、caspase9剪切形成17kD/19kD二聚体时才具有生物学活性，进而剪切底物PARP、caspase6、DNA裂解因子（DFF）等促进细胞凋亡的发生[9,10]。Cleaved caspase3对底物PARP的剪切，使PARP丧失聚ADP核糖化作用修复损伤DNA的功能，受PARP负调控的核酸内切酶活性增高，降解核小体DNA引起凋亡[11]。我们发现，cleaved caspase3和cleaved PARP表达水平均显著增高，提示Dio诱导结直肠癌细胞凋亡可能是caspase凋亡途径依赖性的。细胞凋亡可由死亡受体途径、线粒体途径和内质网应激激发[12,13]，Dio诱导结直肠癌细胞凋亡是通过何种途径引起的有待进一步研究。
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论文作者:杨美雅
论文发表刊物:《心理医生》2015年13期供稿
论文发表时间:2016/4/29
标签：细胞论文; 薯蓣论文; 凋亡论文; 培养液论文; 结直肠癌论文; 作用论文; 抑制论文; 《心理医生》2015年13期供稿论文;