黎承杨[1]2003年在《输注异基因脾细胞诱导大鼠免疫耐受的实验研究》文中认为目的：比较异基因脾细胞经受体门静脉和口服两种途径输注诱导免疫耐受的疗效。方法：将供体SD大鼠的脾细胞经门静脉或经口服途径输注给受体Wistar大鼠，一周后把SD大鼠的皮肤移植到相应的Wistar大鼠上。皮肤移植术后观察移植皮肤的存活时间，并于术后一周测定受体外周血T淋巴细胞亚群和外周血淋巴细胞的CD25表达水平，以判断耐受水平。 结果：移植皮肤的平均存活时间（MST）门静脉耐受诱导组为15.8±2.1天,口服耐受诱导组为13.0±1.3天,均较对照组长（P＜0.01），组间MST比较门静脉耐受诱导组比口服耐受诱导组长（P＜0.01）。术后一周，随各组移植皮肤存活时间的延长，外周血淋巴细胞的CD25表达水平呈下降趋势；外周血T淋巴细胞亚群呈现CD4+ T细胞下降，CD8+ T细胞上升，CD4/CD8比值减少的趋势。结论：门静脉途径输注异基因脾细胞诱导出的免疫耐受程度比口服途径的大。
罗向东[2]2006年在《异基因脾细胞诱导大鼠心脏移植免疫耐受的实验研究》文中指出目的观察异基因脾细胞诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的情况,探讨其作用机制。同时,比较不同时间输注脾细胞诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受效果的差异。方法在SD→Wistar大鼠之间进行心脏移植手术,恢复血液流通后,经门静脉给予Wistar大鼠输注供者SD大鼠的脾细胞(2×10~8个),2日后经腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg);或者将SD大鼠的脾细胞(2×10~8个)经门静脉给予Wistar大鼠输注,一周后再行心脏移植手术。术后常规观察移植心脏的存活情况,术后一周测定受者外周血CD25+的表达水平,术后第六天各组随机取1只大鼠的移植心脏进行病理学检查,术后30天对诱导耐受的两组大鼠再进行二次皮肤移植,以观察所诱导的免疫耐受水平抵抗异体皮肤移植的情况。结果大鼠移植心脏的平均存活时间在术中输注脾细胞并使用单剂量环磷酰胺注射处理组为30.17±2.79d,在术前输注脾细胞诱导组为30.67±3.44d,二者均比没有诱导耐受的对照组延长(P<0.01);病理检查显示前两者的移植心脏中急性排斥反应的改变不明显;外周血CD25+表达水平呈下降的趋势。但是,它们并不能诱导产生针对二次皮肤移植的耐受。结论异基因脾细胞可以诱导大鼠受者产生针对供者的特异性心脏移植耐受,其中,在手术期间经门静脉注入供者脾细胞并使用单剂量环磷酰胺处理的方法比提前1-2周输注脾细胞的诱导方法可能具有更加方便的应用前景。
黎承杨, 邓耀良, 吴闯, 李山, 李盛宽[3]2006年在《异基因脾细胞诱导大鼠免疫耐受实验研究》文中研究表明目的比较异基因脾细胞经受体门静脉和口服两种途径输注诱导免疫耐受的效果。方法将供体SD大鼠的脾细胞经门静脉或经口服途径输注给受体Wistar大鼠,1周后把SD大鼠的皮肤移植到相应的Wistar大鼠上。观察术后移植皮肤的存活时间,受体外周血淋巴细胞CD25的表达水平和外周血T淋巴细胞亚群,以判断耐受水平。结果移植皮肤的平均存活时间(MST)在门静脉耐受诱导组为15·8±2·1天,口服耐受诱导组为13·0±1·3天,均较对照组长(P<0·01);组间MST比较门静脉耐受诱导组比口服耐受诱导组长(P<0·01);随各组移植皮肤存活时间的延长,外周血淋巴细胞的CD25表达水平呈下降趋势;外周血T淋巴细胞亚群呈现CD4+T细胞下降,CD8+T细胞上升,CD4/CD8比值减少的趋势。结论经门静脉途径输注异基因脾细胞诱导的免疫耐受效果比经口服途径好。
黎承杨, 邓耀良, 吴闯, 李山, 米华[4]2007年在《诱导大鼠免疫耐受的初步实验研究》文中研究指明目的:观察异基因脾细胞经门静脉途径输注诱导受体免疫耐受的效果,以及联合使用塞尼哌后的效果。方法:将供体SD大鼠的脾细胞经门静脉途径输注给受体Wistar大鼠,一周后把SD大鼠的皮肤移植到相应的Wistar大鼠上。移植前联合使用塞尼哌。观察术后移植皮肤的存活时间和受体外周血淋巴细胞CD25+的表达水平。结果:门静脉耐受诱导后移植皮肤的平均存活时间(MST)为(15.8±2.1)d,较对照组长(P<0.01);随移植皮肤存活时间的延长,外周血淋巴细胞的CD25+表达水平呈下降趋势。但使用塞尼哌后MST未延长。结论:经门静脉途径输注异基因脾细胞能够诱导受体产生免疫低应答状态,联合使用塞尼哌未能加强免疫耐受的诱导效果。
米睿[5]2008年在《口服预处理脾细胞对诱导异体神经移植免疫耐受的影响》文中研究表明目的:观察单纯通过口服紫外线B照射后的异基因脾细胞是否可以一定程度上阻止大鼠同种异体神经移植所引起的免疫排斥反应并诱导其免疫耐受产生的情况。方法:实验分叁组:Ⅰ组为自体神经移植组,将SD大鼠的同源基因坐骨神经移植给SD大鼠。Ⅱ组为新鲜同种异体神经移植组,不予任何预处理将SD大鼠的异基因坐骨神经移植给Wistar大鼠。Ⅲ组为预处理组,将经紫外线B照射后的SD大鼠的脾细胞经口服途径(灌胃)给Wistar大鼠。七天后再行同种异体神经移植手术。术后7天行外周血T淋巴细胞亚群检查,术后8周行移植神经组织学检查。结果:在坐骨神经移植术后一周行免疫学检查示,Ⅲ组较Ⅱ组外周血淋巴细胞的CD8~+T细胞的百分率增加、CD4~+T细胞的百分率减少、CD4/CD8比值变小,差异有统计学意义(P＜0.05),免疫排斥反应也明显低于新鲜同种异体神经移植组。术后8周,12周神经移植中段横切片低倍镜下显示:Ⅲ组再生入移植段内的神经纤维数量多,神经纤维之间可见新生的毛细血管,明显多于Ⅱ组。高倍镜下显示:有髓神经纤维呈圆形,每条神经纤维中央为浅蓝色圆形的轴突断面,其外粉红色网状结构即髓鞘。Ⅲ组中有散在的慢性炎症细胞如淋巴细胞、浆细胞。Ⅱ组较Ⅲ组慢性炎症细胞数量多。Ⅲ组纵切片上显示大量神经纤维、雪旺细胞和血管池。结论:口服来源的抗原在此处经抗原呈递细胞(主要是树突状细胞)处理呈递,诱发免疫耐受的发生。口服耐受是导致机体免疫耐受的重要方法,口服异基因脾细胞亦可以诱导器官移植耐受。所以经口服紫外线B照射去抗原的异基因脾细胞可以诱导对异体神经移植的特异性免疫耐受。
张业伟, 孙磊, 严栋梁, 刘允怡, 王太洪[6]2010年在《供者凋亡细胞静脉输注在异种肝移植中所产生体液免疫机理》文中提出目的以贵州香猪为供者、中国猕猴为受体的异种肝移植模型,采用静脉输注异种异基因骨髓及凋亡细胞的方法预处理受体,研究凋亡细胞对异种肝脏移植免疫排斥反应的影响,探讨异种肝脏移植免疫耐受的机制。方法受者猕猴随机分为A、B、C组,A组为阴性对照组,n=6;B组为实验对照组,n=28,在接受RIC之后,再接受供者贵州香猪的异种异基因骨髓(BM)静脉输注;C组为实验组,n=36,在接受RIC之后,再接受供者贵州香猪的BM和凋亡细胞同时静脉输注。观察各组受体的生存期,检测受体术后外周血中ALT、TB含量、Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞和T细胞亚群上GITR的表达,检测受体术后第14天移植肝的病理变化和术后第14天受体脾脏CTL杀伤活性。结果C组肝移植术后经历短暂排斥反应,最终可获免疫耐受并长期存活,其外周血中Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞表达比例在术后第14天渐恢复正常,受体外周血中CD3+CD4+T细胞上GITR表达降低,CD3+CD8+T细胞上GITR表达增加,提高CTL的杀伤活性;B组受体在术后第17~2 1天死亡,与A、C组相比,外周血血清中ALT、TB含量明显升高,而Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞比例明显降低。结论供者凋亡细胞静脉输注在异种肝移植中所产生体液免疫耐受的机理,可能是通过诱导受体外周血中CD3+CD4+T细胞上GITR表达降低,CD3+CD8+T细胞上GITR表达增加,提高CTL的杀伤活性来实现的。
宋宁霞[7]2010年在《小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响及机制探讨》文中研究说明小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响及机制探讨研究目的异基因造血干细胞移植是目前能够治愈白血病的一个重要途径,主要依靠移植前的强烈化疗和由供体免疫细胞介导的移植物抗白血病效应。然而,很大一部分患者在造血干细胞移植后由于白血病干／祖细胞的存在会导致疾病的复发,而增加放化疗的强度由于毒性反应的增加并不能提高生存率,因此,造血干细胞移植后的GVL效应尤为重要。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,大量的体内外实验及临床研究证实骨髓间充质干细胞有一定的免疫抑制作用,能够减轻异基因移植后的移植物抗宿主病。但是,MSC对白血病细胞的增殖究竟是抑制作用还是促进其增殖,或者对其无明显影响?对临床应用MSC与造血干细胞共移植治疗白血病有重要意义,目前这方面的研究较少,尚无定论。针对以上现状,本课题拟解决以下叁个问题：1、通过静脉输注少量A20细胞,建立微小残留白血病的异基因骨髓移植模型,研究静脉输注异基因骨髓MSC对异基因骨髓移植模型A20细胞增殖的影响；2、通过体外间充质干细胞与不同来源的白血病细胞共培养,观察间充质干细胞对白血病细胞增殖及其生物学特性的影响；3、建立A20皮下肿瘤模型,研究静脉输注和局部注射异基因骨髓源MSC对A20皮下肿瘤增殖的影响。从而为临床上造血干细胞和间充质干细胞联合移植治疗恶性血液病提供一定的实验依据。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞抑制异基因骨髓移植模型中A20细胞的增殖研究方法1、建立以C57BL/6小鼠为供体、致死剂量照射的BABL/c小鼠为受体的A20淋巴瘤／白血病异基因小鼠骨髓移植模型,按照移植当天分别输注的细胞种类骨髓细胞1×107/只、MSC 5×105/只及A20细胞1×104/只,共分成5组：PBS组(n=10)、单纯骨髓组(n=10)、MSC-骨髓组(n=10)、单纯A20白血病组(n=17)、MSC-A20白血病组(n=17)；2、观察移植后小鼠的一般状态、体重变化、生存率及小鼠死亡原因,绘制体重曲线、生存曲线及两组小鼠肝脾淋巴瘤发生率；3、分别于移植后第7、14天流式细胞术检测外周血T细胞亚群；4、肝、脾、小肠、肺脏病理切片观察A20细胞的脏器浸润及脏器损伤情况；5、PHK26标记MSC,荧光显微镜观察MSC的脏器归巢情况。结果1、异基因骨髓移植后28天MSC-A20组小鼠A20肝脾淋巴瘤发生率为58.82%,低于未输注MSC组(94.12%),统计学上有显着差异(P<0.05)；2、移植后第7天外周血T细胞亚群分析结果表明,MSC-A20组小鼠外周血中CD3+CD8+T细胞比例为(37.40±9.03)%,较未输注MSC组[(4.90±1.74)%]显着增加(P<0.01);MSC组CD3+CD4+T比例为(50.85±11.85)%,而CD4+CD25+T细胞比例则(1.88±0.43)%,显着低于未输注MSC组的(78.41±3.98)%和(4.73±1.67)%(P<0.05)。而移植后14天两组外周血T细胞亚群无显着差异；3、MSC-A20组小鼠的小肠、肺脏损伤情况较单纯A20组轻；4、MSC在移植后24小时能够归巢到脾脏和肾脏；移植后第7天能够归巢到脾脏、肝脏、肺和肾脏,可能具有向肿瘤部位及受损伤部位趋化的作用。第二部分小鼠骨髓间充质干细胞体外对白血病细胞增殖及生物学特性的影响研究方法1、复苏本实验室冻存的P10小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测细胞免疫表型；培养扩增mMSC,传代至P10-15消化后应用；MSC重悬后加入丝裂霉素(25μg/ml,孵育20min)去除MSC的增殖能力(MMC-MSC), PBS洗涤3次,完全培养液重悬备用。按照2×103/孔,5×103/孔,2×104/孔,5×104/孔分别接种于96孔板(n=6),与FBL3、A20、P388细胞共培养(MSC与白血病细胞比例分别为1：10,1：4,1：1,1：0.4)。同时设置单纯A20、FBL3、P388对照组及单纯MMC-MSC组,共培养44小时后CCK-8法检测MSC对白血病细胞增殖的影响。2、MMC-MSC按照2×104/孔接种于96孔板,与A20、FBL3、P388以1：1的比例分别共培养24h、48h、72h, CCK-8法检测MSC抑制白血病细胞增殖的时间依赖性；3、MMC-MSC按照4×104/孔接种于Transwell板中,Transwell小室中加入同样数量的CFSE染色的A20细胞,共培养48小时后检测MSC在Transwell中对A20细胞增殖的影响；4、MMC-MSC按照1×105/孔接种于6孔板中,完全贴壁后加入同样数量的白血病细胞(A20、FBL3、P388),共培养72小时后,收集悬浮的白血病细胞,流式细胞术检测白血病细胞早期凋亡率及细胞周期；5、MMC-MSC按照4×104/孔接种于Transwell板中,Transwell小室中加入同样数量的A20细胞,共培养72小时后,流式细胞术检测Transwell中MSC对A20细胞周期及早期凋亡的影响；6、MMC-MSC按照2×104/孔接种于96孔板,A20细胞以1：1比例与其共培养,分别设立MSC+A20细胞共培养组,Akt inhibitor+A20组,及MSC+A20+Akt inhibitor组,检测MSC抑制A20细胞增殖与Akt激酶的关系；7、MMC-MSC以1：1比例与白血病细胞共培养于6孔板中,72小时后收集对照组和实验组的白血病细胞,Real-time PCR方法检测MSC对白血病细胞p21、caspase 3基因mRNA水平的影响；8、MMC-MSC与A20细胞以1：1比例共培养于6孔板中,分别于24h、48h、72h后收集上清,ELISA方法检测MSC对A20细胞分泌细胞因子IL-10、TGF-β、TNF-α和IFN-γ的影响；9、两者共培养48小时后,收集实验组和对照组的A20细胞,流式细胞术以CD19设门,检测MSC对A20细胞胞内IL-10的影响。结果1、复苏及传代的MSC高表达CD29、CD44、Sca-1、MHC-1,中度表达CD13、CD90.2,不表达造血细胞表面标志CD117、CD45,不表达Flk-1、MHC-Ⅱ类抗原；且P15 MSC裸鼠体内无致瘤性；2、小鼠骨髓MSC在体外能够抑制不同来源的白血病细胞增殖,呈浓度依赖性,mMSC与A20、FBL3、P388共培养比例为1：0.4时,抑制效果最明显,与对照组相比,其相对增殖率分别为(78.32±9.16)%、(52.43±17.10)%、(58.47±5.68)%(P<0.01)；3、MSC对不同来源白血病细胞的增殖呈时间依赖性,随着共培养时间延长,MSC的抑制作用增强(P<0.05)；4、异基因小鼠骨髓MSC并非通过抑制Akt激酶而发挥抑制A20细胞增殖的作用(P<0.05)；5、MSC能够增加不同来源白血病细胞的早期凋亡率,与MSC共培养72小时后,A20、FBL3、P388细胞的早期凋亡率分别为(4.80±0.78)%、(12.88±2.78)%、(18.28±1.72)%,而对照组则分别为(1.06±0.21)%、(4.64±0.61)%、(7.70±0.61)%；6、MSC能够抑制不同来源白血病细胞的DNA合成,与MSC共培养72小时后,A20、FBL3、P388细胞的S期的比例分别为(45.77±1.56)%、(38.40±7.250%、(51.03±2.10)%,而对照组则分别为(62.93±1.20)%、(63.38±14.47)%、(56.27±0.55)%(P<0.05)；7、异基因小鼠骨髓MSC抑制A20细胞的增殖、阻滞细胞周期进展及促进A20细胞的早期凋亡作用需要两者直接接触；8、Real-time PCR检测结果表明小鼠骨髓源MSC能够增加不同来源白血病细胞p21、caspase3基因mRNA水平的表达(P<0.05)；9、异基因骨髓MSC能够减少A20细胞上清中IL-10的浓度,并呈时间依赖性,MSC与A20细胞共培养24h、48h、72h后上清中IL-10浓度分别为(236.99±15.91) pg/ml、(318.76±15.91) pg/ml、(680.41±78.07) pg/ml,而单纯A20组培养24h、48h、72h后上清中的IL-10浓度分别为(301.47±30.31)pg/ml、(554.62±19.79) pg/ml、(1892.97±176.22) pg/ml; MSC对A20细胞上清中TGF-p、TNF-α和IFN-γ水平无显著影响；10、小鼠异基因骨髓源MSC体外能够显着增加A20细胞胞内IL-10,与MSC共培养48小时后,流式细胞术检测A20细胞胞内IL-10较对照组显着增加,为(4.64±0.89)%,而未共培养组的A20细胞的胞内IL-10仅为(1.74±0.59)%(P<0.01)。第叁部分小鼠骨髓间充质干细胞对A20皮下肿瘤增殖的影响研究方法1、A20细胞以1×106/只接种于BABL/c小鼠或BABL/c裸鼠皮下,建立A20皮下移植瘤模型；根据MSC(5×105/只)与A20细胞同时皮下注射或者静脉注射于小鼠体内做如下分组：(MSC+A20)/SC组和MSC(IV)+A20(SC);而受体鼠则分别为BABL/c小鼠或BABL/c裸鼠；2、MSC局部注射的剂量降低为1×105/只,与A20细胞同时同部位注射于BABL/c小鼠或BABL/c裸鼠皮下；3、致瘤后检测指标：小鼠肿瘤发生时间、小鼠皮下肿瘤体积、小鼠肿瘤病理、肿瘤免疫组织化学PCNA、CD31及BABL/c小鼠致瘤后第7天外周血T细胞亚群。结果1、大剂量MSC与A20细胞同部位皮下注射于有免疫力的BABL/c小鼠,能够促进A20肿瘤的增殖,致瘤24天后(MSC+A20)/SC组小鼠平均肿瘤体积达(1511.43±467.85)mm3,而未注射MSC组小鼠肿瘤体积仅为(615.36±201.22)mm3(P<0.05); (MSC+A20)/SC组小鼠致瘤后第13天100%发生皮下肿瘤,而单纯A20组小鼠仅有83%的小鼠发生皮下肿瘤；第7天检测外周血T细胞亚群两组无显着差异(P>0.05)；两组小鼠肿瘤免疫组化分析表明,(MSC+A20)/SC组小鼠PCNA、CD31表达略高于单纯A20组；2、大剂量MSC与A20细胞同部位皮下注射于BABL/c裸鼠,能够促进A20皮下瘤的增殖,致瘤后20天MSC组小鼠的皮下肿瘤体积达(1993.34±1009.89)mm3,而未注射MSC的裸鼠皮下肿瘤体积仅为(604.88±235.92)mm3(P<0.05)；致瘤后16天MSC组小鼠即100%发生皮下肿瘤,而未注射MSC的裸鼠皮下发生率仅为40%；两组小鼠肿瘤免疫组化分析表明,(MSC+A20)/SC组小鼠PCNA、D31表达略高于单纯A20组；3、静脉注射MSC对BABL/c小鼠以及BABL/c裸鼠皮下瘤的增殖动力学及发生率均无显着影响；对BABL/c小鼠致瘤后第7天外周血T细胞亚群亦无显着影响。4、无论在BABL/c小鼠还是BABL/c裸鼠,小剂量MSC局部注射于A20肿瘤部位对局部肿瘤的发生率及肿瘤体积无显着影响。结论1、体外复苏传代的P10 mMSC细胞表面标志表达及细胞形态跟冻存前相同,培养扩增的P15 mMSC裸鼠体内无致瘤性,生物学特性稳定；2、静脉输注MSC能够抑制异基因骨髓移植后4周A20小鼠肝脾淋巴瘤的发生率,主要是通过增加外周血中CD3+CD8+T细胞比例,减少CD3+CD4+T和CD4+CD25+T细胞比例而发挥作用；3、在异基因骨髓移植的A20白血病小鼠模型中,静脉输注小鼠异基因骨髓MSC能够归巢到脾脏、肝脏、肺及肾脏,可能发挥修复照射损伤的器官及局部抗肿瘤的作用；4、小鼠骨髓源MSC体外能够抑制不同来源的白血病细胞增殖,呈浓度和时间依赖性；5、小鼠骨髓源MSC体外能够促进不同来源白血病细胞的早期凋亡、抑制白血病细胞DNA合成；6、MSC需要与白血病细胞直接接触才能发挥其增殖抑制、促凋亡及周期阻滞作用；7、小鼠异基因骨髓源MSC体外能够抑制A20细胞分泌IL-10;8、无论在有免疫力的BABL/c小鼠还是T细胞免疫缺陷的BABL/c裸鼠,大剂量异基因小鼠骨髓MSC局部注射于A20皮下肿瘤部位均能够促进肿瘤增殖,而静脉注射MSC则对皮下肿瘤增殖无显着影响,表明MSC静脉注射具有一定的安全性。
参考文献：
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[5]. 口服预处理脾细胞对诱导异体神经移植免疫耐受的影响[D]. 米睿. 山西医科大学. 2008
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[7]. 小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响及机制探讨[D]. 宋宁霞. 第二军医大学. 2010
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