（沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110016）
【摘要】采用免疫荧光法检测狂犬病毒株PV-2061株的病毒滴度，并将检测结果与小鼠进行比较，验证该方法的可行性。两名实验人员分别检测相同样品3次，比较两种方法的重复性与精密度。结果显示，免疫荧光法测得的结果与小鼠法结果趋势相同；重复性实验中，免疫荧光法的变异系数更低，表明重复性更好。免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，可广泛推广。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法
【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）33-0176-02
Feasibility of immunofluorescence assay for rabies virus PV-2061 strain
Li Shuang,Tian Wei(Correspondence author), Xie Hua,Li He.
Shenyang Pharmaceutical University Liaoning Shenyang 110016
【Abstract】The virus titer of rabies virus strain PV-2061 strain was detected by immunofluorescence, and the detection results were compared with mouse method to verify the feasibility of the method. Two experimenters tested the same sample three times to compare the repeatability and precision of the two methods. The results show that the immunofluorescence has the same trend as the mouse method. In the repetitive experiment, the variation coefficient of immunofluorescence method is lower, indicating that the repeatability is better. The immunofluorescence method can be widely used to detect virus titration, which is fast, accurate and precise.
【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent
狂犬病是一种人兽共患急性传染病，由狂犬病毒引起的，可导致严重的中枢系统疾病，又称恐水症，是死亡率高达100%的急性传染病，被传染病防治法列为乙类传染病。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。为保证狂犬疫苗免疫的有效性，开展对RV毒力的检测十分必要。本文旨在建立简单、快速、特异性好、敏感度高的免疫荧光的检测方法，对狂犬病毒PV-2061株进行检测。
1.材料和方法
1.1 主要材料
狂犬病毒PV-2061株：原始毒株来源于ATCC；Vero细胞：来源于中科院上海细胞库。FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体：购自美国Novus公司，浓度0.75mg/ml。
1.2 荧光抗体最佳工作浓度的确定
1.2.1荧光抗体稀释：用PBS将荧光抗体2倍系列稀释，取50×、100×、200×、400×、800×、1600×共6个稀释度。
1.2.2细胞培养：将Vero细胞稀释成1×105个/ml，加入到96孔细胞培养板中，100μl/孔，放二氧化碳培养箱中培养。
1.2.3加毒：取一批狂犬病毒样品，稀释成浓度为1×10-3。加入到已制备好的单层96孔板中，100μl/孔，放培养箱继续培养48h。
1.2.4固定：取出96孔板，弃培养基，PBS洗板3次，加冷丙酮，-4℃固定30分钟。弃丙酮，风干。
1.2.5加荧光抗体：加入2倍倍比稀释的荧光抗体，每个稀释度加一列8孔，50μl/孔。37℃湿育1h，PBS洗板3次，置荧光显微镜下观察。记录荧光病灶数，以出现“++++”的抗体最大稀释浓度为其最佳工作浓度。
1.3 免疫荧光测定法
1.3.1病毒稀释：将16批狂犬病毒样品10倍稀释，取6个稀释度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），接种到制备好的96孔板中，100μL/孔，每个稀释度加每列6孔，剩余2孔加培养基作为空白对照孔，培养48h。
1.3.2按1.2.4固定。
1.3.3荧光染色：加入最佳工作浓度的荧光抗体，50μL/孔。37℃湿育1h，洗板，镜下观察。记录荧光灶数，细胞浆内有绿色荧光颗粒者为阳性，正常细胞对照无特异性荧光为阴性，以Reed-Muench法计算病毒滴度。
1.4 小鼠测定法
将16批病毒样品10倍稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度，脑内接种小鼠，6只/稀释度，0.03ml/只。观察14d，计算结果。
1.5 重复性实验
采用两名实验人员在相同的条件下，分别用免疫荧光法和小鼠法检测同一批病毒滴度，每人检测3次，每个样品重复检测6次。
2.结果
2.1 免疫荧光抗体最佳工作浓度的确定，结果见表1
以荧光抗体清晰的显示特异性荧光，且荧光闪亮，空白对照的非特异染色弱的最大稀释比例为最佳工作浓度，本文选择100倍为最终的荧光抗体稀释倍数。
表1 荧光抗体工作浓度
图1 16批病毒样品的滴度结果
表3 重复性实验两种方法测得的病毒滴度
3.讨论
近年来随着科技的发展，针对病毒滴度的生物学检测方法越来越先进，但也有优势和局限性。小鼠法是《中华人民共和国药典》三部（2015版）[2]规定狂犬病毒的经典检测方法，但因其检测周期较长，动物个体差异影响实验结果等缺点，被细胞法取代是必然趋势。免疫荧光法是将荧光色素标记技术的灵敏性，再加上抗原抗体反应的特异性，两者结合的一种免疫检测技术。另外该法可精确计数被病毒感染的细胞个数，因此敏感性也很好。目前，国内也已经开始采用免疫荧光法控制狂犬病疫苗的生产过程[3]。本文采用两种方法检测狂犬病毒毒力，趋势相同，相比之下变异系数更小，且重复性和精密度更好。因此，免疫荧光法作为狂犬病毒滴度的定量测定是可行的，值得推广。
【参考文献】
[1]路明霞，殷大鹏．世界卫生组织关于狂犬病疫苗的意见书[J].中国疫苗和免疫，2008，14(2):187-188．
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].三部.北京:化学工业出版社, 2015.
[3]杨屹，汝东宇，郭秀侠，等.应用篮式生物反应器制备 Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2011,24（5）:583-585，589.
论文作者:李爽,田威(通讯作者),谢花,李鹤
论文发表刊物:《医药前沿》2018年33期
论文发表时间:2018/12/10
标签：荧光论文; 狂犬论文; 病毒论文; 免疫论文; 抗体论文; 浓度论文; 小鼠论文; 《医药前沿》2018年33期论文;