湖南省怀化市第二人民医院 418000
摘要：目的：建立了同时测定淫羊藿药材中主要黄酮类成分（淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C）的反相高效液相色谱法。方法：淫羊藿样品经超声提取，采用HPLC法，乙腈-水梯度洗脱；检测波长：270nm；流速：1ml/min；柱温：25℃；柱型号：Agilent ZORBAX-XDB C18（4.6mm×250mm，5?m）；结果：四种黄酮成分的标准曲线在6.5-33.0mg/l（朝藿定A，淫羊藿苷）或6.6-55.0mg/l（朝藿定B，朝藿定C）范围内呈良好线性关系（r》0.9999）加样回收率在97%-102%之间，相对标准偏差小于2%（n=5）测得不同品种淫羊藿中广泛存在朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷4种主要黄酮成分，其含量有一定差异。结论：本方法在淫羊藿药材的质量评价中有一定的参考价值。
关键词：淫羊藿，高效液相色谱，梯度洗脱，淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C
材料与方法
1.实验仪器与材料
1.1 实验仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器，四元泵，在线脱气机，紫外检测器，柱温箱，化学工作站等 美国Agilent公司）；HS10260D型超声仪；METTLER TOLEDO AT201型电子天平。
1.2 实验材料 淫羊藿药材及来源：朝鲜淫羊藿，黔岭淫羊藿，巫山淫羊藿，柔毛淫羊藿：分别采自辽宁，贵州，四川，重庆，陕西等地。对照品：朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C（石家庄以岭医药研究院提供，经HPLC-ELSD面积归一化法证明纯度均在98%以上），淫羊藿苷（批号：110737-200414，中国药品生物制品检定所）
乙腈：色谱纯（fisher）；纯化水
乙醇：分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）
2.实验方法
2.1 色谱条件
将淫羊藿供试品溶液进行HPLC系统适应性考察，确定了最终的淫羊藿指纹图谱条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX-XDB C18（4.6mm×250mm，5?m）；
流动相：乙腈-水（梯度洗脱程序见表1）；
流速：1.0 ml/min；
柱温：25℃；
检测波长：270nm；
理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于6000；
2.2 对照品溶液制备
分别精密称取朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C对照品适量，加甲醇制成浓度为0.07 mg/ml的对照品溶液；精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.1 mg/ml的溶液，即得。
2.3 供试品溶液制备[1]
取巫山淫羊藿叶片粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声处理1小时，放置冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
2.4 方法学考察[6-7]
2.4.1标准曲线与线性范围
以50%乙醇溶液为溶剂，精密配制朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C与淫羊藿苷溶度为6.6，11.0，22.0，33.0，44.0，55.0mg/l的系列标准溶液，并按照2.1中的色谱条件进行HPLC分析，以峰面积Y对样品溶度X进行线性回归，得标准工作曲线，见下表。可知，4种黄酮类成分在一定浓度范围内均呈良好的线性，相关系数都在0.99以上。
表一回归方程与线性范围
2.4.1 稳定性实验
取供试品溶液分别于0，2，4，8，12，24h时间点检测，照“2.1”项下色谱条件进样20μl，记录各色谱峰保留时间和积分面积，以淫羊藿苷的积分面积和保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间（α）和相对积分面积（RA）。
图谱的相似度分别为0.992，0.998，0.996，0.998，0.998，0.999；同时显示α、RA相当一致，RSD%均小于3%，表明仪器精密度良好。
2.4.4 加样回收率
2.5 样品测定
取各品种淫羊藿药材照‘2.3’项下制备样品溶液，取样品溶液和标准品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。（见图2.3.4.5）
实验结果
1．淫羊藿药材指纹图谱特征[8]
根据图2.3.4.5进行分析，淫羊藿药材的HPLC图谱主要由3组色谱峰构成。第一组峰，保留时间小于15min，该组峰多有溶剂峰干扰，特征性不强。第二组峰，20mim与26min之间，以朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷为主构成，简称为“ABI组峰”，一些样品中会出现未知峰，其中朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷峰是淫羊藿中所含的最主要的淫羊藿苷类成分，因此本组峰是最重要的一组峰，各峰的构成和相对强弱在种内常较稳定，因此具有特征性。第三组，大于42min小于60min，以箭藿苷B和宝藿苷I为主峰，简称“SB组峰”，一般还包括其它未知峰，这组峰也比较普遍存在，但是峰的高低在各物种的种内常有较大变异，也较少有特征性。
2． 4个不同品种的淫羊藿药材特征指纹峰分析
2.1 朝鲜淫羊藿 所有朝鲜淫羊藿样品均具有明显的未知峰5，6，7，而这几个峰在已研究的淫羊藿属其它种类都没有，属于朝鲜淫羊藿的独有特征峰，具有重要的鉴别意义。例外“ABCI组峰”的特点是：峰3最低，峰4最高，峰1与其他物种相比相对峰高较高。
2.2 黔岭淫羊藿 黔岭淫羊藿样品HPLC图谱在“ABCI组峰”和“SB组峰”的位置均无明显的色谱峰，峰形较低，不予药用，在淫羊藿属植物中，具有该种类型的还有多个物种，因此不具有鉴别特征性。
2.3 巫山淫羊藿 巫山淫羊藿“ABCI组峰”具有显著特点：峰1，2，4，5都较低，且差距不大，峰3最高，与其他物种相比相对峰高也很高。
2.4 柔毛淫羊藿 淫羊藿“ABCI组峰”的特点是峰4最高，峰1，2，3普遍较高，说明其有效成分含量稳定，具较好药用价值。
2.5 质量评价 由图谱看出，柔毛淫羊藿中的淫羊藿苷含量最高，其他依次是朝鲜淫羊藿、巫山淫羊藿和黔岭淫羊藿。另外，从这4种淫羊藿属药材指纹图谱来看，其他成分含量各异，因目前尚无认定其他成分中的哪一种或几种为药用有效成分，无法以有关成分高低来对该四种淫羊藿质量进行评估，但是，其指纹图谱对未来开发淫羊藿中潜在的活性成分提供了数据。
3． 巫山淫羊藿指纹图谱相似度计算及分析
本实验主要针对巫山淫羊藿进行了研究，参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，具体以不同产地的10批巫山淫羊藿药材为例，进行相似度评价如下：
指纹图谱的建立及对照指纹图谱的生成 取10批巫山淫羊藿药材（药材来源见表8）按样品处理方法处理，取供试品溶液分别进样20ul，采集液相数据，得到10批药材的指纹图谱，在实验条件下，淫羊藿药材各批样品（S1-S10）有较好的峰形和一致性。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（药典委员会提供）软件进行评价，将试验图谱导入软件，设定参照图谱，自动匹配，用平均值法生成对照指纹图谱，见图6。
再用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度计算，结果见表9，由表中数据可知各批药材与标准对照图谱的相似度都在0.9以上，符合规定。
附图，附表
图6 10批淫羊藿药材指纹色谱图（巫山淫羊藿）
讨 论
1.淫羊藿中有效成分的提取
煎煮过程中朝藿定A，朝藿定C等成分易发生水解，生成相应次苷，而且淫羊藿的主要有效成分在有机溶剂中溶解度大，因此可以用有机溶剂进行提取。所用有机溶剂主要有甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇等，其中以乙醇用的最多，这是因为乙醇价格便宜，毒性很小，可回收利用，并且乙醇提取液不易发霉变质，乙醇提取方法参考《中国药典》2005版一部淫羊藿项下要求确定。
2.本实验在系统适应性考察中比较了以下几个方面：不同检测波长270nm，254nm，360nm。在270nm处指纹图谱反映的信息量较为丰富，且峰强度较大，故选择270nm作为测定波长。不同柱温20℃，25℃，30℃对分离效果无明显差异，考虑到较高温度对色谱柱使用寿命的影响，故选择25℃。选择了不同色谱柱型号，结果Agilent ZORBAX-XDB C18（4.6mm×250mm，5?m）色谱柱对样品的分离效果最好。对三种不同流动相系统（乙腈-水，甲醇-乙腈-水，甲醇-水）进行了考察，结果表明甲醇-水系统不能将淫羊藿黄酮峰完全分离，乙腈-水条件下反映的信息丰富，且分离度好，因此选择乙腈-水作为流动相。
3.中药指纹图谱相似度评价意义
研究者在中药指纹图谱质量稳定性的评判中，提出了相似度的概念，并总结出一整套计算方法，这使中药色谱指纹图谱作为质量标准有了科学公正的量化评判方法，而且也使中药色谱指纹图谱控制质量有了坚实的现实基础，即承认批间图谱存在差异，尽量缩小差异，使其稳定性控制在一定范围内。
由于淫羊藿品种繁多，种间差异较大，而药材形态难于鉴别，已严重影响到新药的开发和药材的质量控制。05版《中国药典》收载就有5个品种，本实验参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，对几种淫羊藿药材进行了指纹图谱研究，建立了几种淫羊藿药材的对照指纹图谱，进行了相似度分析，为鉴别及有效控制药材质量提供了可靠的依据。
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论文作者:龚厚军
论文发表刊物:《健康世界》2015年13期供稿
论文发表时间:2015/11/16
标签：淫羊藿论文; 图谱论文; 指纹论文; 药材论文; 色谱论文; 巫山论文; 溶液论文; 《健康世界》2015年13期供稿论文;