师尚礼[1]2005年在《甘肃寒旱区苜蓿根瘤菌促生能力影响因子分析及高效促生菌株筛选研究》文中研究说明提高紫花苜蓿(Medicago sativa L.)产量及质量最重要的方法之一是给苜蓿接种高效固氮根瘤菌,苜蓿根瘤菌除与根系共生结瘤进行固氮之外,是否具有其它生物功能和作用目前尚未见报道。随着联合固氮微生物研究的深入,促生菌研究已从固氮范畴扩展到固氮、溶磷和分泌生长激素等多功能范畴(Hendry GS 1983),共生固氮微生物—根瘤菌是非常重要的一类促生菌,按照促生微生物存在多功能促进生长的特点,开辟根瘤菌其它促生功能的研究,进一步研究根瘤菌的促生机理和影响根瘤菌结瘤与促生功能影响因子,筛选优质高效多功能促生根瘤菌株尤为重要。本研究对甘肃5个不同生态区域阿尔冈金苜蓿(M. Algonquin)和陇东苜蓿(M. Longdong)草地春、夏、秋叁季根瘤菌结瘤能力及其影响因子进行大系统多层次权重分析,采用YMA培养基法、回接初筛选试验法、~(15)N同位素稀释法、蒙金娜培养基和PKO培养基溶磷圈法、刚果红液体培养基比色法、YMA培养基附加胁迫因子培养法对根瘤菌进行了分离纯化和筛选,对初筛选菌株的固氮能力、溶磷能力、分泌生长素IAA能力和抗逆能力进行了测试,采用多元逐步回归和通径分析讨论了影响根瘤菌固氮、溶磷、分泌生长素、抗逆能力的主要土壤理化因子,结果表明:1)研究区域大部分属干旱半干旱地区,不论是旱作区的长期干旱,还是灌溉区的间隙性干旱,水分因子对根瘤菌结瘤数量造成较大影响,进而影响固氮量,表现出干旱地区苜蓿草地的干旱胁迫缺氮。2)供试的两个苜蓿品种,阿尔冈金苜蓿根瘤菌的有效性(结瘤能力)高于陇东苜蓿。并且在甘肃区域苜蓿结瘤主要发生于春季,春季苜蓿根瘤菌的有效性比夏季和秋季高。这一研究结果为甘肃苜蓿栽培应用根瘤菌剂最佳施用时期提供了依据。3)综合考虑各项根瘤测定指标,苜蓿根瘤菌在不同区域土类中的有效性以庆阳黑垆土最好,其次为武威灌淤土和定西灰钙土。甘南亚高山草甸土区,根瘤较大,但数量最少,根瘤菌的有效性不高,气温低和生长季节短是主要的限制性因素。天水褐土根瘤菌有效性差,与该土粘重、易板结、通气性差有关。4)不同区域苜蓿根瘤菌平均固氮能力差异性较大。庆阳、武威菌株平均固氮能力最强,定西菌株次之。菌株对生物量平均作用的大小与来源地区菌株固氮能力的强弱相对应,亦即庆阳、武威和定西菌株对苜蓿的平均促生能力较好,甘南菌株平均促生能力中等,天水菌株平均促生能力差。5)~(15)N示踪试验表明,苜蓿%~(15)N含量在0.425 %以下时,苜蓿% ~(15)N含量与固
钟文文, 张小平, Kristina, Lindstrom[2]2006年在《高效苜蓿根瘤菌的筛选》文中认为旨在利用celB基因标记技术从土着根瘤菌中筛选出与盛世苜蓿品种相匹配的有效性高、竞争性强的高效苜蓿根瘤菌株。从四川雅安、重庆北碚、万州采集野生苜蓿根瘤,采用平板划线法分离纯化获得93株纯菌株,通过与盛世品种在无氮水培液中进行结瘤试验和有效性分析并结合菌株的地理来源,初筛出了与对照相比有效性较高的4株苜蓿根瘤菌,分别为Y6-1-1、BB1-8-1-1、BB2-2-1-1和WZ-6-2-2。进一步利用celB基因标记技术对这4株菌进行竞争性研究,通过供体大肠杆菌HAMBI2356与根瘤菌接合的方法成功地将celB基因导入4个菌株中,对标记基因可能会对标记菌株产生的影响进行检测,结果表明标记基因在标记菌株内能稳定传代,而且对标记菌株的生长、竞争性及有效性都没有显着影响,从而证明celB基因标记技术可以作为一种简便、直观而又有效的检测手段用于追踪根瘤菌株在土壤中的竞争性。进一步通过田间试验比较分析标记菌与土着菌的竞争结瘤能力和固氮有效性,结果表明Y6-1-1、BB2-2-1-1、WZ-6-2-2与对照相比在占瘤率、瘤重、总瘤数上差异显着,占瘤率都在72%以上,显着提高了植株的干重、叶绿素含量、全氮量和产量,其中WZ-6-2-2的有效性最高、竞争性最强,可以用于苜蓿盛世品种的接种。
韩华君[3]2007年在《耐酸苜蓿根瘤菌的定殖研究》文中进行了进一步梳理紫花苜蓿是一种优质豆科牧草，有“牧草之王”的美称。近年来，随着对紫花苜蓿需求量的增加，紫花苜蓿产业化进程加快，苜蓿在酸性土壤上种植的呼声也愈高。在我国，紫花苜蓿主要种植在北方中性和碱性土壤上。随着西部大开发和退耕还林还草工作的进一步深入，我国实施了“北草南引”的计划。“北草南引”是推进紫花苜蓿在我国南方种植的重大举措。然而，我国南方酸性土壤分布广、面积大，紫花苜蓿是对酸最敏感的豆科牧草，酸性土壤的存在严重阻碍了紫花苜蓿的“北草南引”及其产业化进程。因此在南方酸性土壤上接种耐酸根瘤菌建立高效共生抗逆系统显得尤为重要。苜蓿根瘤菌与苜蓿的共生是长期以来研究苜蓿的重要方面，高效耐酸苜蓿根瘤菌接种苜蓿将有助于在我国南方建立抗逆的苜蓿高效固氮系统。随着豆科植物在酸性土壤中的应用日益推广，接种耐酸根瘤菌已经作为提高酸性土上豆科牧草产量和品质的重要途径。而所接种根瘤菌在土壤中生存定殖能力的强弱直接影响着接种的效果。同时，根瘤菌施入土壤以后，对根际其他微生物和微生物生物量均有一定的影响。因此，加强根瘤菌根部定殖的研究对于揭示有益细菌在根圈的微生态学特征、提高其根际适应性和增产效果的稳定性具有十分重要的意义。同时，Ca~(2+)作为一种信号传递因子，是一种能促进苜蓿根瘤菌耐酸的重要因子，其促进苜蓿根瘤菌及其共生系统耐酸的作用已得到了一定的研究。因此，本研究在缙云山酸性土壤上接种耐酸苜蓿根瘤菌，并施用不同浓度的Ca~(2+)，探讨其在酸性土壤上的定殖及其对苜蓿根际土壤微生态环境的影响，进而分析了施Ca~(2+)和接种耐酸苜蓿根瘤菌对紫花苜蓿共生效应的影响。可以为在南方紫花苜蓿新种植区接种高效耐酸苜蓿根瘤菌提供一定的理论和技术依据。研究的主要结果如下：1．采用裂区设计缺叁区处理，在缙云山酸性土壤中(pH4.6)接种叁株由本实验室分离的耐酸苜蓿根瘤菌91522、91512、91532，并施用不同浓度的Ca~(2+)(0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L)，结果表明：叁种耐酸苜蓿根瘤菌均能在酸性土中定殖，且定殖动态基本一致，叁种供试菌株与对照相比，其定殖数量没有显着性差异，但叁种供试菌株的定殖数量均高于对照，以接种菌株91512和91532的效果最好。施Ca~(2+)处理对根瘤菌定殖影响不明显，但仍以施5mmol/LCa~(2+)时，定殖效果最佳。说明接种耐酸根瘤菌并施用适当浓度的Ca~(2+)，对根瘤菌在酸性土壤中的定殖有一定的促进作用；2．施Ca~(2+)和接种耐酸苜蓿根瘤菌对苜蓿根际土壤微生物数量及其生物量的影响明显，其差异达到显着和极显着水平。其中，接着耐酸苜蓿根瘤菌后，细菌、真菌和微生物生物量均显着增加，而放线菌数量稍增加，未达到显着性差异。而叁种菌株(91522、91512、91532)之间差异不显着。施Ca~(2+)仅对细菌数量有显着性增加，而对其它微生物未产生显着性影响。可见在酸性土壤上，接种耐酸苜蓿根瘤菌和施Ca~(2+)，改变了根际营养成分，有利于微生物的生长繁殖，从而使土壤的微生态环境得到改善，提高了微生物数量和微生物生物量；3．接种耐酸苜蓿根瘤菌后土壤微生物数量及其微生物生物量与对照相比，在大部分月份均明显增加，达到显着和极显着水平。四个处理的叁大类微生物数量及其生物量均在6月份达到最大值。可见，随着根瘤菌的定殖，植株根系的生长发育，根系分泌物随之增加，为根际微生物提供了大量的能源，再加上土壤适宜的温湿条件，有利于各种微生物的生长繁殖。因而，使微生物的数量和微生物生物量达到了最大值；4．检测了施Ca~(2+)和接种耐酸苜蓿根瘤菌对紫花苜蓿共生效应的影响。结果表明，接种耐酸苜蓿根瘤菌和施Ca~(2+)对苜蓿植株瘤重、根鲜重、株高和植株上部鲜重的影响显着。其中接种菌株91512对苜蓿瘤重、株高和地上部鲜重的影响最大，根鲜重则以接种菌株91532的效果最好；而施Ca~(2+)处理则以施5mmol/LCa~(2+)时对共生效应的影响最大。说明接种耐酸苜蓿根瘤菌、施用适当浓度的Ca~(2+)以及共生系统良好的结瘤性能能够提高酸性土上紫花苜蓿的产量和品质；5．施Ca~(2+)和接种耐酸苜蓿根瘤菌对酸性土壤中土壤的养分状况有所改善，接种耐酸苜蓿根瘤菌和施Ca~(2+)5mmol/L对土壤氮有明显的影响。各处理中，土壤交换性钙的含量均减少，而施5mmol/L的Ca~(2+)处理，土壤中交换性钙减少最少。总体上看，除土壤中交换性钙含量减少，土壤全磷保持不变外，其余土壤养分含量均有所增加，但影响不显着。说明施Ca~(2+)和接种耐酸苜蓿根瘤菌，改善了苜蓿植株的营养条件，促进了苜蓿根系的生长和代谢，进而促进根际微生物的生长和繁殖，使土壤的微生态环境得到改善，从而加速土壤养分的积累，提高了土壤的肥力。
石茂玲, 邓波, 刘蒙, 徐安凯, 王志峰[4]2014年在《吉林省“公农1号”紫花苜蓿高效根瘤菌株的筛选》文中认为在吉林省4个生态类型地区采集了74株不同建植年限苜蓿的根瘤,调查了"公农1号"紫花苜蓿根瘤菌株的分布情况。结果表明,苜蓿根瘤多数分布在根部10cm以下的须根;根瘤数量、重量受苜蓿建植年限、不同生态类型及土壤类型的影响较大。分离纯化所得的81株根瘤分离物经"公农1号"苜蓿水培回接结瘤试验,得到bc8,gzl59和da80等8个优良根瘤菌株;在温室条件下,对回接试验筛选出的8个菌株进行土壤盆栽复筛试验,以期筛选出适合"公农1号"苜蓿生长的高效根瘤菌株。结果表明,根瘤分布在植株根部10~30cm处;在所有供试菌株中,菌株bc18、yj34、bc94和gzl59表现较为优良。菌株yj34和bc94对茎长和叶片数影响最大,茎长分别增加60.17%和59.86%,叶片数分别增加97.92%和95.92%;菌株gzl59对根长影响最大,根长增加64.32%;菌株gzl59和bc94对提高植株干重贡献最大,其中,菌株gzl59比对照增产288.24%;供试菌株对根瘤数的影响也很显着,接种菌株yj34的苜蓿根瘤数相比其他菌株较高,达104.24%。综合分析,发现根瘤菌株gzl59、bc94和yj34较其他菌株表现突出,是吉林省"公农1号"苜蓿的高效根瘤菌株。
刘晓云, 郭振国, 李乔仙, 刘桂霞, 薛世明[5]2011年在《南苜蓿高效共生根瘤菌土壤的筛选》文中提出利用云南德宏盈江县3种类型的土壤,对分离自云南楚雄、德宏等地的SWF67523、SWF67409、SWF67456等12株根瘤菌菌株进行了南苜蓿接种效果的研究。结果表明,在所有供试菌株中,菌株SWF67523、SWF67409、SWF67394表现最为优良,结瘤率较高的菌株是SWF67523、SWF67501、SWF67394和SWF67350,结瘤率均达到95%以上;而菌株SWF67523、SWF67409和SWF67394对植株株高影响最大;菌株SWF67409、SWF67523和SWF67394对提高植株干重贡献最大,其中菌株SWF67409比空白对照增产106.5%;供试菌株对含氮量的影响也很显着,接种菌株SWF67409、SWF67523和SWF67394的苜蓿植物含氮量相比其他菌株较高,影响显着。综合以上结果,发现来源于盈江南苜蓿的根瘤菌菌株SWF67523较其他菌株表现突出,同时发现根瘤菌菌株的接种效果受土壤因子的影响,在含有效钾中等的土壤平原镇Ⅱ上,接种根瘤菌的南苜蓿地上部分干重普遍高于其他两种有效钾含量为较缺的土壤,说明根瘤菌菌株与宿主和土壤环境存在密切关系,在适合的宿主和生活环境中将会发挥最大的共生固氮作用。
张琴[6]2006年在《紫花苜蓿高效耐酸根瘤菌的筛选及其对共生系统耐酸铝效应的研究》文中研究指明紫花苜蓿是一种优质豆科牧草，有“牧草之王”的美称。近年来，随着对紫花苜蓿需求量的增加，紫花苜蓿产业化进程加快，苜蓿在酸性土壤上种植的呼声也愈高。在我国，紫花苜蓿主要种植在北方中性和碱性土壤上。随着西部大开发和退耕还林还草工作的进一步深入，产业结构的调整，紫花苜蓿的种植范围不断扩大，南方苜蓿种植已经成为苜蓿产业化的重要方面。然而，我国南方酸性土壤分布广、面积大，耐酸苜蓿根瘤菌资源缺乏。为此，筛选耐酸苜蓿根瘤菌十分必要。 国外在中度酸性土壤上种植紫花苜蓿的经验表明，酸性土壤上接种高效耐酸苜蓿根瘤菌是提高紫花苜蓿产量和品质的重要措施。借鉴国外经验，本研究从我国西南地区土壤分布类型和苜蓿种植情况入手，对紫花苜蓿耐酸根瘤菌进行了筛选，研究了耐酸苜蓿根瘤菌的生长特性、对紫花苜蓿生长和结瘤的影响，探讨了Ca~(2+)作用下的耐酸机理。并通过田间试验，检测施Ca~(2+)和接种耐酸苜蓿根瘤菌对酸性土上紫花苜蓿生长及产量和品质的影响，以期建立一套耐酸苜蓿根瘤菌筛选和鉴定体系，为在西南紫花苜蓿新种植区接种高效耐酸苜蓿根瘤菌奠定基础。研究的主要结果如下： 1．从在酸性土(pH5.2)上生长的紫花苜蓿根瘤中分离到若干苜蓿根瘤菌株，其中六株根瘤菌能够在pH4.8的固体培养基上稳定生长，分别编号为91511、91512、91521、91522、91531、91532，这六株根瘤菌均能使紫花苜蓿植株在9d左右结瘤，培养30d后，苜蓿植株平均每株结瘤数达10个以上，结瘤率也较高，约为66.67％-100％。 2．六株苜蓿根瘤菌在不同酸度(pH7.0、pH6.0、pH5.5、pH5.2、pH5.0、pH4.8)下生长曲线的测定结果表明，酸显着降低根瘤菌的生长速率，使其生长延滞期增长，对数生长期滞后，稳定期延迟。六株根瘤菌均能在pH5.0及以上的液体培养基中生长，菌株91532还能在pn4.8液体培养基中生长，说明，在低pH条件下，耐酸苜蓿根瘤菌在其耐受酸度范围内经过延长的延滞期后仍然能够较快地生长。平均代时的测定结果表明，酸性条件下各根瘤菌的平均代时均较中性条件下的长，环境pH越低，菌株平均代时越长。 3．采用正交试验法研究了两个苜蓿品种在不同环境pH(pH4.8、5.2、5.6)下接种六株苜蓿根瘤菌株的效果。结果表明，菌株、环境pH、植株品种对苜蓿整株鲜重的影响均极显着，影响程度依次为环境pH(F=71.8970)、苜蓿品种(F=27.0499)和菌株(F=11.8361)；环境pH、菌株对苜蓿有效根瘤数有极显着影响，植株品种的影响不显着，环境pH是影响苜蓿有效结瘤的最主要因素(F=8.0809)；苜蓿根瘤菌对苜蓿根瘤固氮酶活性的影响极显着(F=14.4269)，环境pH的
郭海玉, 罗明, 何媛, 李卫军[7]2016年在《新疆紫花苜蓿根瘤菌XGL026发酵条件的响应面法优化筛选》文中研究表明在摇瓶培养条件下对分离获得的抗逆、高效新疆紫花苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)XGL026菌株的发酵条件进行优化。依据单因素试验结果,采用Plackett-Burman设计对菌体生长的影响因素进行效应评价,筛选出麦芽糖浓度、酵母膏浓度及初始pH是显着影响菌株生长的主要因子。响应面法优化获得根瘤菌XGL026的最佳培养基为:麦芽糖27.20g·L~(-1),酵母膏10.54g·L~(-1),K2HPO40.8g·L~(-1),MgSO_4·7H_2O 0.2g·L~(-1),NaCl0.1g·L~(-1),初始pH 6.98。在转速150r·min~(-1),28℃条件下摇瓶培养24h,活菌数可达3.47×10~(12) cfu·mL~(-1)。通过3次重复的发酵试验验证,与预测值相对误差为1.17%,表明模型拟合效果良好。
霍平慧[8]2014年在《耐抑菌剂根瘤菌筛选及耐药菌株制备菌剂抑杂菌效果研究》文中认为商用根瘤菌剂在贮藏期间常面临有效活菌数低、污染率高等问题，致使菌剂不耐贮藏，且施用到田间后难以在与土着根瘤菌的竞争过程中形成高效结瘤能力。为解决上述问题，本研究拟通过向根瘤菌剂添加植物源或稀土盐类抑菌剂，筛选抗抑菌剂菌株，探讨抑菌剂对植株生长的影响，评价两类抑菌剂不同剂型的抗污染效果。在此过程中，采用叁亲本杂交法对目标菌株进行荧光蛋白基因标记，以获得的标记菌株作为示踪工具探讨目标菌和杂菌在菌剂中的数量动态。取得如下主要研究结果：1.供试材料中所有初筛选根瘤菌对植物源类抑菌剂的耐受效果较稀土盐类抑菌剂好。低浓度（0.4mg mL-1）的稀土盐类抑菌剂在尚未对空气和土壤中杂菌起到较强抑制作用时即可抑制多数根瘤菌的生长，而在含有0.6mg mL-1苦参碱的平板中，绝大多数空气源和土壤源杂菌的生长被抑制，却仍有根瘤菌可以耐受。2.通过测定荧光蛋白标记根瘤菌的抑菌剂耐受性发现，荧光蛋白标记并未对筛选根瘤菌的抑菌剂耐受性产生明显影响，表明该方法可用作根瘤菌的示踪方法。3.0.6mg mL-1的苦参碱抑菌剂的添加对苜蓿植株的生长产生了一定的抑制作用，其植株的各项生理及形态指标均显着低于不接菌的对照处理。而通过回接添加了相同浓度抑菌剂的根瘤菌液，发现宿主植株的所有生理及形态指标均不再低于不接菌的对照。而在叶绿素含量、可溶性糖含量、根系活力、根长及体积、株高、单株叶片数及结瘤数、根瘤等级等指标中，处理植株均达到了与接种对照及参比根瘤菌株相同的程度。表明向耐苦参碱根瘤菌剂中添加苦参碱抑菌剂，虽对部分植株指标产生一定影响，但总体上对回接植株仍具有明显的促生效果，这也更进一步证实了将苦参碱抑菌剂用作根瘤菌剂添加剂的可行性。4.各稀土盐抑菌剂对空气和土壤中杂菌均有较好的抑制效果，但对根瘤菌的抑制效果与杂菌相似，因此不利于耐药根瘤菌的筛选。同时因为稀土盐类物质化学性质活泼，与多数培养基成分及pH调节剂均可发生反应，对后续菌株的培养工作造成困难，因此不适合作为根瘤菌剂的添加剂。5.除虫菊素在短期内的抑杂菌效果较好，但随着时间的延迟，其抑菌效果急剧下降，且达到较好抑菌效果所需的活性物质含量较高，并要求低温避光的贮藏条件，本身市场价格也高，与较低浓度即可达到较好抑菌效果且价格便宜、有效作用期长的的苦参碱抑菌剂比，除虫菊素不适于用作菌剂长期贮藏时的添加剂，而苦参碱更适用于用作根瘤菌剂的添加剂。6.通过对添加苦参碱抑菌剂的液体和固体根瘤菌剂抗污染效果及杂菌率的检测发现，苦参碱抑菌剂的添加可有效降低被污染处理的液体菌剂杂菌数和固体菌剂杂菌率，同时对固体菌剂pH值的维持也有较好的效果，因此可将苦参碱用做液体和固体根瘤菌剂的添加剂。
李剑峰[9]2011年在《解磷根瘤菌诱变选育及抗污染菌剂制备关键技术研究》文中研究指明磷是植物生长必需的主要营养元素,由于72%到90%的土壤磷会被土壤中的钙、铝、铁离子和有机化合物所固定,使土壤磷缺乏成为限制农产品产量和质量的重要因素。苜蓿和红豆草作为最重要的牧草,栽培面积超过两百万公顷,占全国近四分之叁的人工草地。产量集中于西北高原干旱半干旱地区的谷物作物轮作区。土壤全磷含量随磷肥的不断施用而逐渐增加,但作物及牧草依旧由于有效磷过低而产生明显的缺磷症状。解磷微生物能够分解土壤中的难溶性无机磷供植物吸收利用,其中的解磷根瘤菌作为一种同时具备解磷和结瘤固氮作用的植物促生菌,对豆科作物的生长和产量有很好的促进作用,能够减少磷化肥的施用,并降低农业生产的成本。但目前解磷根瘤菌剂的应用受到下列因素的限制:1.菌种的选育效率较低,筛选出的菌种综合促生能力不高。2.菌种的应用范围仅限于其寄主植物。3.国内外根瘤菌剂普遍存在污染率高、功能单一、保质期短和占瘤率低的问题。由于解磷根瘤菌本身会分泌有机酸,因此更容易造成菌剂产品的酸化,引起菌体的死亡和杂菌的侵入;4.目前采用的通用泥炭载体基质为不可再生资源,其采集过程会对产地的生态环境造成破坏,而泥炭菌剂也存在一些质量上的缺陷。针对上述问题,本研究从以下方面进行了探讨:1.优化解磷根瘤菌的筛选方法和菌种的诱变增效;2.将能够解磷并有分泌生长素能力的根瘤菌作为根际解磷固氮促生菌在非寄主植物上应用,拓宽其应用范围;3.利用抑菌剂降低根瘤菌剂的污染率,提高根瘤菌活菌数和目标根瘤菌的占瘤率;4.以青秸秆粉浸提液作为解磷根瘤发酵培养基,降低菌剂生产成本。并以黄绵土和秸秆粉代替泥炭载体作为固体菌剂载体基质,降低根瘤菌菌剂制备的经济成本和环境成本。根据这样的指导思想和目标,本研究在逐级分离、定向选育的方法筛选出有利用潜力的解磷分泌生长素根瘤菌Rhizobium. Meliloti L-5和Rhizobium sp.RS-1菌株的基础上,通过微波诱变和验证选育得到两株原始菌株的增效耐药突变株Rhizobium. meliloti LW107和Rhizobium sp.RSW96,使菌株的解磷和分泌生长素能力得到增强,并获得对两种抗生素的抗药标记特性。经过遗传稳定性验证后,在以难溶性无机磷为唯一磷素来源的栽培条件下考察诱变选育得到的解磷根瘤菌突变株LW107和RSW96对寄主及非寄主植物的促生性能。在抗污染菌剂的试制过程中,利用突变株的耐药特性,以其耐受的氨苄青霉素作为抑菌剂,进行不同浓度氨苄青霉素对菌株和寄主植物幼苗的毒性测验,优化出液体菌剂的最适抑菌剂浓度和含药菌剂施用时的最佳稀释度。为了最大程度的降低菌剂成本并提高其质量,本研究优化出最适于解磷根瘤菌发酵培养的碳源种类,讨论了调整成份后的青秸秆粉浸提液作为解磷根瘤菌液体发酵培养基和固体培养基的可行性。随后以灭菌的玉米青秸秆粉、黄绵土以及常用的泥炭和蛭石进行载体基质的筛选,试制出含抑菌剂的解磷根瘤菌液体菌剂和固体菌剂,经不同贮存时期进行菌剂性质的测定和验证,得到性质稳定、造价低廉、污染率低、有效期长的解磷根瘤菌剂及其制备工艺的关键技术。研究的主要结果如下:1.以固氮菌-解磷固氮菌-解磷根瘤菌的逐级筛选模式可以从豆科植物根瘤内分离得到具有良好促生性能的解磷根瘤菌。以该方法筛选出的苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti L-5和红豆草根瘤菌Rhizobium sp. RS-1均为快生型根瘤菌,具有结瘤固氮能力较强的特点,兼备解磷和产生长素的特性,耐盐和耐酸碱能力强,可以作为高效解磷根瘤菌进一步选育的基础材料。2.根瘤中可溶解无机磷的解磷固氮菌株以土壤杆菌、放线菌、芽孢杆菌、氮单胞杆菌和其他固氮菌属中的菌株为主,经回接鉴定的根瘤菌仅有5株,仅占总固氮菌株数的1.78%。表明根瘤内有大量无结瘤能力的解磷固氮菌存在。3.采用菌株诱变的方法,可利用已有菌种资源,提高菌种选育效率,弥补野生菌种解磷能力弱的缺陷。作为一种简便、安全、清洁、廉价的辐射源,微波辐照诱变的条件更易于掌控和变更。本研究中随着诱变目的和根瘤菌株的不同,具体的最佳微波辐照参数有较大差异,但最高正突变率均出现于致死率为87%-90%之间的辐照处理。经诱变得到的部分高效突变菌株存在遗传基因不稳定、出现回复突变或产量下降的现象,需验证至少6代菌体的遗传稳定性。4.在仅提供难溶性无机磷的栽培条件下,所有植物都表现出明显的生长受抑,叶片生长迟缓、颜色变深,根系变细。具备产生长素能力的解磷根瘤菌对寄主和非寄主植物有良好促生效果,能有效解除寄主和非寄主植物的缺磷胁迫,促进植株生长量和生物量的增长,提高氮素和磷素的吸收。解磷根瘤菌通过溶解难溶性无机磷解除寄主或非寄主植物遭受的缺磷胁迫,使之进入相对均衡的营养环境,同时侵染寄主植株产生根瘤固氮。对非寄主植物,解磷根瘤菌具有根际解磷菌相似的特性,但接种于寄主植物时,植株的叶面积、地上及地下生物量干重、根瘤个数、根瘤直径等均优于接种的非寄主植物。5.在低磷条件下,普通根瘤菌依然具备侵染寄主植株并结瘤固氮的能力,但根瘤直径、鲜重和固氮酶活性明显下降。缺磷胁迫下接种普通根瘤菌12531的植株生长状况优于未接种根瘤菌也未施用可溶性磷素的处理CK1,但单叶面积仅分别为接种LW107、RSW96菌株和施用1/4量可溶性磷素处理(CK2)的65.9%、79%和67.4%。接种普通根瘤菌12531的植株生物量干重较CK1处理增加35.93%,但仅为接种解磷根瘤菌LW107和RSW96处理的73.1%和85.29%,也低于施用化学磷肥的处理17.92%。6.氨苄青霉素作为具有低毒性的抑菌剂,低剂量时刺激植物生长而高剂量时产生毒害效应。200mg/L以上剂量氨苄青霉素能够抑制根瘤菌诱导植株结瘤使根瘤数量减少,根瘤剖面颜色变浅,个体变小,固氮酶活性降低至其正常根瘤的1/5以下。低浓度的氨苄青霉素对结瘤和固氮酶活性无抑制作用,还能提高植株结瘤的数目。由于物种间存在差异,苜蓿和红豆草对于同一氨苄青霉素浓度的反应并不相同。7.保存120d、以泥炭、蛭石、秸秆粉和黄绵土为载体基质的固体菌剂中,活菌数随菌剂载体吸附菌液量的增多而升高。由于青秸杆粉疏松多孔,可吸附达自重2.7倍的菌液,并含有大量适于微生物生长的氮源、核酸、可溶性糖和几乎菌种所需的全部矿质元素。菌种进入载体后继续大量繁殖,保存120d时的最大有效菌含量达到泥炭菌剂的155.48%和138.44%,用于菌剂载体有很大潜力。但贮存1a后,由于解磷根瘤菌酸性代谢物的过量积累,使pH值显着降低,杂菌数量上升而根瘤菌数急剧下降。比较发现,黄绵土载体制备的菌剂中LW107和RSW96菌株的有效菌含量显着高于其他载体基质(P<0.05),泥炭载体次之。黄绵土和泥炭基质菌剂的主要性状都达到微生物菌剂国家标准,可以作为菌剂载体基质利用。黄绵土基质由于价格低廉,原料易得,贮存后活菌数量高而杂菌率低,性质稳定,具有良好的应用潜力。8.秸秆粉浸提液培养基(CSE)中的碳源和磷素营养都能被菌体很好的利用。补充葡萄糖并调整pH后的秸秆粉浸提液培养基(CSE-2,青秸秆粉与H2O的比例为1:50)适用于LW107菌株的液体发酵,在降低菌剂成本的同时加快菌液的发酵速度,优于通用的YEM培养基;CSE-2中1:100的青秸秆粉浸提液(CSE-3)加入葡萄糖和琼脂后制成的固体培养基对根瘤菌的平板培养效果等同或优于标准YMA培养基,可以作为根瘤菌平板培养的高效廉价培养基。9.降低温度和添加抑菌剂均能提高根瘤菌剂中的有效菌数,降低杂菌率并维持菌剂内pH值的稳定。温度对长期保藏菌剂(1a)的活菌数和污染率影响最大,抑菌剂次之,4oC低温下保存抑菌剂可以有效提高活菌数,并使杂菌的数量得到有效控制;室温下菌剂中的菌体代谢活跃,有机酸积累量高,pH值偏低,而低温保存或添加抗生素的菌剂则pH值相对稳定。解磷根瘤菌菌剂贮藏1a后的pH值大小顺序为:低温贮藏的含抗生素菌剂>常温贮藏的含抗生素菌剂>低温贮藏的普通菌剂>常温贮藏的普通菌剂。10.以对300mg/L氨苄青霉素和80mg/L卡那霉素的双抗药性和解无机磷特性作为解磷根瘤菌高效突变株的标记特征,获得的菌株可以通过观测解磷透明圈、含药平板甄别的方式进行示踪和检测,使菌剂中目标菌和杂菌的测定过程得以简化,也使含抑菌剂的抗污染剂型制备和目标菌的占瘤率测定得以实现。11.以乙炔还原法测定固氮酶活性时发现,由于缺乏厌氧环境或低氧环境对固氮酶的保护,根瘤菌纯培养物的固氮酶活性远低于其诱导植物形成的根瘤,但源于同一原始菌株的突变株纯培养物固氮酶活性和其同一寄主的根瘤固氮酶活性间,存在正相关,且苜蓿根瘤菌L-5和红豆草根瘤菌RS-1的突变株系都得到一致的结果。这一现象值得进一步研究和发掘,可对高效固氮根瘤菌突变株的快速选育提供借鉴。
张学军[10]2008年在《苜蓿根瘤菌耐受酸性胁迫的生理、遗传和共生特征研究》文中指出紫花苜蓿为豆科苜蓿属多年生牧草,具有生长迅速、饲草产量高、蛋白质含量高、抗逆性强,适应范围广,适口性好等特点,素有“牧草之王”的美誉,在世界各地被广泛栽培利用。苜蓿喜中性或微碱性土壤,pH6～8为宜,在我国北方广泛种植。近年来,随着苜蓿产业化进程加快和我国西部大开发和退耕还林还草工作的进一步深入,紫花苜蓿的种植范围不断扩大,南方苜蓿种植已经成为苜蓿产业化的重要方面。然而,我国南方酸性土壤分布广、面积大,耐酸苜蓿根瘤菌资源缺乏。为此,筛选耐酸苜蓿根瘤菌,对其耐受酸性胁迫的生理、遗传和共生特征进行研究,对促进苜蓿在酸性土壤上的广泛种植十分重要。本研究对筛选到的3株能在pH4.8的YMA固体培养基上正常生长的根瘤菌为研究对象:研究了其生长特性,与紫花苜蓿共生结瘤的影响:通过测定16SrDNA序列,根据所测得的序列构建数值分类树状图,确定其在系统发育学上的地位:对菌体进行扫描电子显微镜分析和在酸性胁迫下的生理特性进行研究;最后进行小区试验,验证其与紫花苜蓿共生状况。研究的主要结果如下:1.对3株根瘤菌在Fahraeus无氮营养液中进行回接结瘤试验,每株分别接种在6个pH梯度(7.0,6.0,5.5,5.2,5.0,4.8)的试管中,每支试管3株幼苗,3次重复。培养30对结瘤数、株高和植株鲜等数据进行统计。结果表明,无论在中性还是在酸性条件下,接种根瘤菌对紫花苜蓿生长作用显着。比较接种不同菌株处理,pH在5.5-7.0,数据规律不明显;pH5.2-4.8,接种菌株91532的苜蓿结瘤数、株高和植株鲜重均明显高于接种91512和91522。2.对各菌株16SrDNA扩增片段测序,91532菌株已经测出,根据所测得的序列构建数值分类树状图,菌株91532与苜蓿中华根瘤菌EF201802相似性达到99.5%。由此可断定91532为1株苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。3.Elizabeth J.和Watkina W.等对耐酸根瘤菌的研究结果表明:扫描电镜下,耐酸菌株在酸性液中细胞将变短小,而酸敏感菌株无明显变化。对耐酸能力相对较强的91532菌株和典型的耐盐碱菌株96489进行扫描电子显微镜分析。结果表明:在中性条件下91532菌体4.平均长度为2.110um,宽度为0.657um,酸性条件下生长的菌体平均长度为1.1887um,宽度为0.6267um.。而96489菌株在中性条件下菌体平均长度为1.539um,平均宽度为0.613um,在酸度为5.5时菌体平均长度为1.539um,平均宽度为0.616um,长度和宽度与中性条件下的几乎一致。在酸性条件下,91532菌体的长度约为中性条件下的1/2,而宽度变化不大。5.为了探讨菌株的耐酸机制,进行了质子通量试验。结果表明:无论是否经过酸(pH5.2)诱导,酸敏感菌株96489和3株耐酸菌株,16Min内pH变化均呈上升趋势,但酸敏感菌株96489未经诱导和诱导处理间的pH变化幅度高于3株耐酸菌株。处理前后各菌株的存活率显示,无论诱导与否,3株耐酸菌株的细胞存活率均达到75%以上;而酸敏感菌株96489经过诱导,其细胞存活率达63%,比未诱导的高32%,差异达到显着水平。酸性诱导使96489产生了ATR反应,使菌体细胞膜有效抵挡外界H~+的侵入,提高菌体在强酸环境中的存活能力。而3株耐酸苜蓿根瘤菌对酸性诱导不起作用,其细胞膜本身具有阻止H~+进入细胞的能力,是长期生存在酸性土壤中形成的稳定遗传性状。6.在缙云山酸性土上种植紫花苜蓿进行田间小区试验,接种情况为:3株耐酸菌株、酸敏感菌株和对照,3次重复,共15个小区。经收获植株并进行相关分析,结果表明:接种根瘤菌(酸敏感和耐酸菌株)对紫花苜蓿生长作用显着,接种耐酸菌株与对照和接种酸敏感菌株比较,株高、根瘤数、植株地上部分鲜重和植株全氮均呈显着相关。对各小区的微生物数量(细菌、真菌、放线菌和根瘤菌)进行测定,分析结果表明,在酸性土壤上种植紫花苜蓿对土壤的微生物定植有显着提高作用;接种耐酸苜蓿根瘤菌,与不接种对照和接种酸敏感菌株对土壤中微生物的定殖差异显着。
参考文献：
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[4]. 吉林省“公农1号”紫花苜蓿高效根瘤菌株的筛选[J]. 石茂玲, 邓波, 刘蒙, 徐安凯, 王志峰. 草原与草坪. 2014
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[8]. 耐抑菌剂根瘤菌筛选及耐药菌株制备菌剂抑杂菌效果研究[D]. 霍平慧. 甘肃农业大学. 2014
[9]. 解磷根瘤菌诱变选育及抗污染菌剂制备关键技术研究[D]. 李剑峰. 甘肃农业大学. 2011
[10]. 苜蓿根瘤菌耐受酸性胁迫的生理、遗传和共生特征研究[D]. 张学军. 西南大学. 2008
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