晏奇[1]2016年在《牙周膜来源的诱导多能干细胞的建立和应用》文中研究说明国内外学者一直致力于通过组织工程的方法来进行再生医学的研究,而种子细胞是组织工程的必要条件之一。鉴于其具有多向分化能力,干细胞被认为是良好的种子细胞来源。在牙周再生领域,再生医学的发展也为组织修复再生提供了新的策略,而牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是牙周组织中天然存在的干细胞,也是目前牙周组织工程最有潜力的种子细胞之一,具有成骨、成牙骨质等多种分化潜能,但天然的PDLSCs存在较少,且分离培养和筛选过程复杂,很难大量的培养以作为组织再生的种子细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是从早期胚胎中分离得到的干细胞,在不同的培养条件下,具有分化为多种类型的细胞的潜力,但是由于受到伦理问题的限制,目前仅能用于动物实验,因此科学家们开始尝试其他方式来获得分化能力更强的细胞。细胞重编程是将已分化成熟的体细胞逆转为未分化状态的过程,而被重编程后的细胞具有多能性,具备分化为机体内多种细胞类型的潜能。诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是近几年来干细胞领域的研究热点之一。2006年,京都大学的Yamanaka研究团队革命性得将小鼠成纤维细胞成功诱导为iPSCs。诱导成功的iPSCs不仅在细胞形态和分化潜能方面都类似于ESCs,而且避免了围绕ESCs使用的伦理学问题。基因重编程诱导多能干细胞使得为了临床治疗目的,采用转录因子将细胞从一种细胞系逆转到另一种细胞系成为可能。这一前沿研究成果也为解决骨再生问题,乃至于重建牙周组织提供了全新的思路：如果可以通过诱导重编程技术直接将体外培养的牙周膜成纤维细胞去分化为多能干细胞,作为“种子细胞”用于牙周组织工程,将有助于突破困扰该领域进展的瓶颈。在临床中,通过阻生牙和正畸牙的拔除,我们可以获得牙周膜,从而利用其培养出牙周膜细胞,进而将其诱导成为iPSCs,作为牙周组织工程的种子细胞来使用。另外,细胞膜片技术是在组织再生中具有广阔应用前景的一项技术。它不仅可以很好地保存细胞外基质,还能减少细胞移植后无效移植细胞的数量和支架材料的使用,有利于组织的再生。将重编程得到的多能干细胞在体外制备成细胞膜片用于牙周组织工程中,也可以成为牙周组织再生的新方式。[实验目的]本研究的目的即原代培养人牙周膜细胞,将外源性基因(Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc)通过病毒介导的转染系统来对人牙周膜细胞进行重编程,然后对构建成功的hPDLC-iPSCs进行生物学鉴定。鉴定证实细胞构建成功后进行体外实验评价hPDLC-iPSCs的成骨分化能力,最后利用hPDLC-iPSCs形成的细胞膜片植入裸鼠头盖骨缺损,评价其体修复骨缺损的能力,为今后在牙周组织工程中的应用奠定基础。[材料与方法]本课题的研究内容分为以下四个部分：第一部分人牙周膜来源诱导多能干细胞的建立1.1人牙周膜细胞(hPDLCs)的原代培养及鉴定取健康患者正畸牙,组织块法培养牙周膜细胞,运用细胞免疫荧光对细胞表面标志物(波形蛋白、角蛋白、纤连蛋白和Ⅰ型胶原酶)进行鉴定。1.2 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备从孕13.5天CF-1胚胎组织中分离提取纤维细胞并扩增辐照处理细胞1小时,冻存备用。1.3慢病毒的包装及感染hPDLCs将携带Oct-4、Sox-2、c-Myc和klf-4基因的载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞,48小时后收集上清液并进行慢病毒滴度测定。用包装携带外源性目的基因的病毒液感染牙周膜细胞。1.4病毒感染后的细胞培养以及挑取iPSCs克隆将感染后的细胞铺于MEF细胞上,更换为hESCs培养基,3-4周后挑取克隆,选择碱性磷酸酶阳性细胞进行后续实验。第二部分人牙周膜来源诱导多能干细胞的鉴定确认通过诱导确实获得了牙周膜来源的诱导多能干细胞(hPDLC-iPSCs):2.1细胞的形态观察观察诱导获得的细胞,与诱导前的PDLCs以及hESCs的形态进行对比。2.2 iPSCs碱性磷酸酶(Alkaline phosphatasee,AP)染色检测诱导获得的细胞的碱性磷酸酶活性,并与hESCs进行对比。2.3 iPSCs免疫荧光染色免疫荧光染色检测诱导获得的细胞是否表达hESCs特异性蛋白,包括胞膜蛋白(SSEA3、SSEA4),胞质蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和胞核蛋白(Oct-4、 Nanog)。2.4体内分化畸胎瘤实验对诱导获得的细胞进行扩增,注射到裸鼠背部和大腿内侧,观察是否有畸胎瘤形成。并对形成的畸胎瘤进行苏木精-伊红染色,镜下观察形成组织的情况,判断细胞是否具有向三个胚层组织分化的潜能。2.5拟胚体实验将细胞在体外悬浮培养,观察是否形成腔体形态,腔体形成七天后,进行贴壁培养,观察是否有细胞爬出。第三部分人牙周膜来源诱导多能干细胞体外成骨能力的评价3.1 hPDLC-iPSCs、hESCs以及PDLCs的成骨诱导分别培养hPDLC-iPSCs、hESCs以及PDLCs三种细胞,形成拟胚体后贴壁培养,常规培养后更换矿化诱导培养基(β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松)。3.2矿化结节形成茜素红染色观察细胞诱导矿化14天后的矿化结节形成情况,并定量分析。3.3ALP水平检测运用PNPP法定量检测细胞在诱导矿化7和14天的ALP活性。3.4 real-time PCR检测基因表达水平real-time PCR检测细胞在成骨诱导培养基中培养7天和14天后的成骨相关基因(ALP、OCN、Col-I和Runx2)表达。第四部分人牙周膜来源诱导多能干细胞膜片在骨缺损修复中的应用4.1 hPDLC-iPSCs、hESCs以及hPDLCs细胞膜片的制备三种细胞均在加入维生素C的成骨诱导培养基中培养21天,培养后期可见培养皿底部形成透明白色膜,即成功得到细胞膜片,小心刮下后得到细胞膜片,待用。4.2裸鼠头盖骨缺损模型的建立以及细胞膜片的修复实验设立三个小组,hPDLC-iPSCs膜片组、hESCs膜片组以及hPDLC膜片组；水合氯醛麻醉裸鼠,切开头部皮肤,暴露头盖骨,利用3.5mm环钻创造骨缺损,小心去除骨片后,在创口植入刮除的细胞膜片,拉拢头部皮肤,缝合,注射抗生素。4.3细胞膜片评价分别在手术4周和8周后,处死裸鼠后取材,多聚甲醛固定后,进行micro-CT重建分析,之后HE染色和Masson染色观察分析。[结果]1.原代培养一周后,可见细胞从组织块中爬出。免疫荧光显示细胞的波形蛋白、纤连蛋白和Ⅰ型胶原酶的表达为阳性,角蛋白为阴性,证明该培养的细胞为PDLCs。2.第一周后可见PDLCs形态发生变化,由梭形成纤维细胞状变为聚集的圆形克隆状,在3周后左右挑取克隆后发现有AP染色呈阳性,且具有典型的hESCS克隆形态。重编程成功的细胞表达ESCS特异性蛋白,包括胞膜蛋白(SSEA3、 SSEA4),胞质蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和胞核蛋白(Oct-4、Nanog),能形成畸胎瘤,具有向三个胚层分化的潜力,且能在体外形成拟胚体。3.成骨诱导14天后,茜素红染色显示hPDLC-iPS组的矿化结节数多于其他两组,而ALP的检测结果也与染色保持一致。另外,成骨相关因子ALP、OCN、Col-I和Runx2在hPDLC-iPSCs中的表达也更高,表明hPDLC-iPSCs的成骨能力强于hES和PDLCs。4.动物实验了三个小组,hPDLC-iPSCs、hESCS和PDLC膜片均培养成功,micro-CT重建分析发现hPDLC-iPSCs膜片对骨缺损的修复作用明显强于另外两种细胞膜片,而HE染色和Masson染色也说明hPDLC-iPSCs膜片的新骨形成更多。[结论]1.通过慢病毒转染hPDLCs,诱导获得的细胞碱性磷酸酶阳性,能够表达hESCs特异性的表面标记,并且具有形成畸胎瘤向三胚层分化等能力,说明hPDLC-iPSCs构建成功。2.本研究结果提示,诱导得到的hPDLC-iPSCs在体外具有良好的成骨作用,与hESCs相比,hPDLC-iPSCs能更快地诱导成骨矿,且相关成骨因子表达明显比hESCs以及未诱导的PDLCs更强。3.基于组织工程方法诱导细胞分泌细胞外基质后形成的细胞膜片,是一种较简单、有效的骨缺损修复手段,在体内实验中,相比hESCs和hPDLCs膜片,hPDLC-iPSCs膜片能更好的修复头盖骨缺损,在骨组织工程中具有良好的应用前景。4.综合以上结论,hPDLC-iPSCs为牙周再生的组织工程修复提供了新的选择,具有潜在的临床应用价值。
孟国林[2]2000年在《成纤维细胞成骨能力的系列研究》文中指出组织工程是由种子细胞、细胞因子和细胞支架等三要素构成的。曾有研究表明成纤维细胞在骨折愈合过程中具有形成骨细胞的能力，体外培养的皮肤成纤维细胞也具有形成骨组织的能力，因而成纤维细胞被认为属于可诱导骨祖细胞的范畴，并被认为是骨组织工程学研究中具有成骨潜能的种子细胞。但在什么条件下成纤维细胞成骨表型增强并可向成骨细胞方向转化?目前尚无这方面研究。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族成员(除BMP-1外)可在异位诱导形成新骨，具有诱导未分化间充质细胞向成骨细胞方向转化作用，目前BMP家族成员的基因均已经克隆成功。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有很强促进细胞分裂增殖的作用，是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子。地塞米松(Dex)作用于骨髓基质细胞可促进其成骨表型表达。上述三种因子在骨组织工程研究中对促进种子细胞成骨表型表达和增殖发挥着重要作用。因此，我们检测了上述三种因子单独和联合使用时成纤维细胞成骨表型的变化和对成纤维细胞增殖作用的影响。研究结果发现，rhBMP-2可促进成纤维细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的增加和骨钙素的表达，细胞形态变宽大，细胞贴壁面积增大，当rhBMP-2的浓度为800-1200ng／ml时作用最
任大鹏[3]2016年在《ERK1/2-Runx2信号通路介导周期性张应力作用下牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制研究》文中认为背景和目的正畸治疗过程中,牙齿在正畸力的作用下发生移动,其生物学基础在于牙周组织在应力刺激下发生改建。正畸力经牙齿传递到牙周组织,牙周膜在这一过程中发挥了桥梁作用。牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts, PDLFs)是牙周膜的主要构成细胞,在应力刺激下能合成细胞因子并通过胞内信号传递系统影响细胞行为(增殖,分化,凋亡等),从而介导牙周组织的改建,修复和再生。研究应力刺激在PDLF胞内的信号转导以及对PDLF行为的影响,对于阐明正畸力作用下牙周组织改建的分子机理,发现有利于促使牙齿移动的力学环境都具有重要意义。成骨细胞是促进骨基质分泌和矿化的主要细胞。核心结合因子a1 (core binding factor al, Cbfal),又称Runt相关转录因子2(]runt related transcription factor 2, Runx2),是学者们公认的最重要的成骨细胞特异性转录因子之一。Runx2蛋白能特异性结合许多成骨基因启动子上的顺式作用元件,并促进成骨靶基因的转录表达。虽然Runx2基因和蛋白的表达水平在矿化组织和成骨细胞系中远远高于一些非骨组织来源的细胞,但是目前越来越多的研究表明其基因和蛋白水平与成骨细胞的功能和分化并不是直接线性相关,而Runx2蛋白的活化状态也是其发挥功能的重要影响因素。目前,学者们一致认为Runx2是联系胞外成骨诱导因素和胞内影响成骨细胞功能分化的信号通路的枢纽。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2)是最先被发现并且最具有代表性的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)家族的成员。经胞外刺激因素活化后的ERK1/2可以进一步影响其下游转录因子的表达和活化。有研究表明Runx2是 ERK1/2众多下游靶基因中的一员,但是ERK1/2-Runx2通路是否可以在应力刺激下的PDLF中被激活还未知；如果其确实参与了应力刺激下PDLF的成骨分化,其具体的分子机理也有待深入研究。本研究首先通过携带Runx2基因的慢病毒载体转染原代培养的PDLF,探究Runx2对PDLF成骨分化的作用,然后构建了PDLF体外培养一应力刺激模型,观察Runx2和其他相关成骨基因在应力刺激下的表达变化,以及ERK1/2通路在应力刺激下的激活情况；最后通过比较对正常PDLF 和P Runx2过表达PDLF实施应力刺激,以及特异性阻断ERK1/2通路对应力刺激PDLF成骨分化的影响,研究ERK1/2 和 Runx2在介导应力刺激促进PDLF成骨分化过程中发挥的作用,对应力刺激,ERK1/2, Runx2,以及PDLF的成骨基因表达这几个因素之间的关系进行阐述,以明确ERK1/2-Runx2通路介导应力刺激调控PDLF成骨分化的分子机理,为临床正畸矫治提供新的分子生物学基础。主要实验方法及结果1牙周膜成纤维细胞的分离培养及鉴定采用组织块联合酶消化法对牙周膜成纤维细胞进行分离培养,并绘制细胞生长曲线。免疫细胞化学染色结果显示角蛋白染色为阴性,波形丝蛋白染色为阳性,HE染色胞浆伊红,胞核嗜碱性。成纤维细胞特异性表面蛋白1(FSP1)免疫荧光染色阳性。2稳定过表达Runx2基因的PDLF的构建及Runx2对PDLF的成骨诱导作用利用Ⅱ型Runx2基因以及LV5慢病毒载体构建LV5-Runx2慢病毒载体。有限稀释法测定病毒液滴度为6x105TU/ml。通过靶细胞侵染预实验对MOI值以及Puromycin筛选浓度进行摸索,最终获取稳定过表达Ⅱ型Runx2的牙周膜成纤维细胞。荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染LV5-Runx2的牙周膜成纤维细胞中Runx2的nRNA和蛋白水平都升高显著。荧光定量PCR结果显示Ⅱ型Runx2过表达可以有效促进PDLF中成骨转录因子SP7,骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的转录表达,但对1型胶原(COL-1)和碱性磷酸酶(ALP)的表达无影响,并且轻微抑制转录激活因子4(ATF4)的表达。茜素红染色实验证实Ⅱ型Runx2过表达的PDL F体外培养3周后可以观察到钙结节。3周期性张应力刺激体外培养的牙周膜成纤维细胞模型构建使用多通道细胞体外牵张应力加载系统,对体外培养的牙周膜成纤维细胞施加振幅10%,频率0.5HZ的周期性牵张力,加力作用时间为1h,3h,6h,12h,18h,24h,以不加力组作为对照组,采用荧光定量PCR测定并绘制成骨基因Runx2, SP7, OCN, BSP和ATF4的mRNA随加力时间延长而变化的表达曲线；利用Western Blot和免疫沉淀法测定Runx2蛋白水平在不同加力时间点的表达,以及Runx2 和 ERK1/2在不同加力时间的激活情况。结果证实了周期性张应力可以促使牙周膜成纤维细胞中上述成骨基因的表达,并且在这一过程中同时伴随Runx2和ERK1/2通路的磷酸化。4ERK1/2-Runx2通路介导了周期性张应力刺激下牙周膜成纤维细胞的成骨分化对正常PDLF和过表达Runx2的PDLF分别进行应力刺激3h,荧光定量PCR结果显示周期性张应力刺激以及Lunx2过表达对牙周膜成纤维细胞中成骨基因SP7, OCN和BSP的mRNA表达有协同促进作用,即对Runx2过表达的PDLF同时施加应力刺激比不加力的Runx2过表达PDLF或者加力的正常PDLF对上述成骨基因的转录刺激作用更强。对加力组PDLF同时应用ERK1/2通路的特异性抑制剂U0126后,上述成骨基因的转录表达水平较单纯加力组有所下降。通过对正常PDLF和过表达Runx2的PDLF中Runx2的mRNA和蛋白水平的测定,发现应力刺激都可以诱导Runx2基因的转录和翻译,但ERK1/2通路被抑制后,Runx2的mRNA水平显著下降,而蛋白水平无明显变化,说明应力刺激对Runx2的转录表达可以通过ERK1/2介导,但ERK1/2对Runx2蛋白的翻译过程影响不大。通过测定Runx2的蛋白磷酸化水平(p-Runx2),发现p-Runx2的表达趋势与上述成骨基因的表达趋势高度一致,从而推测ERK1/2-Runx2通路介导应力刺激对牙周膜成纤维细胞的成骨分化的机制在于提高Runx2蛋白表达水平的同时对其进行磷酸化修饰以提高Runx2蛋白的转录激活功能。进一步研究发现ERK1/2蛋白主要存在于胞浆中,而Runx2蛋白则存在于胞核中；应力刺激激活ERK1/2后促使p-ERK1/2进入胞核并与Runx2形成蛋白复合体,推测这为p-ERK1/2对Runx2的磷酸化修饰提供了条件；U0126抑制了应力刺激下ERK1/2的活化,从而阻止p-ERK1/2进入细胞核并激活Runx2。结论1. Runx2对牙周膜成纤维细胞的成骨分化具有促进作用,可提高下游成骨靶基因SP7, OCN和BSP的转录水平的表达。2.周期性张应力刺激可以促进牙周膜成纤维细胞成骨基因SP7, OC N和BSP的转录表达；Runx2基因的mRNA和蛋白表达水平也同时升高,并伴随Runx2蛋白和ERK1/2通路的磷酸化。3. ERK1/2-Runx2通路介导周期性张应力刺激促进牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制在于提高胞内Runx2蛋白的磷酸化水平(p-Runx2),从而促进Runx2下游成骨基因的转录表达；Runx2总蛋白水平与下游成骨基因转录表达无相关性。应力刺激激活ERK1/2进入细胞核中与Runx2形成蛋白复合体,猜测这为p-ERK1/2对Runx2的磷酸化提供了条件；阻断ERK1/2通路影响了应力刺激对ERK1/2的激活以及入核,从而影响了Runx2蛋白的磷酸化修饰和成骨基因的转录表达。创新和意义本课题从细胞分子水平证实了ERK1/2-Runx2通路参与了周期性张应力刺激下牙周膜成纤维细胞的成骨分化,并进一步探讨了其具体的机制,认为Runx2的磷酸化水平的而非总蛋白水平在调控下游成骨靶基因转录表达方面起到至关重要的作用；而应力刺激下活化的ERK1/2则在转录水平提高Runx2的表达并同时进入细胞核与RLunx2蛋白结合以促使Runx2蛋白的磷酸化。以上观点为临床正畸治疗过程中牙周组织的骨改建提供新的分子靶点和思路。
谈珺[4]2016年在《PERK通路在炎症微环境影响牙周膜干细胞成骨分化中作用的研究》文中研究指明慢性牙周炎是我国乃至世界性高发的口腔感染类疾病,牙槽骨的不可逆性吸收是牙周炎疗效不佳的重要瓶颈。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一类位于牙周膜(periodontal ligament,PDL)组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),在体外有良好的成骨和成牙骨质能力。而在牙周炎症环境中,PDLSCs的成骨能力明显降低,无法成功修复炎症牙周组织中的骨缺损。目前对炎症微环境改变PDLSCs成骨能力的机制研究多数着眼于各种信号通路和分子上,但仅调控其中某些因子无法达到有效的治疗效果,因此,找到这些因子上游细胞器水平的相关调控机制将具有更强的可操作性。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是细胞的保护性应激反应,通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)来维持细胞稳态。适度的内质网应激具有保护效果,而过度的内质网应激则有破坏作用。内质网应激/UPR已被证实参与了多种慢性炎症性疾病的发生和发展,亦被证明与牙周炎症有关。同时,内质网应激/UPR特别是双联RNA激活蛋白激酶样内质网激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase(PKR)like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路参与了间充质干细胞的成骨分化过程。然而,内质网应激/UPR是否参与了炎症微环境中PDLSCs成骨能力改变尚无相关报道。研究目的:探讨内质网应激及UPR的PERK通路在炎症微环境抑制PDLSCs成骨能力中的作用,为牙周炎的发病机制提供理论依据,为牙周炎的治疗提供可能靶点。研究方法:1.从临床上选取符合条件的健康牙齿及牙周炎患牙,分别随机分成3组,以健康牙作为对照。一组脱钙后制作石蜡切片,进行苏木素-伊红染色确定牙周组织完整的切片部位,继而对相应连续切片免疫组织化学染色,检测PERK通路相关因子糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、PERK、活化转录因子4(activating transcription factor,ATF4)和转录因子C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein,CHOP)的定位表达情况;刮取牙根中1/3部位根面牙周膜或残留牙周膜及炎性肉芽组织,一组经组织匀浆后行实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR),一组行组织蛋白裂解后使用蛋白印迹法(Western blot),分别检测PERK通路相关因子的基因和蛋白的定量表达情况。2.从临床上选取健康的牙齿,使用酶组织块消化法,从根中1/3部位根面牙周膜组织中在体外分离培养出PDLSCs,使用有限稀释法进行细胞纯化,通过克隆形成实验证明细胞克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞MSCs特异性表面标记物验证细胞间充质干细胞特性,成骨和成脂诱导检测细胞多向分化能力,以对细胞进行鉴定。使用内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin,TM)和毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对PDLSCs刺激,以未经激活剂刺激的PDLSCs作为对照,行q RT-PCR检测不同时间点(6 h、9 h和12 h)PERK通路相关因子在PDLSCs中的基因表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR和Western blot检测成骨相关因子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的基因表达以及Runt-相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的基因和蛋白表达水平,通过ALP染色和茜素红染色检测细胞的ALP活性和矿化结节形成能力。3.使用梯度浓度(1 ng/ml、10 ng/ml和20 ng/ml)的炎性因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)模拟炎症环境,对PDLSCs进行刺激,以未经TNF-α刺激的PDLSCs作为对照,通过q RT-PCR和Western blot检测不同时间点(6 h、12 h、24 h和72 h)PDLSCs中PERK通路相关因子的基因和蛋白表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨能力。从而筛选出合适的TNF-α刺激浓度及作用时长。4.用梯度浓度(0.5 m M、1 m M、2.5 m M、5 m M和7.5 m M)的内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)处理PDLSCs,使用CCK-8检测12 h和24 h时细胞的增殖情况以测试4-PBA的细胞毒性,确定其合适的预处理时间。使用梯度浓度的4-PBA预处理PDLSCs后,用筛选出的TNF-α浓度刺激细胞,以未经4-PBA预处理仅由TNF-α刺激的PDLSCs作为对照,通过q RT-PCR和Western blot检测PDLSCs中PERK通路相关因子的基因和蛋白表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨能力。5.用PERK小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)对PDLSCs进行转染,以仅导入脂质体的空载细胞作为对照,检测PERK的基因转染效率和蛋白抑制率。转染48 h后,使用10 ng/ml的TNF-α刺激细胞12 h,以经TNF-α刺激的空载PDLSCs作为对照,通过q RT-PCR和Western blot检测不同时间点PDLSCs中PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨能力。研究结果:1.在牙周炎患牙的炎性牙周膜和肉芽组织中,PERK通路相关因子GRP78、PERK、ATF4和CHOP的免疫组化染色阳性率、基因表达和蛋白表达与健康牙周膜组织相比明显升高。2.从健康牙周膜组织中可成功分离培养出牙周膜干细胞,纯化后,其形态呈长梭状,呈克隆化生长,阳性表达CD146、CD105、CD90和CD44等MSCs特异性表面标记物,不表达内皮细胞标记物CD31和造血干细胞标记物CD34,具有良好的成骨和成脂分化能力。PDLSCs经1μg/ml TM刺激6 h和9 h后,PERK通路相关因子的m RNA表达较未刺激组均明显上升,12 h时各因子表达出现明显回落;经0.1μM TG刺激后,GRP78、PERK和ATF4的m RNA均仅在9 h时较未刺激组明显升高,CHOP的m RNA在9 h和12 h均明显升高。TM组与TG组9 h时相比,PERK通路各因子的表达量明显升高。成骨诱导后,经TM或TG刺激的PDLSCs的ALP基因表达及活性、Runx2和OCN的基因和蛋白表达以及矿化结节形成能力均较未刺激组明显降低,且TM组低于TG组。3.刺激PDLSCs 12 h时,三种浓度的TNF-α均使PERK通路相关因子的基因和蛋白表达明显升高并达到峰值,1 ng/ml的TNF-α对PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白激活能力相对较弱。在72 h时,10 ng/ml TNF-α组ATF4的表达量和PERK的蛋白水平比20 ng/ml组更高。成骨诱导后,3种浓度的TNF-α均可抑制ALP基因表达及活性、Runx2和OCN的基因和蛋白表达以及矿化结节形成能力,其中10 ng/ml和20 ng/ml的TNF-α对细胞ALP活性、Runx2的基因表达、OCN的基因和蛋白水平以及矿化结节形成的抑制能力高于1 ng/ml的TNF-α。由此确定后续实验选取浓度为10ng/ml的TNF-α来模拟炎症环境,并在刺激12 h时对PERK通路相关因子进行检测。4.浓度为7.5 m M的4-PBA对PDLSCs预处理24 h时,细胞增殖水平明显下降,体现出细胞毒性。经梯度浓度4-PBA预处理12 h后使用TNF-α刺激PDLSCs 12 h,结果显示较低浓度的4-PBA(0.5、1和2.5 m M)较未预处理对照组可有效抑制PERK通路相关因子的m RNA表达和GRP78、PERK及ATF4的蛋白水平,且三者间没有统计学差异。而7.5 m M的4-PBA仅能抑制CHOP的m RNA表达,却提高了PERK的m RNA及蛋白表达和ATF4的蛋白水平。成骨诱导后,较低浓度的4-PBA较未预处理对照组可有效提升ALP基因表达、Runx2的基因和蛋白表达、OCN的蛋白水平以及矿化结节能力,1 m M和2.5 m M的4-PBA还可使OCN的转录水平明显升高。7.5 m M的4-PBA却抑制了Runx2的基因和蛋白、OCN的蛋白表达和细胞ALP活性。5.转染PERK si RNA的PERK基因抑制效率为56%,蛋白表达抑制效率为52%。PERK未被沉默时,TNF-α可使PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白表达较未刺激对照组明显上升,而PERK被沉默后,即使被TNF-α刺激12 h,3种基因和蛋白表达仍然明显回落。成骨诱导后,空载的PDLSCs经TNF-α持续刺激后,成骨能力较未经TNF-α刺激对照组均明显下降,而在PERK基因沉默后由TNF-α刺激PDLSCs,其成骨能力较空载组明显回升。结论:1.在牙周炎患牙的炎症牙周膜及肉芽组织中,内质网应激和PERK通路处于激活状态;2.内质网应激激活剂可有效激活PDLSCs的内质网应激和PERK通路并抑制细胞的成骨能力;3.在慢性炎症微环境中,TNF-α可通过激活细胞的内质网应激和PERK通路来抑制PDLSCs的成骨能力,该作用可被内质网应激抑制剂4-PBA或PERK沉默而逆转。
夏萍[5]2018年在《强直性脊柱炎Andersson病局部韧带成纤维细胞成骨能力的研究》文中研究表明目的:通过对强直性脊柱炎及腰椎间盘突出症患者棘上韧带组织成纤维细胞进行细胞培养观察其成骨分化能力,分别在培养基中加入强直性脊柱炎患者血清及正常人血清,进行对照实验,观察两种成纤维细胞分化成成骨细胞的能力,探究强直性脊柱炎患者成骨能力强大的原因。方法:实验所需标本分别来源于强直性脊柱炎Andersson病假关节处及棘上韧带组织(A成纤维细胞),腰椎间盘突出症患者棘上韧带组织(B成纤维细胞),强直性脊柱炎病人的血清和腰椎间盘突出症病人的血清(A血清、B血清)制作成两组培养基,将两组韧带成纤维细胞在不同血清培养基中培养,分为4个处理组即AA、AB、BA、BB,每日在相差显微镜中观察各组的成纤维细胞在培养过程中的具体演变,同时在培养之后的第20天,使用定量以及定性的检测方法来计算碱性磷酸酶活力参数,使用ELISA检测方法来计算骨钙素的具体表达参数,对比相关的成骨表达信息,评价四个组的成骨表达能力。结果:通过相差显微镜观察各组成纤维细胞培养情况,发现成纤维细胞分化形态具有相似的变化,各组碱性磷酸酶的活力以及骨钙素的表达状况,会伴随诱导时间的增加而提升,比较四个组成纤维细胞的成骨诱导及成骨标志物的表达情况,发现碱性磷酸酶活力及骨钙素表达量均为AA组>AB组>BA组>BB组,四个组之间两两相比较具有统计学意义(P<0.05)。结论:强直性脊柱炎以及腰椎间盘突出症病患的成纤维细胞在体外培养条件下存在着向成骨细胞分化的能力,同时强直性脊柱炎的成纤维细胞成骨趋势更为显著。在成纤维细胞分化过程中,强直性脊柱炎病患的血清促成骨分化效应相对更为突出,代表着AS病患的血清内有着含量更高的成骨诱导因子。通过比较AB组与BA组成骨表达程度,提出两个猜想:一是遗传条件下的成纤维细胞自身特性在成骨分化过程中发挥的成骨表达作用强于血清对成纤维细胞的促成骨作用,二是AS病患韧带局部存在比血清中含量更多的促成骨细胞因子。意义:通过对强直性脊柱炎成纤维细胞的体外培养,证实了成纤维细胞在强直性脊柱炎脊柱关节融合过程中发挥重要作用。成纤维细胞在体内大环境下,在成骨诱导因子的趋动下,强化成骨能力,致使脊柱关节融合。实验中AB组成骨强于BA组,由此我们提出两个猜想,强直性脊柱炎局部韧带成纤维细胞成骨能力的强大,究竟是成纤维细胞的本身属性还是局部韧带中存在更多的促成骨细胞因子在局部发挥关键作用,这值得我们去更进一步探索,可能会为强直性脊柱炎成骨机制的研究提供依据。
毕军花, 朱太咏, 石印玉[6]2007年在《成纤维细胞的成骨能力》文中进行了进一步梳理目的:成纤维细胞参与任何创伤的愈合。但在骨折愈合的过程中,成纤维细胞却能最终发展为骨组织。归纳总结成纤维细胞的生物学特性、成骨能力及其影响因素。资料来源:应用计算机检索Pubmed,Ovid数据库1990-01/2006-12有关成纤维细胞生物学特性及其成骨能力的文章,检索词“fibroblasts,osteogenesis”,限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库1994-01/2006-12期间的相关文章,检索词“成纤维细胞、成骨”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文。纳入标准:①有关成纤维细胞生物学特性的研究。②有关成纤维细胞与成骨的基础与临床研究。排除标准:重复或类似的同一研究、Meta分析、综述文献。资料提炼:共收集到151篇有关成纤维细胞及成骨能力的文章,排除重复或类似的同一研究,40篇符合研究要求。资料综合:①通过对成纤维细胞在骨折时电镜下超微结构分时段的观察,发现成纤维细胞具备成骨的条件,如提供钙化时所需的Ca2+、分泌胶原纤维和基质小泡;并能最终转化为骨组织。②通过体外培养成纤维细胞,在诱导因素作用下可形成钙化结节。③通过对其诱导因素研究发现,成纤维细胞必须在诱导因素作用下才能成骨。其影响因素为局部骨组织、应力、生长因子、上皮细胞、病理环境等。结论:从本身的生物学特性研究来说,成纤维细胞具备有成骨的条件。同时研究发现成纤维细胞表现为成骨是在特殊环境下,有诱导因素的作用下的结果。
林辉[7]2017年在《AMPK对BMP信号通路以及异位骨化的抑制作用》文中研究指明第一部分引言异位骨化(Heterotopic ossification,HO)是指在软组织中病理形成异常的骨组织。一般发生在两个单独的患者群体中：具有严重创伤包括大面积烧伤、肌肉骨骼损伤、矫形手术甚至脊髓损伤的患者;和进行性肌肉骨化症(Fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP)等遗传性疾病患者中。FOP由I型骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMP)受体ALK2(Activin receptor-like kinase 2,活化素1型受体)中的永久性活化突变引起。这些病理性异位骨形成的临床后遗症,包括非愈合性创伤、慢性疼痛和关节不动性。对于FOP,患者由于胸廓顺应性的损失导致呼吸困难而死亡。BMPs以及其转导的信号通路在异位骨化形成中具有重要作用。BMPs是异位骨化的主要诱导者;软组织创伤后刺激BMPs分泌和激活BMP信号通路,促进软组织形成HO。此外,大约95%的FOP患者发生BMPI型受体(ALK2)突变(R206H),引起BMP信号通路持续性激活,表现为渐近性异位骨化的特性。异位骨化是一个非常普遍和严重的健康问题,目前临床上使用的方法一般是减少疼痛,修复以及预防。大多依赖于抗炎药物的使用,但其效果充其量是部分有效。而且大量的副作用限制了NSAIDs的使用。一个有效的、理想的策略是特异性的针对BMP信号通路成分,抑制异位骨化,另一个有创新性的策略是鉴定现有临床上治疗其他药物,重新发现其治疗效果来满足临床需求。众多研究表明AMP-激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在骨代谢中发挥重要的生理作用,AMPK激活剂二甲双胍是2型糖尿病一线药物,已经在临床上广泛使用超过半个世纪。我们课题组前期已经发现二甲双胍能够有效性的抑制TGFβ家族信号转导和EMT。继续延伸此研究,探索AMPK对BMP信号通路以及异位骨化的作用。因此,我们首先研究了AMPK对FOP成纤维细胞中BMP信号通路的抑制作用以及分子机制;然后将FOP成纤维细胞诱导成多能干细胞(iPS cells),进行成骨分化诱导,进一步检测了AMPK对成骨分化的抑制作用;为了探索不同细胞的反应性,继续检测AMPK对MC3T3-E1细胞BMP信号通路的影响和作用机制,研究不同AMPK激活剂(单独使用或者联合使用)对成骨分化的影响,确定剂量效应和协同效应;最后建立小鼠异位骨化模型以及检测AMPK激活剂对体内异位骨化的抑制作用。我们的研究结果明确AMPK对BMP信号通路以及成骨分化和异位骨化的抑制作用,也为现有临床使用的AMPK激活剂如二甲双胍、阿司匹林用于预防、治疗FOP疾病和异位骨化提供科学依据。第二部分AMPK对FOP成纤维细胞中BMP信号通路的抑制作用目的：检测AMPK激活是否抑制BMP信号通路转导以及探索AMPK可能的作用机制。方法：DNA测序检测FOP成纤维细胞是否发生ALK2 R206H突变;不同AMPK激活剂处理FOP细胞,Western blot检测AMPK对BMP信号通路成分表达的影响;构建LKB1、AMPKa1a2稳定敲除MEF细胞株,观察不同细胞株对BMP和二甲双胍的反应性;感染持续性激活AMPK腺病毒激活AMPK和显示负性AMPK腺病毒失活AMPK,确定二甲双胍对BMP的信号通路作用是通过AMPK介导的;构建荧光素酶互补结合实验系统,观察AMPK对Smad6与Smurf1、ALK2与Smad1相互作用的影响;转染Smad6 si RNA和Smurf1 si RNA以及用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,探索AMPK对BMP信号通路抑制作用的分子机制。结果：DNA测序确认FOP成纤维细胞发生ALK2 R206H突变;不同AMPK激活剂激活AMPK并且抑制Smad1/5的磷酸化;感染持续性激活AMPK突变体抑制BMP信号转导,而感染AMPK显性负性突变体后,取消了二甲双胍对Smad1/5磷酸化的抑制作用;稳定敲除LKB1和AMPKa1a2表达后,二甲双胍不能抑制BMP6诱导的Smad1/5的磷酸化。AMPK激活抑制ALK2的表达但上调Smad6和Smurf1的表达;AMPK激活后促进Smad6和Smurf1的结合,但阻遏ALK2和Smad1的相互作用;Smad6和Smurf1基因沉默后,消除了AMPK对BMP信号通路的抑制作用。此外,结果还显示蛋白酶体抑制MG132能够消除AMPK促进ALK2降解的作用。结论：AMPK激活剂或者使用持续性激活AMPK突变体激活AMPK抑制Smad1/5的磷酸化;二甲双胍对Smad1/5的磷酸化抑制是通过AMPK介导的;AMPK激活抑制FOP成纤维细胞中BMP信号通路转导,AMPK激活后上调Smad6和Smurf1表达、增强两个分子之间的相互作用,随后引起ALK2降解增加,从而抑制BMP信号转导。第三部分AMPK抑制来源于FOP成纤维细胞的iPS的成骨分化目的：研究AMPK激活对来源于FOP成纤维细胞的iPS的成骨分化影响。方法：建立、鉴定来源于FOP成纤维细胞的诱导多能干细胞(FOP-iPS);诱导iPS细胞向成骨细胞分化,通过茜素红染色和Western blot检测成骨分化标记物表达来观察ALK2突变(FOP iPS)和野生型ALK2(Control iPS)的iPS诱导成骨细胞分化能力的区别;采用茜素红染色检测AMPK激活剂(二甲双胍、AICAR)对iPS细胞矿化的影响。结果：成功构建来源于FOP成纤维细胞的iPS细胞(FOP iPS);与对照iPS相比较,FOP iPS茜素红染色程度更强,成骨分化标记物Run X2、Osx和OPN表达水平更高;AMPK激活剂二甲双胍、AICAR抑制iPS诱导的细胞矿化。结论：携带ALK2突变的FOP iPS细胞诱导成骨细胞分化的能力更强;AMPK抑制来源于FOP成纤维细胞的iPS的成骨分化。第四部分AMPK对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞中BMP信号通路的抑制作用目的：探讨AMPK对MC3T3-E1细胞中BMP信号通路的影响以及探索可能的分子作用机制。方法：AMPK激活剂二甲双胍处理MC3T3-E1细胞不同时间或者不同浓度,Western blot检测AMPK对BMP信号通路成分表达的影响,观察AMPK对Smad6、Smurf1和ALK2等表达的改变;感染持续性激活AMPK腺病毒激活AMPK,观察AMPK对BMP信号通路的直接效应;转染Smad6 si RNA,沉默Smad6表达,探索AMPK对BMP信号通路抑制作用的分子机制。结果：二甲双胍和持续性激活AMPK突变体激活AMPK抑制BMP6诱导的Smad1/5的磷酸化;AMPK激活后上调Smad6表达但不改变Smurf1和ALK2的表达;Smad6基因沉默后,二甲双胍不能抑制BMP6诱导的Smad1/5的磷酸化,消除了AMPK对BMP信号通路的抑制作用。结论：AMPK激活抑制MC3T3-E1细胞中BMP信号通路转导,AMPK激活后通过上调Smad6表达,抑制BMP信号转导,Smad6是AMPK主要靶目标。第五部分AMPK抑制MC3T3-E1细胞成骨分化目的：探讨AMPK对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法：MC3T3-E1细胞培养在诱导成骨分化培养基中诱导细胞向成骨细胞分化,分别采用Western bolt和q PCR检测不同时间段(0、1、3、7、14、21天)AMPK活性和成骨细胞分化标记物OPN、Osx和Runx2的改变;观察AMPK活性和成骨分化之间的关系;感染持续性激活AMPK腺病毒激活AMPK和显性负性AMPK腺病毒失活AMPK,观察AMPK对碱性磷酸酶活性的影响;碱性磷酸酶染色检测不同AMPK激活剂(单独使用或者联合使用)对成骨分化早期阶段的影响;茜素红染色检测不同AMPK激活剂对成骨分化晚期阶段-细胞矿化的影响。结果：AMPK活性随着成骨细胞分化程度越高其活性逐渐降低,而成骨细胞分化标记物OPN和Osx在第14天呈现最高表达,Runx2在成骨分化期间表达未发生明显改变;AMPK激活剂包括二甲双胍、阿司匹林、姜黄素和布洛芬等抑制碱性磷酸酶活性,并呈现浓度依赖性;感染AMPK持续性活性突变体也显示同样效应,然而感染AMPK显性负性突变体失活AMPK活性和功能后,取消二甲双胍对碱性磷酸酶活性的抑制作用;二甲双胍和布洛芬联用对碱性磷酸酶活性抑制具有超叠加效应,而二甲双胍和姜黄素联用显示叠加效应。二甲双胍和阿司匹林抑制MC3T3-E1细胞矿化,并呈现浓度依赖性。结论：AMPK在成骨细胞分化过程中发挥重要作用,成骨分化程度越高,AMPK活性越低;AMPK激活抑制MC3T3-E1成骨细胞分化,包括早期阶段和晚期阶段。二甲双胍和布洛芬联合应用具有超叠加效应可能通过不同机制抑制碱性磷酸酶活性。二甲双胍和姜黄素联用具有叠加效应可能通过相似机制抑制碱性磷酸酶活性。第六部分AMPK对小鼠体内异位骨化形成的影响目的：初步探讨AMPK对小鼠体内异位骨化形成的影响。方法：建立创伤-烧伤异位骨化小鼠模型,同时采用二甲双胍干预(饮用水含有0.5mg/ml的二甲双胍,N=5),连续8周后,采用X-RAY扫描检测异位骨的形成;取异位骨化组织,固定,脱钙,进行HE染色观察组织学改变,阿尔新蓝(Alcian Blue)染色检测二甲双胍对软骨内形成改变;q PCR检测成骨细胞分化标记物(包括Osc、BSP、Run X2)以及Smad6、Smurf1的m RNA表达的改变。结果：通过创伤-烧伤方法成功建立小鼠异位骨化模型,术后8周,进行X-RAY检查可见明显的异位骨化形成;采用二甲双胍干预后,与对照组小鼠比较,小鼠体内异位骨化形成减少,HE检测未见软骨细胞、成骨细胞样和骨陷窝结构,大部分为腱性纤维、结缔组织,阿尔新蓝染色可见少量染色;成骨细胞标记物BSP、Osc和Runx2的m RNA表达明显减少,而Smad6和Smurf1的表达水平上升。结论：跟腱切断-烧伤法能够有效诱导小鼠异位骨化形成,二甲双胍可以阻止小鼠体内异位骨化的形成。
文军[8]2014年在《改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的作用研究》文中研究表明口腔医学领域很多常见病如牙周疾病、肿瘤、创伤等常常造成骨组织缺损,目前治疗骨组织缺损的方法主要有两种：自体骨移植和加工的异体或异种骨移植。近些年随着再生医学概念的确立以及组织工程技术的发展,采用患者体内来源的干细胞(种子细胞)在体外构建缺损组织,然后回植到患者体内组织缺损部位进行重建这一模式,成为解决骨组织缺损治疗难题的一个发展方向。构建组织工程骨主要包括干细胞、支架材料和促进成骨作用的生长因子。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被普遍认为是组织工程骨的理想种子细胞,研究表明其在体外适当的培养条件下,可以向成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种间充质来源的中胚层组织细胞分化。Gronthos等于2000年利用酶消化的方法,将人类健康的第三磨牙牙髓制备成单细胞悬液并培养,得到具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞,将其命名为牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)。Miura等于2003年从脱落乳牙的牙髓中分离到具有高度增殖能力和多向分化能力的干细胞,命名为乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)。将SHED、 DPSCs和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)进行比较发现,三种细胞都具备间充质干细胞的特征,包括成纤维细胞样形态和表达间充质干细胞特异性表面标记物。Gronthos将DPSCs与BMMSCs进行了对比研究,在同样的接种密度下,每一万个DPSCs可形成22-70个细胞克隆,而每一万个BMMSCs仅可形成2.4～3.1个细胞克隆,说明成人牙髓干细胞具有较高的集落形成能力,并推测牙髓组织中干细胞的比例可能高于骨髓组织。Miura发现从脱落乳牙获得的SHED每12-20个细胞即可以形成黏附克隆集落,而且与BMMSCs和DPSCs比较,SHED有着更强的增殖能力。基因表达谱显示,SHED和DPSCs有4386个基因存在两倍以上的差异,在涉及细胞增殖和细胞外基质分泌信号通路的基因方面,SHED的表达明显高于DPSCs。SHED在体外经诱导培养后可分化为成骨细胞,形成三维编织骨样结构；而在体内则不同,Miura将SHED接种于裸鼠体内,SHED不直接分化为成骨细胞,而是诱导宿主细胞分化为成骨细胞,这与DPSCs及其他牙齿组织来源的干细胞有一定的区别。鉴于SHED可能有着更为强大的体外增殖以及多向分化潜能,并且有可能具有诱导骨再生的特性,人脱落乳牙牙髓作为潜在的间充质干细胞龛,很可能是理想的成骨细胞源库,SHED所形成的矿化组织有可能用于骨再生、骨移植及其他临床治疗。由于乳牙牙髓的组织量较小,在临床应用的准备阶段,需要在体外将细胞进行大量扩增。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)是最常应用于细胞培养的物质,它为细胞的增殖、迁移和分化等生物学行为提供营养、生长因子和激素等生物活性物质。然而,FBS的应用由于可能涉及到伦理、科学以及安全问题,限制了其应用于临床。目前大量的研究在探索应用其他培养介质替代FBS用于干细胞的体外培养。富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物,含有大量的血小板和少量的其他血细胞。血小板中含有丰富的生长因子,包括血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF),碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),胰岛素样生长因子(insulin-like growth facter, IGF),转化生长因子β(transforming growth factor-b,TGF-β)和血管内皮生长因子等,这些细胞因子在细胞的各种生物学行为中都发挥着重要作用。一系列基础研究证实,PRP可以促进间充质干细胞、成骨细胞和成纤维细胞等增殖、迁移和分化,且这种作用具有浓度特异性和细胞特异性。与FBS相比,PRP可以促进人MSCs增殖,减少细胞达到融合的时间,增加细胞集落形成单位(colony forming unit, CFU)的大小,并且可以保持其成骨、成软骨和成脂分化能力,维持免疫抑制活性。用流式细胞仪检测发现,MSCs表达高水平的PDGF、bFGF、TGF-β和IGF受体,这表明血小板中的各种生长因子可以作用于MSCs。在无血清培养基中加入TGF-β、PDGF和bFGF,MSCs可以保持长梭形存活5代,MSC的增殖能力与加10%FBS的DMEM相差无几,并且仍保持多向分化的能力。在MSCs的增殖和分化过程中,PDGF、FGF和TGF-β信号通路起着重要作用,PDGF可能是PRP促进MSCs增殖和迁移的关键因子,其通过ERK信号通路影响细胞的有丝分裂。选择性地抑制PDGF受体激酶,骨细胞的形成明显减少,并且不能形成矿化结节：同时细胞增殖速率显著降低。PRP可促进DPSCs增殖,相对于FBS而言,PRP促增殖能力更强,且不改变DPSCs的免疫表型、CFU及多向分化能力。PRP通过PI3K/AKT和MAPK信号通路促进牙髓细胞的增殖和蛋白合成。PRP处理过的DPSCs高表达成牙本质基因和成骨基因,通过上调骨桥蛋白(osteoprotein, OPG)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)促进矿化。在一定浓度范围内,DPSCs的增殖能力与PRP呈浓度依赖性,但是高浓度的PRP则抑制DPSCs的增殖。由于PRP的来源及制备方法不同,尚无法确定其促进增殖和成骨分化的最佳浓度。我们的前期研究发现,10～30%的PRP可明显提高牙髓细胞ALP活性,其中以20%浓度尤为明显；10～30%的PRP明显促进了矿化诱导10天后的牙髓细胞形成矿化结节,其中10%浓度在矿化诱导20天后牙髓细胞形成的矿化结节最大。基于以上国内外研究现状和本课题组的前期研究成果,我们提出以下工作设想：(1)通过方法学的改良,在保持有效生长因子浓度的前提下,使PRP的制备和激活方式更加简便高效,更易于进行标准化,更利于提高科研的重复性和临床的可靠性；(2)一定浓度的改良富血小板血浆(modified platelet-rich plasma, mPRP)可以在体外更好地促进SHED的体外增殖,mPRP可以替代FBS成为组织工程骨所需干细胞体外快速扩增的培养基质；(3)在成骨诱导的条件下,mPRP有可能促进SHED在体外向成骨方向分化,从而提高组织工程骨的构建效率。为验证以上设想,本课题通过制备mPRP,并应用不同浓度的mPRP对SHED进行体外扩增培养以及成骨诱导分化。本论文主要包括以下四章内容：第一章：乳牙牙髓干细胞的分离培养和鉴定用酶消化法分离培养乳牙牙髓干细胞。经HE染色,见细胞多数呈长梭形,成纤维细胞样,少数呈多角形或卵圆形；利用CCK-8法检测细胞增殖能力,绘制细胞生长曲线显示,随培养时间延长,细胞数量增加,在第3至4天进入快速增长期,第6天进入增殖平台期,其生长特性符合干细胞增殖的一般特征；免疫细胞化学技术染色结果显示角蛋白阴性,波形蛋白阳性,说明细胞来源于间充质而非表皮；通过流式细胞术检测细胞表面标记物,有99.69%的细胞CD44阳性,90.13%的细胞CD105阳性,抗体CD34为阴性,说明细胞仅表达间充质干细胞特异性表面标记物,而不表达造血干细胞特异性表面标记物；将细胞在矿化诱导培养基中连续培养30天,茜素红染色后发现有大量的矿化结节形成,表明SHED具有向成骨细胞方向分化的能力；将细胞在成脂诱导培养基中连续培养21天,油红-O染色后可见透明高亮度点,表明SHED具有向脂肪细胞方向分化的能力。本实验获取的SHED增殖能力强,表达间充质干细胞特异性表面标记物,在不同诱导条件下可向成骨细胞和脂肪细胞等方向分化,是后续实验良好的体外细胞模型。第二章：改良富血小板血浆的制备与激活收集4份经检验合格的人AB型机采血小板,加入肝素,混匀后进行血小板计数,3×103r/min离心20mmin,吸弃部分上清,将血小板浓度调至约1×1012个/L,吸管反复吹打使血小板重新悬浮制备成为PRP；将PRP分装入冻存管内,浸入液氮罐5分钟,迅速取出浸入37℃水浴箱5分钟,反复三次,使血小板充分冻融裂解；3×103r/min离心20分钟,去除血小板沉渣,0.2μm过滤。应用酶联免疫吸附试验法定量检测富血小板血浆中PDGF-AA和TGF-β1的质量浓度,PDGF-AA的浓度为19.159μg/L, TGF-β1的浓度为57.163μg/L,与其他研究者制备所得的PRP中主要生长因子的浓度相当。第三章：改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖作用研究将第4代SHED按不同培养条件分为4个实验组和1个对照组,实验组在a-MEM培养基中分别加入2%,5%,10%和20%mPRP;对照组在a-MEM培养基中加入10%FBS。以1×104/mL,200μL/孔接种于96孔板,每组4个复孔,在培养的第1至7天,CCK-8法测定孵育2小时后于450nm波长处OD值,绘制细胞生长曲线。采用SPSS18.0软件进行统计学分析。结果表明,不同浓度的mPRP均可以促进SHED的增殖,且不同浓度的mPRP促进SHED增殖的作用不尽相同,其中以2%的mPRP促增殖能力最强。在整个细胞培养周期,2%mPRP与10%FBS促增殖作用无统计学差异；5%mPRP在培养的中后期,对SHED的促增殖作用与对照组无统计学差异,而高浓度的mPRP对SHED的促增殖作用反而较弱。mPRP有可能替代FBS用于SHED的体外扩增。第四章：改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞成骨分化作用研究将生长状态良好的第4代SHED按不同培养条件分为4个实验组和1个对照组,实验组在a-MEM培养基中分别加入1%,2%,5%和10%nPRP;对照组在a-MEM培养基中加入10%FBS。各组均加入矿化诱导液进行诱导矿化。培养2、4、6天后,按照碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒说明操作,520nm处酶标仪测各孔吸光度(OD)值,检测细胞ALP活性。结果显示,不同浓度mPRP均可增强SHED碱性磷酸酶活性,尤其是在第6天的时候,各实验组与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05),其中浓度为2%mPRP对SHED碱性磷酸酶活性的促进作用最大(P<0.01)。矿化诱导7天后,qRT-PCR检测RUNX2和骨钙素(osteocalcin, OCN)的mRNA含量,比较各组间SHED的RUNX2和OCN mRNA表达的差异。结果显示,mPRP对SHED内RUNX2和OCN mRNA表达促进作用具有浓度特异性,矿化诱导第7天时,2%mPRP组RUNX2和OCN mRNA表达量显著高于对照组,10%mPRP组OCN mRNA表达量与对照组无显著性差异,而10%mPRP组RUNX2mRNA表达量反而显著低于对照组。综上所述,本课题通过对PRP的制备和激活方法进行改良,在保证有效生长因子的浓度下,使mPRP的性状更易标准化；用不同浓度的mPRP对SHED分别进行体外扩增和成骨诱导,发现一定浓度的mPRP对SHED的增殖和骨向分化均具有一定的促进作用。选择具有更强体外增殖和成骨能力的SHED,并采用同体来源的mPRP进行体外培养,有可能解决目前制约体外组织工程骨构建中所存在的难题,从而提高组织工程骨体外构建的效率,降低成本,并增加临床治疗的安全性。本实验结果为mPRP和SHED更好地应用于骨组织工程提供了一定的实验依据。
汪华清[9]2015年在《miR-125b调控人骨髓间充质干细胞成骨机制的研究》文中指出研究背景和目的随着国内人口年龄结构逐渐步入老龄化,许多老龄化相关的疾病日渐引起医学界的广泛重视。骨质疏松作为一种老年人群高发的疾病,尤其重度骨质疏松具有较高的骨折风险,同时此类骨折发生后容易迁延不愈,是严重影响老年人健康和生活质量的一类骨科门急诊常见病。世界卫生组织已将骨质疏松、糖尿病与心血管病一起列为影响中老年人健康的“三大杀手”。此外,临床上因严重暴力所致的大段骨缺损、骨折后不愈合以及骨不连一直以来都是创伤骨科中的治疗难点。以上疾病的发生和发展均与机体内骨代谢失衡,成骨能力受损密切相关。因此,对成骨机制的研究和探索,将可能为这些临床问题的解决提供支持。人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)作为成骨细胞重要的一种前体细胞,在骨的形成和成骨分化上都起着重要的作用。随着对间充质干细胞成骨机理的研究不断深入,将有助于我们更好地理解多种骨病的病理过程,为此类疾病的治疗寻找新的思路。此外,hBMSCs具有较强的增殖能力和多向分化潜能,是骨组织工程领域最重要的种子细胞来源,同时在干细胞移植领域也具有广泛的应用前景。microRNA(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物细胞内的非编码单链小分子RNA,它能够与靶基因的3’非翻译区部分碱基互补结合,继而调控基因的表达,在生物体内众多基本的生理和病理过程中都扮演着重要的角色。近年来,越来越多的研究表明miRNAs在成骨细胞和破骨细胞的动态平衡中起着重要的调控作用,并且直接参与了诸多骨病如骨质疏松、关节炎等疾病的发生和发展过程。有研究发现,miR-125b在成骨过程中下调,但具体的调控机制尚不完全明了。本研究选定miR-125b作为研究对象,希望通过对miR-125b调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究。进一步丰富干细胞成骨定向分化的理论体系,同时可加深对骨骼发生、发育的分子机制认识,为骨质疏松防治,骨折治疗,骨缺损修复寻找新的治疗思路并提供理论支持。研究方法1.人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定使用密度梯度离心的方法,从健康成年志愿者捐献的骨髓中分离获取hBMSCs,通过传代、培养、纯化,获取稳定的干细胞来源。培养过程中注意观察贴壁细胞形态变化,使用MTT法检测其增殖活力。经流式细胞术检测细胞表面抗原对细胞属性进行鉴定,通过成骨、成脂、成软骨诱导分化,对hBMSCs的多向分化能力即干性进行鉴定。2.miR-125b对hBMSCs成骨分化的影响用慢病毒转染的方式对细胞进行干预。首先将人工合成的miR-125-pre和miR-125b-inhibitor核酸序列构建到慢病毒载体并转染hBMSCs。对转染后的细胞转染效率和增殖能力进行观察检测。然后,采用Real Time RT-PCR技术检测转染后细胞内miR-125b表达量的变化。最后,使用Real Time RT-PCR和Western Blot对间充质干细胞成骨分化过程中重要的成骨因子包括ALP,Runx2,OSX以及OCN的表达情况进行核酸和蛋白水平上的检测,观察其表达变化情况。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,通过细胞显色情况鉴定其成骨分化能力。3.miR-125b调控hBMSCs的作用靶点预测及验证首先,选用生物信息学的方法,使用Target Scan,miRanda及Pic Tar作为靶基因预测工具,对可能与miR-125b结合的靶基因序列进行筛选预测,选择可能与其结合的潜在靶点BMPR1b作为研究对象。随后,构建BMPR1b的荧光素酶报告载体,使用双荧光素酶报告的方法对所预测的靶基因进行初步验证。最后,将hBMSCs分别转染miR-125b的上调和下调慢病毒载体,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测当细胞内miR-125b表达水平变化时,BMPR1b的mRNA和蛋白表达变化。4.miR-125b抑制hBMSCs成骨分化的机制首先使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测hBMSCs成骨过程中BMPR1b的表达变化。随后,采用RNAi技术,将BMPR1b的siRNA载体转染hBMSCs,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测Runx2,OSX以及OCN的mRNA和蛋白表达变化。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,鉴定成骨分化能力。最后,将miR-125b-inhibitor与si-BMPR1b共转染hBMSCs,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测Runx2,OSX以及OCN的mRNA和蛋白表达变化。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,鉴定成骨分化能力。5.miR-125b调控hBMSCs成骨分化的体内研究首先,建立裸鼠股骨原位骨缺损模型。随后,将miR-125b-inhibitor转染hBMSCs,将细胞复合至DBM后进行成骨诱导,再通过手术的方式将DBM移植至裸鼠体内,利用micro CT观测新骨生成状况,采用组织切片,HE染色和Masson染色,从细胞的微观角度评估成骨能力。研究结果1.本实验所采用的密度梯度离心法分离获取hBMSCs,培养过程中细胞各项指标表明hBMSCs细胞形态正常,具有较强的增殖活力。hBMSCs的阳性表面抗原CD73,CD90,和CD105阳性率均在95%以上,而阴性抗原CD34,CD45,CD14,CD19,HLA-DR阳性率在5%以下。符合hBMSCs鉴定标准。此外,分离培养的hBMSCs具备成骨、成软骨和成脂的多向分化能力,具备良好的干性。2.在hBMSCs向成骨分化的过程中,miR-125b处于低水平表达的状态。慢病毒载体对hBMSCs转染效果较好,且对细胞的增殖不产生影响。在hBMSCs成骨分化过程中,上调miR-125b表达能够抑制成骨。相反地,下调miR-125b则能够促进hBMSCs的成骨分化。3.生物信息学预测出BMPR1b基因可能是miR-125的作用靶点。双荧光素酶报告实验证实miR-125b在细胞内能与BMPR1b的3’UTR部分碱基序列存在结合位点。在hBMSCs中,上调miR-125b能够抑制BMPR1b的mRNA和蛋白表达。相反,下调miR-125b则能够增加BMPR1b的mRNA和蛋白表达量。4.hBMSCs成骨分化过程中,BMPR1b呈高表达状态。沉默BMPR1b的基因后,hBMSCs的成骨能力下降。miR-125b-inhibitor与si-BMPR1b共转染hBMSCs后,hBMSCs的成骨分化能力同样受到抑制。5.对miR-125b调节成骨分化的体内研究发现,转染miR-125b-inhibitor后的hBMSCs,micro CT和组织切片染色其体内成骨能力强于阴性对照组。结论1.本实验所分离培养的hBMSCs增殖活跃,符合间充质干细胞的一般形态学特点。干细胞特性明显,经不同条件诱导,能向成骨、成脂以及成软骨细胞分化。纯度较高,干细胞来源稳定可靠。2.miR-125b能够负向调控hBMSCs成骨分化。3.miR-125b通过与靶基因BMPR1b的3’UTR部分碱基互补结合,从而抑制BMPR1b的表达。4.miR-125b通过抑制其靶基因BMPR1b的表达,进而抑制hBMSCs的成骨分化。5.复合hBMSCs的DBM骨移植材料,能够在体内较好地修复骨缺损。下调miR-125b的表达后,能够进一步提高h BMSC在体内的成骨能力。
王悦[10]2011年在《富血小板血浆对MG63，hADSCs及hDFbs细胞生物学行为影响的实验研究》文中认为富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)是从全血中提取的血小板含量超过全血4～5倍的血浆,研究表明PRP体外激活后,其中的血小板α颗粒可释放出多种生长因子,参与机体组织修复如减少出血、抗感染、加速软组织愈合、骨组织再生等,故近年来被应用于外科领域包括牙周病、种植义齿及口腔颌面外科等。但是,PRP中各生长因子间作用机制尚不清楚,且一些基础研究、动物实验和临床疗效之间出现相反结果,使PRP的有效性受到质疑,因此限制了其在临床的应用。为此本研究力图通过观察PRP对三种细胞—人成骨样细胞MG63、人脂肪间充质干细胞(hADSCs)、人真皮成纤维细胞(hDFbs)生物学行为的影响及其在兔颅顶骨缺损修复过程中的作用,从细胞水平、基因水平,探讨PRP应用中的一些问题。在对PRP提取方法的研究中,对三种离心方法进行了比较,采用流式细胞仪检测血小板表面标志因子CD41和活化标志因子CD62p,结果表明,第一次离心,1 600 r/min,10 min,第二次离心,5 000 r/min,5 min的提取方法,使血小板活化率低于PCCSkit法和Curasan法,更有利于保持血小板的稳定性;ELISA检测结果表明,单加CaCl2和CaCl2加凝血酶的激活方法均可促进PRP中血小板衍化生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的释放且两种方法间各有所长;控温(15～20℃)离心提取的PRP白膜层,较常温离心提取的更均匀;PRP激活后经离心提取的萃取液,较未经离心直接使用的PRP,更有利于镜下细胞形态观察。实验结果表明,适宜浓度的PRP对MG63的增殖、迁移均有促进作用;扫描电镜及激光共聚焦显微镜显示,加PRP后促进了MG63在材料表面的黏附、伸展及增殖,提高了MG63与纯钛材料及纳米磷酸钙胶原骨材料的生物相容性;实时定量-PCR检测结果表明,适宜浓度的PRP可上调细胞VEGF、I型胶原(COL-1)和骨形态发生蛋白-4(BMP-4)mRNA的表达,但PDGF和VEGF mRNA的表达趋势相反;Western blotting检测结果表明,PRP对MG63的原癌基因c-fos、c-myc、抑癌基因P27的蛋白表达均有促进作用,但对粘着斑蛋白Vinculin的表达则表现为抑制。适宜浓度的PRP可明显促进hADSCs的增殖;在无成骨诱导条件下,尽管PRP对hADSCs表现出促增殖作用,但对其成骨分化表现为抑制;成骨诱导条件下,PRP促进细胞增殖的同时,还表现为促进hADSCs的成骨分化,并具剂量依赖性;实时定量-PCR检测结果表明,适宜浓度的PRP可上调hADSCs的PDGF、VEGF、COL-1和BMP-4 mRNA的表达。适宜浓度的PRP可明显促进hDFbs的增殖;在成骨诱导条件下,PRP可促进hDFbs的成骨分化;免疫细胞化学检测表明,虽然PRP促进hDFbs的增殖存在剂量依赖性,但同一浓度的PRP对hDFbs表达PDGF、TGF-β和VEGF的影响不同,PDGF表达量高的组TGF-β1和VEGF表达量低,PDGF表达量低的组TGF-β1和VEGF表达量高;荧光染色观察PRP促进hDFbs在纯钛材料表面生长。RT-PCR检测发现,单独成骨诱导条件下,PDGF mRNA表达上调;有PRP存在的条件下,PDGF mRNA表达下调,VEGF mRNA对PRP的反应主要是上调。兔颅骨缺损修复实验中, X-射线和组织病理学检测结果表明,与单纯人工骨粉修复的缺损相比,PRP促进了新生骨形成,提高了骨密度,加速了人工骨材料与自体骨的融合。综上结果,不同种类的细胞、不同成熟状态的细胞对PRP的刺激反应不尽相同。PRP具有统一、协调细胞生物学行为的作用。在创伤愈合过程中PRP的主要作用是促进细胞的大量增殖,为组织修复提供大量的新生细胞,而让这些新生细胞表现出具体功能的刺激因子,应源于幼稚细胞所处的不同组织环境中的细胞通过旁分泌产生的刺激因子,而PRP则协同促进细胞功能的表达。在PRP存在的条件下,即损伤存在的病理条件下,成熟细胞中PDGF与VEGF mRNA是两种表达趋势相反的基因,VEGF的表达上调而PDGF表达下调。这些结果表明,组织、细胞对损失的首要反应是促进血管内皮增生,恢复局部血运,而后才表现出正常生理状态下的生物学功能。体外及体内实验共同证实PRP促进细胞增殖作用是确切的,本研究为进一步探讨PRP的生物学功能奠定了实验基础,提供了支持PRP临床应用的理论依据,为组织工程中干细胞的大量扩增及定向分化提供可行、有效的思路。
参考文献：
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[3]. ERK1/2-Runx2信号通路介导周期性张应力作用下牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制研究[D]. 任大鹏. 山东大学. 2016
[4]. PERK通路在炎症微环境影响牙周膜干细胞成骨分化中作用的研究[D]. 谈珺. 第四军医大学. 2016
[5]. 强直性脊柱炎Andersson病局部韧带成纤维细胞成骨能力的研究[D]. 夏萍. 青岛大学. 2018
[6]. 成纤维细胞的成骨能力[J]. 毕军花, 朱太咏, 石印玉. 中国组织工程研究与临床康复. 2007
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[8]. 改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的作用研究[D]. 文军. 南方医科大学. 2014
[9]. miR-125b调控人骨髓间充质干细胞成骨机制的研究[D]. 汪华清. 第三军医大学. 2015
[10]. 富血小板血浆对MG63，hADSCs及hDFbs细胞生物学行为影响的实验研究[D]. 王悦. 吉林大学. 2011