王莉[1]2004年在《侵袭性曲霉感染实验室检测的基础与临床研究》文中认为曲霉是自然界中广泛存在的真菌，是引起免疫抑制患者严重的深部曲霉感染的主要病原菌。因为恶性肿瘤、粒细胞减少或功能障碍、糖皮质类固醇、免疫抑制剂的使用等原因造成的患者免疫功能缺陷，是侵袭性曲霉病(IA)发病的高危因素，这些患者吸入烟曲霉孢子后，孢子可以从气管肺泡中侵入肺部造成初发的侵袭性感染，并常伴远隔器官的转移。近10年来，IA发病率不断上升，并成为免疫抑制患者死亡的主要原因之一。IA病死率可达到100％，造成这种高死亡率的原因之一是很难在IA的早期确定诊断，因此使有效的抗真菌治疗受到延误。有研究表明，在疾病早期进行诊断和治疗可以降低病死率。IA诊断困难主要因为其临床表现缺乏特征性，传统的真菌培养法和组织病理方法不能满足早期诊断的要求，因此需要建立新的、快速、高效的方法提高IA的诊断水平。其中，曲霉抗原和DNA检测因其快速、灵敏、特异性好引起了研究者的关注。 已有的血清学方法中，抗体检测方法的应用因患者存在免疫抑制，使抗体水平不能反映患者的感染情况而受到限制。循环中抗原检测方法虽然有优势，但由于方法学的不足未得到广泛开展。最近出现的半乳甘露聚糖(GM)检测的ELISA方法，利用大鼠单克隆抗体EB-A2检测曲霉属细胞壁特异性抗原GM，具有更好的灵敏性。 分子生物学技术的发展为病原微生物的检测开辟了广阔的前景，核酸扩增和杂交是这些检测方法的基本技术之一，PCR因为能扩增检测标本中极微量的细胞DNA而被广泛使用，扩增产物往往通过电泳、Southern blotting、PCR-EIA等方法检测。原位杂交则不需要DNA的提取，可以在组织标本原位中显示病原菌的存在。 这些新方法的发展和应用使得IA的早期诊断在近几年得到了长足进步，但是各研究报道的结果不完全一致，对这些方法的评价也不同。为进一步评价曲霉GM的ELISA检测和曲霉DNA PCR-种特异性探针的检测对IA诊断的意义，我们进行了如下研究：建立IA动物模型，用该方法检测血清和组织标本中的GM或真菌DNA，并探讨相关影响因素。同时收集健康人血清40例和器官移植、长期应用糖皮质激素、免疫抑制剂等免疫抑制患者的血清39例，进行ELISA和PCR-种特异性探针检测，并对病理证实IA感染的临床尸检和活检组织标本共39例进行PCR-种特异性探针检测。通过对以上临床标本的检测，评价这些实验室检测方法的临床价值。第叁军医大学博士学位 在动物实验中，对24只日本大耳白兔肌肉注封地塞米松进行免疫抑制，然后静脉接种烟曲霉抱子。在接种前和接种后24h、48h、万2h和%h分别取血清进行检测，血清ELisA检测可以在动物感染后24h检测到阳J性结果，该方法的敏感性和特异性分别为95%和78，9%。通过玻璃珠高频振荡法提取血清标本的真菌DNA，用一对真菌通用引物进行PCR扩增，产物用4种常见的种特异性探针:烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉探针进行斑点杂交，敏感性为80%，特异性为95.8%。血培养阳性率仅为5%。曲霉饱子接种后24h、48h、72h和96h分批处死务解剖动物，部分内脏组织匀浆后接种于SDA培养基，进行真菌学培养和CFU计数，结果显示血清中GM含量与病情发展一致。部分组织用福尔马林固定，石蜡包埋并切片，切片中提取的真菌DNA进行PCR一种特异性探针检测，敏感性和特异性分别为巧%和100%。动物组织标本的原位杂交结果显示6例标本均阳性，2例对照阴性。 将动物实验建立的方法用于临床标本。对侵袭性曲霉感染的高危人群进行EUSA检测，检测到阳性血清12，8%，健康人群中阴性血清为95%;PCR一探针杂交法为1 2.8%和97.5%。对组织病理证实的石蜡包埋组织的PCI卜探针杂交检测敏感性为66.7%，特异性为100%。 我们还建立了IA兔抗真菌药物静脉注射治疗模型，动物在接种烟曲霉后24h分别给予两性霉素B lmg瓜g·d、伊曲康哇巧mg瓜g或氟康哇20m叭g·d，给药5天后，检测治疗各组血清GM含量并与真菌负荷量和病死率比较，结果显示GM的水平与动物抗真菌治疗过程的病情变化一致。 上述研究表明，血清ELISA方法和PCR一探针杂交法可以快速高效的诊断动物的IA，动物实验显示其阳性率显着高于血培养的阳性率。血清GM抗原动态监测可以作为评价IA病情严重程度和抗真菌药物的疗效的指标之一。临床研究显示血清ELISA方法和PCR一探针杂交法可以用于对IA高危患者的监测。PCR一探针杂交在诊断的同时还可以鉴定曲霉到种。原位杂交法和PCR一探针杂交可用于石蜡包埋组织的诊断和回顾性研究。
沈洁[2]2018年在《鸡烟曲霉菌的分离及定量PCR检测方法的建立》文中提出曲霉菌病是人兽共患传染病,世界各国广泛流行。不仅对禽类造成感染,降低饲养效率;还会感染人,侵害多种器官。因此对鸡场进行真菌病调查;快速、准确的鉴定鸡烟曲霉菌,并建立特异、敏感、快速的诊断方法,对养鸡产业以及人类公共卫生都具有重要意义。经一年四季,采集鸡血清(共287份),用ELISA方法检测(1,3)-β-D葡聚糖(G试验)和半乳甘露聚糖(GM试验)。G试验结果显示血清阳性率呈季节性变化,以夏季最高(28.6%),其次为秋季(12.8%)、冬季(12.7%)、春季(12.0%)。GM试验结果与之相似。表明鸡真菌病呈季节性变化,夏季为主要流行季节。从河北省20个养鸡场分离疑似鸡烟曲霉菌7株。观察其形态,并提取分离株DNA,利用rDNA-ITS基因通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,测序后序列与GenBank核酸数据库进行BLAST比对。结果显示,分离株呈绒毛状、辐射状生长,菌落中央为墨绿色,周边为白色。显微镜下菌丝呈棉花样,孢子梗顶端分散着球形分生孢子,成绿色或深绿色。分离株与GenBank鸡烟曲霉菌的同源性在99.8%以上,与同属菌同源性在69.4%-85.4%之间。形态学观察结合rDNA-ITS基因序列分析,将7株分离株鉴定为鸡烟曲霉菌。利用细胞表面蛋白基因(cell surface protein CSP基因)对鸡烟曲霉菌进行分型。结果共分为4种基因型:t04A型(1株)、t09~c型(3株)、t18~b型(1株)和t22~b型(2株)。选用分离株(t09~c型)对5日龄雏鸡喉头滴注1.9×10~(9 )CFU/m L菌悬液100μL。分别采集2份病料,用作菌培养、制备病理切片,切片行HE、PAS、GMS、CFW染色。结果雏鸡接种后3 d出现呼吸困难等症状,解剖发现气囊增厚,肺充血有黄色斑点;病料中分离鉴定出烟曲霉菌;显微镜下,肺充血,组织结构消失,特殊染色病灶内有大量菌丝。这些提示成功建立烟曲霉感染鸡模型。根据Genbank已发表的benAfum基因序列设计一对特异性引物,在此基础上建立检测鸡烟曲霉菌SYBR Green I荧光定量PCR方法,并用该方法对鸡烟曲霉菌分离株进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对鸡烟曲霉菌最低检出量为3.76×10~1CFU/mL;重复性好,变异系数在0.7%-0.8%;特异性强,与黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、白色念珠菌等病原菌无交叉反应;该方法操作简单,耗时短,整个试验过程只需2h。提示该方法可应用于鸡烟曲霉菌感染的快速检测。针对鸡白色念珠菌rDNA基因和鸡烟曲霉benAfum基因保守序列,设计两对特异性引物,建立了检测鸡烟曲霉菌和鸡白色念珠菌SYBR Green I荧光双重定量PCR方法。结果显示在熔解温度84.5℃-85.0℃和82.0℃-82.5℃分别出现鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉菌特异波峰,且与其他真菌没有交叉反应;鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉重复试验变异系数分别为0%、0.2%;最低检测浓度分别为4.34×10~1CFU/mL、3.76×10~1 CFU/mL。这提示该建立双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法,特异、稳定、敏感,可用于鸡烟曲霉菌和鸡白色念珠菌的检测。将检测鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉菌双重定量PCR的试剂组装成试剂盒,用分离株和病料样品,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果均良好。
金欣[3]2009年在《侵袭性曲霉菌感染早期诊断的实验研究与临床应用》文中提出背景和目的曲霉是自然界中广泛存在的真菌,是引起免疫抑制患者侵袭性曲霉病(IA)的主要病原菌。IA主要发生在免疫低下患者,如急性白血病、骨髓干细胞移植、实体器官移植、恶性肿瘤化疗等。近年来的流行病学研究表明IA的发病率有逐年增多的趋势,在尸解病例中超过了念珠菌感染。本病的病死率很高,可达56.0%～88.1%。造成这种高死亡率的原因之一是IA的临床表现缺乏特殊性,传统的培养和组织病理学方法不能满足要求,其早期诊断十分困难。因此,如何提高IA的早期诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题。目前研究最多也最有发展前景的是血清学方法和分子生物学方法,简称非培养诊断。为了提高实验室早期快速检测水平,本课题对血清半乳甘露聚糖抗原(GM)检测,血浆(1,3)-β-D葡聚糖(BG)检测及SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测曲霉菌DNA的叁种诊断方法在IA早期诊断中的临床价值进行了研究,为临床及时合理用药提供依据。方法和结果GM检测方法与结果如下:①用双夹心酶联免疫吸附试验连续检测临床真菌感染高危患者291例,每周检测两次,共1236份血清标本。根据回顾性诊断标准,将实验对象分为确诊IA(60例)、可疑IA(64例)和排除IA(167例)叁个类别。②对叁组患者粒细胞减少时间、强效免疫抑制剂使用和移植物抗宿主病等危险因素分布进行比较,结果无显着性差异。③比较阳性界值分别为1.5、1.0和0.5时各项诊断指标的差异,最终确定GM检测的阳性界值为0.5时各项指标相对较理想。根据确诊IA和排除IA组的GM检测结果得出本方法(cutoff 0.5)的敏感性91.7%,特异性92.2%,阳性预测值(PPV) 80.9%,阴性预测值(NPV) 96.9%。④GM检测与传统检测方法比较发现,GM检测阳性早于痰培养、影像学诊断2～8天。⑤以GM检测阳性为起点(cutoff 0.5)对真菌感染高危患者给予伏立康唑、伊曲康唑等抗曲霉抢先治疗,病死率可减少至13.5%。采用GM检测结果指导抢先治疗可减少部分患者经验性抗真菌治疗和药物毒性。⑥血清GM水平会随着IA病情的进展而增加,也会随着抗真菌治疗有效而下降,并与预后密切相关。BG检测方法与结果如下:①采用北京金山川公司的MB-80微生物快速检测系统检测上述291例患者血浆标本BG含量,以20pg/ml为阳性界值,根据确诊IA组、确诊侵袭性真菌感染(IFI)组和排除IFI组,计算本方法对IFI的敏感性为85.6%,特异性为75.0%,PPV为73.5%,NPV为86.5%,对IA的敏感性为80.0%,特异性为75.0%,PPV为61.5%,NPV为88.2%。②以20pg/ml为BG检测的阳性界值,0.5为GM检测的阳性界值,对60例确诊IA患者和120例非IFI患者的BG和GM两种血清学检测方法进行检测比较,在60例确诊IA患者中BG或GM阳性为96.7%,而BG和GM均阳性为66.7%,在120例非IFI患者中BG或GM阴性为100%,而BG和GM均阴性为70.8%。研究结果提示联合检测可提高IA诊断的敏感性,而BG和GM均阴性可基本排除IA。③对假阳性研究结果提示使用甘露聚糖肽可导致BG检测异常增高,但GM检测结果仍为阴性。PCR检测方法与结果:①在NCBI的Genebank数据库中查找相关真菌、细菌及人类的18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA以及ITSI、ITS11基因序列。通过Vector NTI 8软件进行多序列比对后,针对曲霉菌rDNA基因的转录间隔区ITSI设计引物,可特异扩增出多种曲霉菌菌株。②建立了适合临床实验室采用的简便可行的曲霉菌DNA提取方法,所获得的DNA用于普通PCR和实时荧光定量PCR分析都获得了较好的结果。③以烟曲霉为研究对象,建立利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR快速检测曲霉菌的技术平台。用该方法对烟曲霉孢子悬液进行检测,结果证明能很好的区分不同DNA浓度,检测灵敏度为10fg/ml。④在实验室条件下初步建立了DNA提取,定量PCR及结果分析的检测程序,并对临床血清标本进行检测评估其应用价值。研究结论根据GM检测结果,可以认为①与cutoff 1.5和cutoff 1.0相比,以cutoff 0.5为阳性界值,并作为微生物学诊断标准之一有助于早期诊断。②对高危IA感染患者的GM定量检测表明,该检测具有良好的敏感性、特异性、PPV和NPV,是一种早期诊断IA感染的手段。③血清GM阳性结果常常在临床症状和影像学诊断之前出现,有助于选择更有效的抗真菌治疗。阴性结果为进一步的诊断性检测或者选择经验性的抗曲霉菌治疗提供依据。④GM检测对于血液病或恶性肿瘤患者抢先治疗具有很好的指导意义,连续监测GM水平可判断治疗效果。根据BG检测结果,可以认为①BG检测作为一种新的诊断IFI的无创性检测手段,有较好的敏感性和特异性,可作为临床高度怀疑深部真菌感染患者初筛诊断方法。②BG与GM联合检测可提高IA诊断的敏感性,而BG和GM均阴性基本可排除IA。根据PCR检测结果,可以认为①建立了适合定量PCR检测的曲霉菌DNA提取方法,初步建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测曲霉菌感染的技术。②该方法对于未进行抗真菌治疗的高危患者IA的筛检有一定的辅助诊断价值。
沈银忠, 卢洪洲[4]2009年在《侵袭性真菌感染的分子诊断现状》文中研究说明近年来侵袭性真菌感染的发病率不断升高,侵袭性真菌感染的早期、准确诊断对于合理选用抗真菌药物,提高抗真菌疗效至关重要。另外,及时诊断侵袭性真菌感染可以减少经验性抗真菌治疗,降低抗真菌药物的选择性压力,从而减少真菌耐药性的产生。传统的诊断方法如真菌直接镜检、
刘亚迪, 朱骏, 杨一宁, 卫菊, 魏道林[5]2014年在《GM抗原检测对血液病患者侵袭性曲霉病的诊断价值》文中提出目的:探讨血清半乳甘露聚糖(GM)抗原检测对于血液病患者侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的早期诊断和疗效评价的临床意义。方法:选取137例具有侵袭性真菌病IFD高危因素患者的468份血清标本,进行GM试验,检测抗真菌治疗前后GM抗原水平的变化,同时收集患者的临床资料,进行统计学分析,并评价GM检测对于血液病患者IA的诊断价值。结果:以GM检测单次I≥1.0作为阳性界值时,本试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为90.91%,95.65%95.24%和91.67%,与试剂盒提供的血清GM试验结果的单次I≥1.5的阳性界值相比敏感性明显提高,而特异性无明显降低,因此能够有效区分临床诊断和拟诊两个IA级别。在其他实验室检测和影像学检查的基础上加入GM试验后,IA临床诊断组的人数明显增加。诊断级别与I值总体均数的分布具有相关性,回顾性确诊IA组、回顾性可疑IA组、回顾性排除IA组的I值呈现明显的由高到低的群落分布,且叁个诊断级别的I值分布范围的差异有统计学意义。根据阳性界值标准I≥1.0,GM试验阳性早于痰培养阳性平均7.73±8.71 d,也早于CT影像学证据平均6.89±8.02 d。基于GM值阳性时的抢先抗曲霉治疗组的有效率明显提高(P=0.039)。结论:血清GM抗原检测是早期诊断IA的一种有效方法,将单次I≥1.0作为阳性界值具有较好的敏感性和特异性,在阳性检出率和阳性检出时间方面较主要影像学表现和微生物学证据具有一定优势。在高危血液病伴粒细胞缺乏患者中根据GM试验阳性进行抢先抗曲霉治疗,可提高治疗有效率,监测血清GM浓度的动态变化具有评价疗效的重要价值。该研究成果对临床侵袭性曲霉病的诊断和治疗具有一定指导意义。
曹楠楠[6]2012年在《利用高分辨熔解曲线分析技术快速检测鉴定四种临床常见侵袭性曲霉菌的方法学研究》文中研究表明侵袭性真菌感染是免疫力低下病人不得不面临的严峻挑战。近些年,肿瘤,艾滋病,器官移植等免疫低下病人的侵袭性真菌感染率不断上升,且死亡率极高。临床上侵袭性真菌感染的常见病原多为念珠菌属,但隐球菌尤其是新生隐球菌,丝状真菌尤其是曲霉菌属等条件致病性真菌感染的发生近年来也呈逐年上升趋势。对于这些感染的临床治疗而言,治疗效果很大程度上取决于病人的免疫力状况及能否及时给与准确有效的抗真菌药物。目前临床上常用的抗真菌药物主要有两性霉素B,酮康唑,氟康唑,泊沙康唑、卡泊芬净等。有文献报道,临床上分离到越来越多的对唑类抗真菌药物和两性霉素B耐药的曲霉菌株,因此有必要研究一种能够快速检测鉴定临床常见曲霉菌的方法,为临床进行更有效的侵袭性曲霉菌感染治疗提供参考。高分辨熔解曲线分析技术的基本原理是在PCR完成后,升高PCR体系温度,利用双链DNA饱和荧光染料,实时监测升温过程中双链DNA饱和荧光染料与体系中DNA双链的结合情况(仪器上反映为荧光信号的变化),达到DNA双链序列分析的目的。双链DNA饱和荧光染料的结合原理与传统的荧光定量PCR染料不同。传统的荧光染料如Sybr Green等属于不饱和荧光染料,体系中此种荧光染料存在对PCR反应有抑制作用,因此在体系中加入的不饱和荧光染料浓度很低,远远低于产物DNA双链结构中染料结合位点的数目,DNA双链结构中存在大量的空余荧光染料结合位点。PCR过程完成产生大量的产物DNA双链,荧光染料分子结合在产物DNA双链上的染料结合位点。随着体系温度逐渐升高,体系中的DNA双链开始变性解链,荧光染料分子逐渐离开DNA双链结合位点,反映为荧光信号的逐渐降低。Sybr Green等不饱和荧光染料分子在离开DNA双链的过程中会发生分子结合位置的重排,因DNA解链而离开的不饱和荧光染料分子会迅速重新结合到尚未解链的其他双链部分上空余染料结合位点,荧光信号的变化失真,不能准确反映体系内DNA双链的解链情况。而饱和荧光染料如LC Green等对PCR反应基本无抑制作用,PCR体系中荧光染料的添加量远远高于体系中DNA双链上的染料结合位点数目,DNA双链上不会存在空余的染料结合位点,解链过程中能够最大程度上减少染料分子重排。体系温度升高,体系中DNA双链变性解链,饱和荧光染料分子与解链的DNA双链解离,因其他尚未解链的DNA双链上不存在空余结合位点,解离的染料分子不会重新结合到双链DNA上,荧光信号的变化能够真实反映体系中双链DNA的解链情况,使利用熔解曲线进行序列分析成为可能。不对称PCR扩增技术(asymmetric PCR)顾名思义,不对称PCR方法中两种引物的量相差悬殊,通常1：5-1：100不等,其中量相对较少的引物称为限制引物,相对过量的引物称为过剩引物。不对称PCR体系在反应的前几十个循环中同时存在正向引物和反向引物,可以生成一定数量的双链产物,经过15-30个循环左右,浓度相对较低的限制引物消耗完全。在PCR反应的后面几十个循环中,体系中仅存在过剩引物。过剩引物在体系中扩增产生大量的单链DNA。在高分辨熔解曲线的基本分析原理和不对称PCR扩增技术的基础上,引入非标记探针技术,是对高分辨熔解曲线技术的一种延伸和应用。非标记探针是长度在20-40bp左右的3’端封闭阻止延伸的一段寡核苷酸链。与传统的荧光探针相比,非标记探针寡核苷酸链只需要在探针的3’端进行封闭阻止其在PCR过程中发生自身扩增,而无需任何荧光基团修饰。在PCR反应完成后,进行一个变性,复性的基本过程,探针结合到单链产物上,形成局部双链结构。再进行升温变性,采集荧光信号,在相对较低的温度时,探针与产物结合形成的局部双链结构发生解链,反映为荧光信号降低,产生探针熔解峰。继续升温,PCR体系中产生的目的DNA产物发生熔解解链,荧光信号降低明显,产生产物熔解峰。通过分析探针峰和产物熔解峰的熔解温度(melting temperature, Tm),使序列分析更加敏感,特异。在本研究中,我们将高分辨熔解曲线分析技术,非标记探针技术和不对称PCR技术引入四种临床常见曲霉菌的检测鉴定中,试图探索一种快速,准确,经济的曲霉菌病原检测鉴定方法。第一部分“高分辨熔解曲线分析通用真菌引物扩增片段检测鉴定四种常见曲霉菌”研究方法查找GeneBank中公布的隐球菌属,念珠菌属,曲霉菌属,青霉属等多种临床常见真菌及人类的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITS1、2基因序列。通过Clustal X软件比对找出与人类无序列同源性的真菌保守区段。以真菌核糖体RNA基因中的内转录间隔区2(ITS2)为靶基因,在5.8S和28S核糖体RNA基因上设计真菌通用引物,在BLAST中比对其特异性。利用设计的真菌通用引物扩增四种曲霉菌的ITS2段,将扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。选择烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉ATCC标准菌株、临床常见多种细菌和人DNA进行引物特异性检测。选择对荧光定量PCR和高分辨熔解曲线分析有较大影响的因素,如退火温度,引物浓度,Mg2+浓度等进行体系的优化。以烟曲霉ITS2PCR合成产物构建载体克隆进行灵敏度检测。将构建成功的质粒,按照1：10倍比稀释,稀释9个浓度梯度,在各浓度取1ul进行荧光定量PCR扩增。实验结果1、设计的引物序列PrimerF-AGCGAAATGCGATAASTARTGTG, PrimerR-TCCTCCGCTTATTGATATGC,扩增片段长度335bp。2、引物特异性检测结果可见只有相应的四种曲霉菌有扩增条带,细菌及人DNA均未扩增。3、该方法的检测限可达10copies/ul.4、高分辨熔解曲线分析结果显示,烟曲霉,黄曲霉,土曲霉,黑曲霉四种曲霉菌的熔解曲线形状和Tm值差异较大。结论此部分的研究证实,四种曲霉菌的ITS2段靶基因熔解曲线差异大,通过这种方法不需测序可以将四种曲霉菌鉴别出来。若将此方法扩展至其他临床病原真菌,建立临床病原真菌的熔解曲线标准库。只需要基本的PCR引物,待测菌株DNA模板,LC Green饱和荧光染料,和能够进行高分辨熔解曲线分析的仪器,在熔解曲线分析完成后,将待测菌株扩增产物的熔解曲线与熔解曲线标准库中的曲线进行比对,在一定程度上能够将熔解曲线标准库中已存在熔解曲线比对标准的临床病原真菌待测菌株快速检测鉴定出来,具有省时、省力、省钱的特点。第二部分“四种特异性非标记探针结合高分辨熔解曲线检测鉴定四种常见曲霉菌”研究方法根据核糖体RNA基因的内转录间隔区2可变区序列设计四种曲霉菌的种特异性探针,并将探针的3,端进行C6氨基化修饰封闭以阻止在体系中DNA聚合酶的作用下探针自身扩增延伸。在Oligo6.0和Primer Express3.0软件中评价引物与探针,在BLAST中比对探针与引物的特异性。利用第一部分中设计的通用真菌引物进行不对称PCR。PCR完成后,加入四种曲霉菌特异性非标记探针,再经过变性复性,使探针与产物单链形成局部双链结构,进行熔解曲线分析.选择对不对称PCR体系有较大影响的退火温度,引物浓度,引物比例,Mg2+浓度,探针浓度等因素优化体系。退火温度由50℃递增至65℃,引物浓度由0.1μmol/L逐渐递增至0.5μmol/L,上下游引物比例由1：2递增至1：20及2：1递增至20：1,探针浓度由0.05μmol/L递增至0.5μmol/L,Mg2+浓度由0.5mmol/L递增至5mmol/L进行体系优化。实验结果1、优化后最终的体系组成和反应条件为：5×PrimeSTAR Buffer,4μl；Mg2+lmmol/L, dNTP Mixture(各2.5mmol/L),1.6μl；引物F,0.25μmol/L;引物R,0.05μmol/L; PrimeSTAR HS DNA Polymerase,0.2μl；LC Green染料,1μl；四种探针各0.25μmol/L。模板,1μl；及去离子水,体系总体积20μl。PCR条件：98℃,10s;60℃,10s；72℃,18s；循环数60,PCR扩增完成后进行一个变性复性的过程以促进探针与产物单链的结合。98℃,60s,40℃,30s。经过变性复性过程使3’端封闭的探针与产物单链结合后,设置熔解起始温度为55℃,结束温度为98℃,保持温度为53℃。2、四种曲霉菌模板相应的非标记探针熔解曲线分析都出现了两座熔解峰。根据第一部分中四种曲霉菌真菌通用引物扩增片段高分辨熔解曲线分析结果可知,ITS2扩增产物片段的Tm值介于90℃-95℃之间,故Tm值介于90℃-95℃之间的熔解峰使不对称PCR扩增的前几十个循环产生的双链产物的熔解峰,即产物峰。根据软件评估可知,探针的Tm值高于75℃。故图中Tm值介于82°C-87℃之间的熔解峰为非标记探针与不对称PCR扩增的后几十个循环,浓度相对较低的下游引物耗尽时,由浓度相对较高的上游引物扩增得到的单链产物结合形成的局部双链结构的熔解峰,即探针熔解峰。探针峰与产物峰之间的Tm值差异明显。讨论由于核糖体RNA基因的内转录间隔区2同时包含着可变区和中度保守区序列。根据GeneBank中已公布的烟曲霉,黄曲霉,土曲霉,黑曲霉菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2序列发现,内转录间隔区2的可变区中不仅存在着种间差异,也存在着种内序列差异,长度由1-3bp不等。饱和荧光染料高分辨熔解曲线可检测出低至1bp的碱基差异。由于种内序列差异的存在,使得高分辨熔解曲线的形状和Tm值可能发生变形和移动,给鉴定带来一定的困难。我们根据四种曲霉菌的核糖体RNA基因的可变区ITS2区序列,设计了具有曲霉菌种特异性的探针,并将探针的3’端进行C6氨基修饰阻止探针与模板结合后发生延伸。加入不同浓度的上下游引物,进行不对称PCR。不对称PCR完成后,体系中存在两种PCR产物,一种是在PCR过程的前几十个循环产生的正常的双链目的产物,一种则是在浓度相对较低的引物消耗完全后,由浓度相对较高的引物在PCR过程的后几十个循环产生的大量单链产物。经过变性复性过程,探针与PCR过程的后几十个循环产生的大量产物单链结合形成局部双链结构,探针-产物单链形成的双链结构经过升温变性产生探针峰,而由PCR过程的前几十个循环产生的双链产物在升温变性过程中产生产物峰,通过分析探针峰和产物峰的峰形和Tm值,达到检测鉴定四种曲霉菌的目的。利用曲霉菌的种特异性探针,分析探针与单链产物形成的双链结构熔解产生的探针峰,使我们不需要建立曲霉菌熔解曲线标准库就可以鉴定出曲霉菌的种属。更重要的是,引入非标记探针,能够克服曲霉菌的核糖体RNA基因的内转录间隔区2可变区种内序列差异可能造成的产物熔解曲线的变形和偏移,大大的提高了实用性和准确性。通过对探针的3’端进行封闭,而不需要对探针进行荧光基团标记,可大大的节约成本。
郑冰, 应春妹[7]2010年在《聚合酶链反应在侵袭性曲霉病诊断中的应用》文中认为近年来,由于器官移植术的普及、免疫抑制剂的使用以及恶性肿瘤和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的不断增加,曲霉感染率不断上升。由于曲霉感染患者的临床表现缺乏特征性,仅凭临床表现很难早期诊断,需要有快速、特异、敏感和简便的实验室检测。聚合酶链反应(PCR)因其
徐明珠[8]2009年在《恶性血液病患者侵袭性曲霉菌感染的早期抗原和分子生物学诊断研究》文中研究说明目的:(1)评价曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(GM)、1,3-β-D葡聚糖抗原(BG)及Real-Time PCR检测方法对恶性血液病患者侵袭性曲霉菌感染(IA)的诊断价值以及这些方法在监测抗真菌治疗效果中的作用。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)法、比色测定法以及Real-Time PCR叁种方法检测197例白血病和行造血干细胞移植患者的613份血清标本的GM、BG浓度以及曲霉菌DNA拷贝数,其中GM试验阳性定义为连续两次不同时点检测A值>0.5或单次>0.8,BG试验阳性定义为>80pg/ml ,Real-Time PCR以标本两孔Ct均值≤30定义为阳性。并根据我国制定的血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染(IFI)的诊断标准与治疗原则为标准,将研究对象分为:确诊、临床诊断、拟诊及非真菌感染四个类别,分别研究和对比叁种诊断试验的评价指标。结果:共收集197例白血病和进行造血干细胞移植患者的613份血清标本。其中包括确诊IFI3例其中确诊IA 1例,临床诊断IFI66例其中确诊IA 52例,拟诊IFI52例,排除IFI76例。(1)按照试验中界定的界值,GM试验的敏感度为81.1%,特异度为88.2%,,阳性预测值为90.2%,阴性预测值为86.5%,在全部分组中BG试验的的敏感度为89.9%,特异度为85.5%,阳性预测值为84.9%,阴性预测值为90.2%,两试验的假阳性率分别为12.8%,14.5%,差异无统计学意义(P>0.05),两者假阳性患者的分布差异有统计学意义(P<0.05)。联合两种检测方法则可明显改善试验的特异度(98%)及阳性预测值(98%),而对试验的特异度及阴性预测值无影响。(2)Real-Time PCR以标本两孔Ct均值≤30定义为阳性,其敏感性为90.6%,特异性为80.3%,阳性预测值为76.2%,阴性预测值为92.4%,诊断符合率84.5%。(3)叁种检测方法联合的诊断评价,以确诊及临床诊断IA患者为真阳性组,以排除IFI患者为阴性组。显示叁者联合的敏感度为100%,特异度为78.5%,阳性预测值为75.1%,阴性预测值为100%,叁者联合,诊断的敏感度明显提高,特异度仅轻度下降。(4)本研究中的前瞻性研究发现,叁种检测方法阳性结果出现均比临床痰培养及典型影像学表现要早(表3.6),Real-time PCR结果提示阳性较GM,BG抗原检测要提前,但t检验P=0.824,P=0.641,差异均无统计学意义。(5)38例完成针对曲霉菌感染抢先治疗的患者,按疗效分为有效组及无效组,分别于静脉抗真菌药物使用前-3、0、3、7、11、15d ,6个时点检测GM,BG,Ct均值,结果如下:a.治疗有效组GM值呈下降趋势并降至正常,治疗无效组GM值反而上升。对无效组与有效组在不同检测时点GM值总体分布位置进行Wilcoxon秩和检验。有效组与无效组在治疗前GM值分布无差异(P=0.864),在治疗7 d后其检测值分布差异有统计学意义(P<0.05)。b. BG抗原在治疗过程中的变化趋势与GM在治疗过程中的变化趋势类似。c.Real-time PCR:在临床及微生物学依据出现之前,Ct值的均值有下降趋势,进行抗曲霉抢先治疗后,治疗有效组其Ct值迅速上升,治疗无效组其Ct值起始亦有上升趋势,后Ct值又有下降趋势,治疗前有效组与无效组Ct值差异无统计学意义(P>0.05),治疗后在各检测时点其Ct值差异亦无统计学意义(P>0.05)。因此,动态检测GM,BG抗原对抗真菌疗效的评价有着一定的意义,而动态监测Ct值对评价疗效无显着性意义。结论:血清BG,GM抗原检测以及实时荧光定量PCR可以为早期诊断IA提供有力证据,联合BG,GM抗原两种检测方法有利于判断假阳性试验结果,动态检测GM、BG抗原水平,有利于判断疗效及预后;Real-Time PCR,以标本两孔Ct均值≤30定义为阳性,可以获得较高的敏感度及特异度,动态监测Ct值对评价疗效无显着性意义。
张梦宇[9]2007年在《侵袭性曲霉菌感染实时荧光定量PCR检测新技术的建立及临床应用》文中指出研究背景近年来，随着器官移植和血液恶性肿瘤病人数量的不断增多，免疫抑制剂的广泛应用，重症免疫低下患者数目呈几何爆发趋势。机会致病菌曲霉菌所致的感染发病不断上升，已成为仅次于念珠菌感染的第二大深部真菌病。曲霉感染的病死率可达40％以上，晚期衰竭病人合并曲霉菌感染的病死率高达80％～100％，患者存活主要依赖于早期明确诊断和及时恰当的抗真菌治疗。而传统的实验室诊断包括真菌的培养、影像学诊断，不仅耗时较长，而且缺乏敏感性，所以探索一种检测曲霉菌快速可靠的方法已经成为临床实验研究的热点问题。研究目的在广泛复习国内外相关研究文献的基础上，通过自行设计引物、探针，建立简捷、经济的提取曲霉菌DNA的方法。以期提供适合国内临床需要的快速诊断曲霉菌感染的Real-time PCR标准化方案，为临床诊断提供参考。对收集的临床高度疑似曲霉菌感染病人的血标本进行单盲检测，评价其临床诊断效能。把实时荧光定量PCR与临床常用血清学方法检测结果进行比较，得出结论。同时探讨抗真菌药物对检测结果的影响，找出最适合的检测时机，提高检测阳性率，指导临床抽血检验。研究方法①荧光定量PCR检测方法的建立：在NCBI中的Genebank中查找相关菌属及人类的18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列。通过BLAST比对找出各菌属间特异、曲霉菌属内保守的基因区间。通过ABI Primer Express 2.0软件设计引物、探针。建立阳性克隆质粒：在选定的荧光探针靶基因的上下游设计引物，扩增片断长度在200～300bp。用普通PCR在烟曲霉标准菌珠基因组中进行特异性扩增，纯化产物，将此产物连接到pMD19-T vector中，得到重组克隆质粒，送往测序。证实后用于制作实时荧光定量PCR的标准定量曲线及阳性对照。取标准曲霉菌菌株制成悬浊液，摸索最佳的曲霉菌DNA提取方法，并进行重复性试验、最低检测下限及方法特异性的实验评价。②实时荧光定量PCR方法诊断效能的临床评价：收集2006年4月至2007年2月，广州南方医院高度疑似曲霉菌感染病例71例，标本232份。分成5批检测，每批随机抽得标本，编号，用荧光定量PCR单盲检测，后与临床病人信息核对，评价该方法的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值。同时用x~2检验(McNemar检验)与临床常用血清学方法—曲霉菌抗原(ELISA)检测进行对比。通过分析抗真菌药物使用前后患者检测结果的改变，找出抗真菌药物对荧光定量PCR检测结果影响的规律，以及其检测结果对病人预后的提示作用。研究结果①荧光定量PCR检测方法的建立：成功建立荧光定量PCR检测侵袭性曲霉菌感染的方法。针对曲霉菌rDNA基因的转录间隔区ITSⅠ设计引物、探针。扩增片段长79bp。对构建好的克隆质粒测序，插入片段与预期片段序列一致，相似性达99％。阳性克隆倍比稀释制作荧光定量PCR的定量标准曲线：Y=-0.37X+16.05，R~2=0.997。荧光定量PCR的重复性好，平均试验内变异系数分别为1.89％、1.56％、2.57％。平均试验间变异系数为3.32％、3.58％、4.50％。该方法最低检测下限达5～10CFU／ml，对白色念珠菌、隐球菌、毛霉菌、根霉菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检测结果均为阴性，无非特异性扩增。②实时荧光定量PCR方法诊断效能的临床评价：71个病例中确诊10例，临床诊断30例，拟诊8例，非曲霉菌感染病例23例。232份标本中荧光定量PCR检测阳性率为42.2％(98／232)。该方法的敏感度为80％～87.5％，特异度为95.6％(22／23)，准确度为90.1％～90.7％。阳性预测值为88.8％～97.6％，阴性预测值为75.8％～91.7％；与曲霉菌抗原检测比较，两者的敏感度无统计学差别(P=0.549(双侧)，P＞0.05)：两者特异度比较中，P=0.021(双侧)，P＜0.05，特异度差异有显着性意义，荧光定量PCR的特异度较高。③抗真菌治疗对荧光定量PCR方法的影响及意义：临床上抗真菌治疗对荧光定量PCR检测结果有较大影响。临床经验性抗真菌药物的使用可使荧光定量PCR结果呈现假阴性。研究发现，侵袭性曲霉菌感染病人经药物治疗后，约60％～70％病人血标本荧光定量PCR检测结果转为阴性。为提高检出率，早日明确诊断，故建议在病人未使用药物治疗之前抽血送检。此外，一些曲霉菌感染的病人在停用抗真菌药物之后，有很大的复发可能，在治疗前后，连续动态监测病人血中曲霉菌DNA是必要的。荧光定量PCR结果持续阳性，往往提示病人预后很差，病死率较高(6／8)。研究结论①成功建立侵袭性曲霉菌感染荧光定量PCR检测新技术：自主设计的检测曲霉菌特异性的引物探针，达到了国外相关研究的水平，有较高的敏感度、特异度。同时，建立了适合临床实验室采用的简单、快速、经济的提取曲霉菌DNA的方法。构建了含有目的扩增片断的阳性质粒做为阳性对照，为产品形成试剂盒打下基础。②完成侵袭性曲霉菌感染荧光定量PCR检测新技术的临床效能评价：检测临床高度疑似曲霉菌感染病人血清，有较高的准确度及阳性预测值。该方法对重症免疫低下患者曲霉菌感染的早期诊断有很大的提示作用。与血清学方法相比，荧光定量PCR检测结果具有更客观可靠、易于判断等优点。该项技术有待进一步标准化，为今后国内同类研究提供一定的参考依据。它的较广阔的临床应用前景，有望早日投入市场，为广大患者服务。课题的创新之处(1)通过特异性引物、探针的设计，建立具有自主知识产权的曲霉菌荧光定量PCR检测新技术。(2)建立适合临床实验室采用的提取曲霉菌DNA方法。(3)曲霉菌荧光定量PCR技术可同时检测包括烟曲霉菌在内的5种常见曲霉菌(黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)，覆盖面全。(4)比较荧光定量PCR方法与血清学方法对临床病例标本诊断效能的差异，对荧光定量PCR方法进行了较全面的诊断效能评价。
宋秋荷[10]2004年在《两种单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立》文中研究指明目的:目前,念珠菌已经成为医源性感染中常见的病原菌,而白念珠菌又是念珠菌感染中居首位的病原菌。白念珠菌不仅可以引起机体皮肤和粘膜的损害,还可以导致系统性的感染。白念珠菌粘附、定殖于宿主的内皮细胞或粘膜的表面,进一步达到侵袭宿主的目的。能够快速、早期地诊断白念珠菌系统性感染对指导临床的治疗有着重要意义。现阶段对白念珠菌系统性感染的诊断方法,尤其是能早期、敏感而特异性的检测,仍然是缺乏的。临床研究已经把注意力集中于检测患者血液中的白念珠菌特异性抗原成分及其代谢产物上。本研究目的在于制备两种抗念珠菌特异抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立快速、早期诊断系统性念珠菌感染提供新的实验室检测方法;同时也初步探讨抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体在体外试验中抑制白念珠菌相变的作用。方法:分别用酵母菌烯醇化酶和带芽管白念珠菌标准菌株{ATCC-90028}孢子作为抗原,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备出抗烯醇化酶和抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对两种杂交瘤细胞株进行相关鉴定;通过体外白念珠菌芽管诱导抑制实验,观察抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体能否抑制白念珠菌芽管形成,影响白念珠菌菌相的转换,并对实验数据进行统计学处理。结果:建立了2株分泌抗烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Mab03.3G5-F3-F5、Mab03.4G6-F3-C7,并对Mab03.3G5-F3-F5单抗进行鉴定。小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:12800以上;单克隆抗体的重链属于IgG1亚类,轻链属于κ型;Western Blotting显示这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体皆能与烯醇化酶抗原(48kD)特异性地结合,证实是抗烯醇化酶的单克隆抗体。成功地制备了1株分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为Mab03.2C1-C2。其小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:25600;单克隆抗体的重链属于IgG1亚类,轻链属于λ型;通过IIF,可见单抗能使白念珠菌芽管特异性染上荧光,而孢子上无荧光着色,证实了该单抗是抗白念珠菌芽管胞壁外膜特异性抗原的单克隆抗体;经Western Blotting证实Mab03.2C1-C2杂交瘤细胞分泌的单克隆抗
参考文献：
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