长沙医学院 湖南长沙 410219
摘要 目的 研究连翘、金银花、香薷、苦参、蒲公英和薄荷水煎剂对厌氧链球菌和奈瑟氏菌的体外抑制作用。 方法 选取的菌株为口腔常见的厌氧链球菌和奈瑟氏菌，脑心浸出液肉汤( BHI) 和脑心浸萃琼脂培养基，将连翘、金银花、香薷、苦参、蒲公英、薄荷分别煎成水煎剂（初始质量浓度为1 g/m L），采用LIVE /DEAD Baclight 细菌活力试剂盒对中药干预后细菌的活性进行测定，采用荧光分光光度计计算活菌/死菌比例，分析6种中药的体外抑菌效果。 结果 香薷、薄荷和蒲公英无明显抑菌效果。荧光光谱分析发现金银花对厌氧链球菌的抑制效果( 死菌/总细菌) 最好；连翘对奈瑟氏菌有较好的抑菌效果。 结论 6种中药中，金银花对厌氧链球菌的抑菌作用较好，连翘对奈瑟氏菌的抑菌作用较好，其提取物可用于口腔抑菌中成药的制备。
关键词：中药；荧光光谱；细菌菌属
健康人的口腔包含超过700种细菌病毒和真菌等微生物，大部分可以相互关联并形成生物膜，抵抗机械清除力或抗生素治疗，但在环境变化或其他口腔情况变化触发时也可成为致病微生物[1]。其中厌氧链球菌、奈瑟氏菌这两种细菌为人体口腔中最常见的机会致病菌，口腔严重炎症疾病的患者常采用口服消炎药来进行临床治疗，但受限于西药的耐药性，部分患者容易出现炎症的复发，因此临床医师越发推荐使用中成药对口腔内发生的局限性炎症进行治疗。本实验初步选取6种有抑菌效果的中药，荧光光谱检测其对厌氧链球菌和奈瑟氏菌的体外抑菌效果。
1 材料和方法
1.1 实验菌株和试剂：本实验选取的菌株为口腔常见的厌氧链球菌和奈瑟氏菌，脑心浸出液肉汤( BHI) 和脑心浸萃琼脂培养基。LIVE /DEAD Baclight细菌活力试剂盒。根据中药药性，选取5味具有清热解毒，抗菌抑菌作用的中药，分别是连翘、金银花、香薷、苦参和蒲公英，并加入薄荷调味。
1.2 实验菌株的准备：首先，常规进行菌株的复苏，将两种菌株培养于琼脂斜面培养基，4℃备用。实验时，取饱满的菌落接种于BHI液体培养基中，于37℃、体积分数 80% N2和20%CO2厌氧培养24 h，采用平板倾注培养计数法计数细菌。根据计数结果，将样品稀释到10-5的菌落数在30-300之间，因此选定这一浓度[2]。其次，取1 m L培养24 h 后的菌液倾入3个平板，重复两个平板；然后在每个平板中分别倒入已灭菌冷却至45-50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，37℃下厌氧培养24-36 h，菌落长出后计数。
1.3 中药材中药剂的制备：采用水提醇沉法提取中药有效成分，称取30 g中草药，加水300 m L 待加热沸腾后煎煮 45min，抽滤药液，按此法重复一次。合并两次药液，经水浴蒸发，药液终浓度为1 g /m L。加入无水乙醇70m L，使其体积分数为70% ，充分混匀，放入4℃冰箱静置过夜。第2天1000 rpm 离心15 min 去除沉淀，取上清蒸发乙醇，4 ℃冰箱保存备用。
1.4 抑菌实验：采用LIVE /DEAD Baclight 细菌活力试剂盒对中药干预后细菌的活性进行测定[3]，含有 SYTO9和PI两种染料，根据荧光强度计算活菌/死菌的比例。操作严格按照说明书进行，步骤如下：依据 MIC 结果取不同中药的最小抑菌浓度[4]，与10 m L菌液混合培养，或细菌悬液单独培养，24 h后离心15 min，弃上清，用10 m L无菌生理盐水清洗离心两次，加10 m L生理盐水吹打混匀。取两种染色剂，每管加2.5 m L 蒸馏水，混匀后避光，现配现用。取 1.5 m L生理盐水细菌悬液，按体积1：1与染料混合，室温下避光孵育：15 min 后上机检测[5]。设置荧光分光光度计的激发波长为 470 nm，发射波长为 490-700 nm。样品在 500-510 nm 有一峰值，主要是SYTO9染料发射的绿色荧光，为活菌；死菌被PI染料染色，主要在630 nm 附近发射红光。计算510-540 nm 与620-650 nm的荧光强度比，即为活菌与死菌比例。
1.5 统计学分析：应用SPSS20.0 软件，实验组与对照组之间进行t 检验，以P＜0.05差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 中药干预对相关细菌活性的影响比较
香薷、薄荷和蒲公英无明显抑菌效果。荧光光谱分析发现金银花对厌氧链球菌的抑制效果(死菌/总细菌) 最好；连翘对奈瑟氏菌有较好的抑菌效果。整体可见表1。
表1 中药干预对相关细菌活性的影响比较
3 讨论
本研究首先采用MIC测定方法，初步从6味中药中筛选出连翘、金银花、苦参3味中药成分对口腔细菌有一定的抑菌效果。随后通过荧光染色测定活菌与死菌的荧光强度比，进一步分析中药提取物的抑菌效果，发现金银花对厌氧链球菌的抑菌作用较强；连翘对白假丝酵母菌抑菌作用较好。连翘、金银花、苦参都具有广谱抗菌、抗病毒、解热抗炎等药理作用。
研究发现，香薷、薄荷和蒲公英无明显抑菌效果。荧光光谱分析发现金银花对厌氧链球菌的抑制效果( 死菌/总细菌) 最好，连翘对奈瑟氏菌有较好的抑菌效果，而香薷、蒲公英、薄荷提取物对厌氧链球菌或奈瑟氏菌均无明显抑制效果。 进行原因分析，金银花的活性成分作用于细菌胞内的核酸，影响DNA复制，使菌体的繁殖和生长受到抑制，从而影响蛋白质的合成与表达。苦参也能通过抑制菌体DNA、RNA和蛋白质的合成，发挥抑菌或抗菌效果。综上所述，临床上抗菌药物必须满足抑制致病菌的同时又不破坏口腔正常链球菌，本研究仅针对体外单一细菌的抑菌情况，今后的研究中需要对正常菌群、混合菌群以及生物膜状态下的重要抑菌情况展开进一步研究。
参考文献
[1]张凯.中药对口腔常见致病菌抑菌作用的初步研究[J].全科口腔医学电子杂志,2016,3(11):18-19,21.
[2]许凉凉. 藏药牙膏制备工艺及抑菌抗炎功效研究[D].北京中医药大学,2015.
[3]耿晓瑞,马莉,李红文,等. 中药对口腔致龋菌抑菌效果的实验研究[J].广东牙病防治,2015,23(2):71-74.
[4]高秋爽. 厚朴、蜂胶、茶多酚及其复合成分对变形链球菌抑菌效果的研究[D].兰州大学,2011.
论文作者:钟婉贤, 赵海叶（通讯作者）
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第07期
论文发表时间:2018/10/1
标签：细菌论文; 链球菌论文; 抑菌论文; 连翘论文; 效果论文; 中药论文; 香薷论文; 《世界复合医学》2018年第07期论文;