马超颖[1]2003年在《酿酒酵母氧化应激反应活性衍生物的初步研究》文中指出活性酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative，简称LYCD)是酵母细胞在人为控制的伤害条件下产生的具有促进细胞呼吸和修复作用的保护性物质，有重要的医用和美容价值。 本文对酿酒酵母氧化应激反应活性衍生物进行了初步研究，确定了H_2O_2刺激酿酒酵母产生高活性LYCD的条件；对LYCD中两种重要的抗氧活性成分——还原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)在氧化应激反应中的含量及活力的变化进行了研究，对LYCD中的应激蛋白进行了电泳分析。另外，本文还对酿酒酵母在紫外线照射条件下所产生的LYCD进行了初步的研究。 本文通过对酵母细胞破壁方法的研究，确定了液氮法为酵母细胞的破壁方法，其破壁率可达80％左右。通过对瓦勃氏呼吸法和紫外分光光度法进行比较，确定了紫外分光光度法为检测LYCD活性的一种简便适宜的方法。通过对实验菌株的筛选，确定酿酒酵母TQ22015为制备LYCD的实验菌株。通过单因素实验及正交实验，确定了产生高活性LYCD的最佳条件为：H_2O_2的作用浓度为0.2mmol／L，作用时间为15min。 对H_2O_2刺激所产生LYCD中GSH含量和SOD活力进行测定的结果表明：经H_2O_2刺激，酿酒酵母细胞中GSH含量和SOD活力均高于正常细胞中的水平；H_2O_2刺激15min，所产生LYCD中SOD的比活力最强；H_2O_2刺激30min，GSH的含量最高，说明不同的应激产物产生的最佳时间不完全相同。 SDS-PAGE凝胶电泳和二维凝胶电泳实验结果表明：在H_2O_2的作用下，酵母细胞发生应激反应，蛋白的表达发生了变化：合成了一些新的蛋白质，同时又有某些蛋白的合成受到了抑制。 对紫外线照射或H_2O_2刺激引起的酵母细胞的应激反应的初步研究表明：尽管这两种应激反应在反应机理上可能存在着差异，但其产生的LYCD却具有相似的生物活性，并都能引起GSH含量和SOD活力的增高，说明这两种应激反应具有一定的相关性。
杨华[2]2004年在《高温和氧化条件下酵母细胞应激产生活性物质的研究》文中指出本论文对酵母细胞在高温和氧化条件下的应激反应进行了研究，通过低剂量刺激酵母细胞产生活性衍生物—LYCD，并筛选了耐高温酵母突变株，开辟了制备LYCD的新途径。 本课题采用呼吸缺陷和正常的酵母菌，分析线粒体功能在酵母氧化应激和热应激反应中的作用。结果发现，呼吸缺陷酵母抵抗致死剂量氧化剂的能力比正常酵母差，说明线粒体对于细胞抗氧化是必需的。而呼吸缺陷酵母的抗热能力却比正常酵母强，说明线粒体对于细胞抗热具有阻碍作用。通过低剂量的预处理，两种酵母都对相应致死剂量产生适应性，说明适应性的产生与线粒体功能无关。 测定了酵母预处理前后细胞内几种重要抗氧化剂(GSH、SOD、CAT)的变化，结果表明：两种预处理都可以使正常酵母细胞中抗氧化剂含量提高。并分析了正常酵母预处理前后细胞内脂质过氧化物—丙二醛(MDA)的含量，发现两种预处理后，再在致死条件下作用，MDA的含量降低，细胞的存活率也升高。这不仅说明，预处理使细胞抗氧化水平提高，减少了MDA的积累，细胞增加了对氧化和热的抗性，更直接说明热致死与氧化关系密切。 将经过H_2O_2和37℃预处理后的酵母进行破壁，分别得到LYCD_1和LYCD_2，发现两者都对细胞抗氧化具有保护活性。分别对其处理条件进行优化，确定了LYCD_1的最佳处理条件为：0.4mmol／L H_2O_2预处理60min，LYCD_2的最佳处理条件为：37℃预处理30min。 通过紫外诱变筛选了耐高温酵母突变株，发现与正常酵母相比，耐高温突变株对热和氧化都具有很强的抗性。而且耐高温酵母提取物也具有保护细胞抵抗氧化的能力。并分析了正常酵母和耐高温酵母细胞内GSH、SOD、CAT的差异，发现耐高温酵母胞内抗氧化水平高于正常酵母菌株。 对正常酵母预处理前后蛋白的变化进行了双向电泳分析，结果表明，有一些蛋白是H_2O_2和37℃都可以诱导合成的，但也有些蛋白是H_2O_2或37℃特异性诱导合成的。此外，对耐高温酵母的蛋白分析后，发现它与正常酵母相比，产生了很多新的蛋白，其中包括热激蛋白，也应包括与细胞抗氧化有关的蛋白。
黄强[3]2008年在《糠醛对酿酒酵母应激作用的初步分析》文中研究表明本课题测定了不同白酒中的糠醛含量,证明了酱香型白酒中的糠醛含量远高于其它香型酒的糠醛含量。为了探明酱香型酒中糠醛含量显着的来源,本试验又从原料入手,分析不同轮次的发酵周期中酒醅的糠醛含量。实验结果显示,酱香型酒醅中的糠醛含量高于其它香型白酒酒醅中的糠醛含量。鉴于糠醛在酱香型白酒和酒醅中的显着性,我们接着分析了糠醛对酵母产LYCD(Live Yeast Cell Derivative,活性酵母细胞衍生物)的影响,通过单因素实验及完全实验,确定了产生高活性LYCD的最佳条件为:糠醛的浓度为0.30mL/L,作用时间为15min。提取了糠醛最佳应激条件下酵母细胞的总RNA,利用设计合成的引物对RNA进行RT-PCR扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳对HSP70基因在糠醛刺激前后表达情况进行半定量分析。结果显示,糠醛应激后较糠醛应激前,HSP70基因表达量明显较高,说明糠醛应激导致了HSP70基因表达量的增加。
陆筑凤[4]2009年在《茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激机制研究》文中提出酿酒酵母对高温发酵工艺有复杂的应激反应,能产生促进细胞呼吸和修复作用的保护性物质,称为活性酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative,简称LYCD),有重要的医用和美容价值。LYCD的主要活性成份包括大量的应激蛋白、多肽和氨基酸,但各种成份的功能和应激机理尚不明确。分析LYCD中的主要应激蛋白及功能,有助于揭示茅台酒的高温发酵机理和酿造工艺条件的优化。论文建立了酵母细胞高温和酒精共同刺激的茅台酒高温发酵条件实验模型,确定高温和酒精刺激产生高活性LYCD的条件为温度46℃,酒精浓度为4%(v/v),作用时间20min;对LYCD中的应激蛋白进行了分离提取和纯化,制定了蛋白样本制备的方案。采用分级提取LYCD中蛋白的方法,先提取大部分可溶性蛋白,再逐级提取微溶和难溶蛋白,样本中加入不含蛋白酶的DNase/RNase除杂,使用试剂盒对蛋白精确定量,保证相同上样量,确保实验的可比较性;摸索了双向电泳分离蛋白的最佳方法和实验条件,实现了蛋白的分离。通过7cm胶条预实验确定了双向电泳选用pH3～10非线性胶条,能在pH5～7之间得到较高的分辨率,充分均布酵母蛋白。一向电泳在20℃被动水化8h和50V电压主动水化4h后,逐步升压最终在8000V电压下充分聚焦72000VHrs。二向SDS-PAGE时采用溴酚蓝琼脂糖凝胶显示电泳进度,电泳结束用银染方法使蛋白固定和显色,银染的蛋白上样量小灵敏度高,利于低丰度蛋白的检出。使用ImageMaster2D Platinum5.0二维凝胶电泳图象分析系统对蛋白胶图进行分析,获得综合叁块平行胶的虚拟凝胶,比较分析了应激反应的差异蛋白,得出了10个含量差异3倍以上的蛋白点和13个有无差异点。最终选取14个蛋白差异点做质谱分析,软件搜索质谱结果获得蛋白点的详细信息,初步鉴定了8种蛋白,与应激反应密切相关的蛋白有乙醇脱氢酶,S-腺苷甲硫氨酸合成酶和细胞色素C过氧化物酶。其他5种蛋白与细胞周期或信号传导有关,分别是核糖体的组成蛋白、结构蛋白,烯醇酶,磷酸甘油酸变位酶和肌动蛋白。乙醇脱氢酶是酵母体内酒精的主要防御机制;细胞色素C过氧化物酶是催化以过氧化氢氧化还原型细胞色素c反应的过氧化物酶;S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是一种利用甲硫氨酸和ATP合成SAM的酶,SAM是谷胱甘肽合成的前体;烯醇酶有热激蛋白的功能。实验表明茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激反应机制是产生主要活性成份的机理之一,高温堆积发酵顶温控制在46～50℃具有很强的科学性。
白爱琴[5]2008年在《茅台酒高温发酵对活性酵母衍生物产生的影响》文中研究表明活性酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivagive,简称LYCD),是酵母细胞在人为控制的伤害条件下产生的具有促进细胞呼吸和修复作用的保护性物质,有重要的医用和美容价值。本文对酵母细胞在高温刺激和酒精刺激条件下,产生的活性酵母细胞衍生物进行了初步研究,确定了酵母细胞产生LYCD的最佳条件;并分别对酵母细胞在高温和酒精的刺激下的细胞变化做了显微镜观察。本文还对高温和酒精应激做了正交试验,优化了产生LYCD的条件,最后对LYCD中的活性成分用气相色谱和质谱联用(GC/MS)进行了成分分析。本文通过观察光学显微镜下的酵母细胞,发现细胞会随着温度的升高或者酒精浓度的增加,酵母细胞被更多的染成蓝色,这说明高温温度和酒精浓度超过一定的范围,对酵母细胞有毒害作用,从而引起细胞的早衰,死亡;并随着温度的和酒精浓度的升高,毒副作用加大。本文分别对高温和酒精刺激产生LYCD的最佳条件进行了优化,结果表明:酵母细胞在高温温度为48℃,作用时间为40min时产生的LYCD活性最强;在酒精应激条件下,产生最高活性LYCD的最佳条件为:酒精浓度为8%,作用时间为20min。同时也说明不同的刺激物对产生高活性的LYCD的最佳作用时间不完全相同。确定了高温和酒精共同作用酵母产生高活性LYCD的最佳条件为:作用温度46℃,酒精浓度为4%。共同作用时的最佳水平要比单因素的作用水平低,说明高温和酒精因素相互影响,加剧了对细胞的毒害作用。气相色谱质谱仪分析LYCD中的成分结果表明:LYCD中主要有烯烃类、杂环类、甾体类等化合物,若要检测出其具体的物质,还需进一步的研究。
马超颖, 戚薇, 路福平, 杜连祥[6]2003年在《活性酵母细胞衍生物的初步研究》文中研究表明活性酵母细胞衍生物 (LiveYeastCellDerivative ,简称LYCD)是酵母细胞在人为控制的伤害条件下产生的具有促进细胞呼吸和修复作用的保护性物质。研究结果表明 :LYCD对细胞具有明显的促呼吸作用 ;在过氧化氢的作用下 ,应激反应发生 15min时 ,所制备的LYCD具有最强的促呼吸作用 ;发生 30min时 ,LYCD中还原型谷胱甘肽 (GSH)的含量最高。对比实验还表明 :在不同的应激条件下所制备的LYCD ,具有相似的生物活性。
路福平, 杨华, 王玉, 杜连祥[7]2004年在《高温和H_2O_2诱导酵母细胞产生活性衍生物的研究》文中提出对高温和H2 O2 应激条件下产生活性酵母细胞衍生物 (LiveYeastCellDerivative ,简称LYCD)进行了研究。结果表明 :低剂量的预处理 ( 37℃和 0 2mmol LH2 O2 )能够增加细胞内谷胱甘肽 (GSH)含量 ,提高超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)活性。两种预处理均可以诱导对致死浓度H2 O2 的抗性。通过 37℃和 0 2mmol LH2 O2 处理酵母细胞后 ,提取LYCD并添加到酵母细胞培养液中 ,发现细胞在致死浓度H2 O2 作用下的存活率明显提高 ,说明温度和H2 O2 刺激酵母细胞形成的LYCD对细胞氧化具有抵抗作用。
马超颖, 戚薇, 路福平, 杜连祥[8]2003年在《H_2O_2应激条件下的活性酵母细胞衍生物的研究》文中认为对过氧化氢 (H2 O2 )应激条件下产生的活性酵母衍生物 (LiveYeastCellDerivative,LYCD)进行了研究。结果表明 :LYCD对细胞具有明显的促呼吸作用 ,其作用大小与制备LYCD过程中所加入的H2 O2 的刺激强度有关。另外 ,对LYCD中两种重要的抗氧剂———还原型谷胱甘肽 (GSH)和超氧化物歧化酶 (SOD)的测定分析结果显示 :在H2 O2 的作用下 ,应激反应发生 15min时 ,LY CD中SOD的比活力最强 ;发生 30min时 ,GSH的含量最高 ,不同的应激产物有各自产生的最佳时间。
王连秋[9]2016年在《氯碘喹啉对细胞金属离子稳态的调控作用研究》文中研究说明矿质元素是生物体生存所必需的重要基础物质之一,构成细胞组织成分,调节生理功能发挥重要作用。然而人体内必需金属离子失衡或坏境有毒金属离子的侵入将导致多种疾病的发生,如心血管疾病、神经退行性疾病等。氯碘喹啉(Clioquinol,CQ),最早用于治疗疟疾,但因产生一些副作用,如视网膜病变、心脏病等,被某些地区禁止使用。近来研究发现该药具有降低金属离子在中枢系统的富集,对神经退行性疾病有一定的治疗作用,重新引起了人们的重视,但其中的分子机制并不清楚。本文利用金属组的研究方法以及模式生物酵母(S.cerevisiae)研究了CQ对胞内金属离子内稳态调控的分子机制。首先,通过ICP-AES方法检测了CQ对小鼠不同组织内Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+、Mg2+和Ca2+含量的影响,数据显示Zn2+和Fe3+含量降低,而Ca2+含量升高。酵母中亦如此。其中钙离子参与神经递质的合成与释放,在细胞信号转导中也有重要生物学意义,所以深入研究了CQ对胞内钙离子的调节机制。利用pmc1△、vcx1△、pmr1△、cch1△多种钙离子转运缺陷菌株的药物敏感分析及离子检测分析,发现CQ处理,抑制细胞Zn2+、Fe3+吸收,但不同于EDTA的作用,促进了Ca2+富集,并与处理浓度成正相关性;但PMR1缺失突变后胞内钙离子含量基本不受CQ的影响,推测PMR1p可能是CQ的靶蛋白或CQ抑制了PMR1的表达。其次,用RT-PCR检测和荧光显微镜观察CQ对PMR1转录和PMR1-GFP表达的影响,结果表明CQ下调了PMR1的表达。进一步探究发现CQ的抑制作用依赖于转录因子CRZ1。随后将PMR1启动子区域(-1000~0bp)上含不同转录因子结合域的叁个片段分别插入荧光素酶标记基因(Ycplac33-Rluc)的起始密码子前,荧光素酶检测表明CQ对转录因子CRZ1p与PMR1启动子-918bp(b段)区域的结合起到调控作用而抑制PMR1表达;同时通过RT-PCR及CRZ1-GFP的检测也证实了CQ抑制了CRZ1p的表达水平。PMR1p是内质网、高尔基体膜钙离子泵ATPase,内质网是细胞内钙离子储存的主要场所,其与内质网应激息息相关。所以,最后检测了CQ对内质网应激的作用,结果发现CQ与DTT引起内质网应激机制不同,药物通过抑制PMR1的表达进而改变内质网钙离子内稳态来调控内质网应激反应。综上所述,CQ抑制了转录因子CRZ1的表达,同时抑制CRZ1p与PMR1启动子的结合,从而抑制了PMR1的转录,抑制了内质网/高尔基体对胞内钙离子的利用及外排,促进了液泡对钙离子的吸收,导致胞内钙离子升高。
沈辉[10]2017年在《酿酒酵母ARB2结构域和GAPDH3蛋白及金黄色葡萄球菌SA1684蛋白的结构生物学研究》文中研究说明酿酒酵母Hdal是典型的Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶,Hdal酶活性的发挥需要两个相关蛋白Hda2和Hda3的参与,它们组成去乙酰化复合体(HDAC),可特异性作用于H2B和H3的去乙酰化,发挥表观遗传调控的功能。Hdal以二体形式发挥酶活功能,由N端的催化结构域和C端结构域组成。其催化结构域的同源结构已有较多报道,并且其催化机制也得到很好的阐述。C端结构域由于与裂殖酵母中新发现的Argonaute结合蛋白Arb2具有一定序列同源度,因此被命名为ARB2结构域。已有的研究表明,Arb2蛋白能够结合Argonaute形成新的Argonaute复合体,参与RNA介导的基因沉默过程。对ARB2结构域结构和功能的研究既有利于对Hdal去乙酰化过程的深入了解,又有助于对Arb2蛋白家族结构与功能的认识。在本研究中,我们解析了2.86A Hdal-ARB2结构域的晶体结构,ARB2结构域由α/β三明治核心结构和一段长的延伸手臂区构成。在晶体结构中ARB2结构域一个不对称单位含一个亚基分子,但其延伸手臂区可通过晶体学对称相关形成相互作用二体。突变实验和分子排阻层析实验也证实ARB2结构域在溶液中以二体形式存在,两个ARB2结构域通过手臂区氨基酸的疏水相互作用形成倒“V”形二体结构。ARB2结构域与α/β折叠水解酶显示出结构相似性,但由于延伸区域不同,而且并不存在催化叁联体,因此不具有水解酶活性。Pull-down实验和ITC实验表明ARB2结构域具有组蛋白结合能力,能够结合H2A/H2B和H3/H4。ARB2结构域二体作用面残基的突变将丧失其与组蛋白结合的能力,表明ARB2的二体结构为结合组蛋白所必须。突变实验和ITC实验证明ARB2结构域通过二体结构形成的沟槽与组蛋白结合。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解中的重要酶,在辅因子尼古酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)存在下催化甘油醛-3-磷酸(GAP)氧化磷酸化为1,3-二磷酸甘油酸(BGP)。除此之外,大量的研究表明GAPDH还在DNA复制和修复,起始凋亡,细胞表面定位,结合细胞分子,膜融合和转运,tRNA出核和调节mRNA的稳定中发挥多种功能。GAPDH调节mRNA稳定性依赖于其对mRNA3'端AU富集元件(ARE)的结合,但是GAPDH对RNA结合的机制还没有阐明。在本研究中,我们通过荧光偏振实验确定酿酒酵母GAPDH3能够结合3段AUUUA重复的RNA序列,并对相同长度的polyA有近似的结合能力,但对相同长度的polyU和polyC却不能结合。修正了 2.49 A GAPDH3的晶体结构,在晶体学的一个不对称单位中含有一个分子,而分子排阻层析实验表明GAPDH3在溶液中以四聚体形式存在。我们利用晶体学对称操作获得了 GAPDH3四聚体结构模型。根据表面电势分析,我们发现该四聚体两端有两个连续的正电荷区域,该区域包含了 NAD+结合位点。荧光偏振实验证明NAD+可抑制GAPDH3对RNA的结合。在GAPDH3与NAD+复合物晶体结构中,我们发现NAD+分子的嘌呤环插入到GAPHD3窄的疏水口袋中并结合到GAPDH3的正电荷沟中。而腺苷酸与NAD+具有相同的腺嘌呤环头部,因此我们推测,GAPDH3对RNA识别的特异性来自于其正电荷沟槽中两个疏水的结合口袋紧密结合腺嘌呤,而其他位置只提供非特异的结合表面。金黄色葡萄球菌能够产生多种毒力因子引发人类疾病,毒力因子的表达受到一系列调控因子严格调控。最近发现金黄色葡萄球中的核苷磷酸酶SA1684蛋白能够影响毒力因子的表达。核苷磷酸酶从原核生物到真核生物广泛存在,从蛋白序列上看,SA1684蛋白与这些报道的核苷磷酸酶大不相同,这暗示着SA1684蛋白可能成为一个很有前途的抗金黄色葡萄球菌的药物靶点。因此对SA1684蛋白对底物结合模式和催化机制的研究具有重要意义。在本研究中,我们解析了 SA1684蛋白的apo、ATPγS+钙离子、GDPβS+镁离子和GTPyS+钙离子四种形式的晶体结构,晶体学一个不对称单位中含有一个分子。结构比对发现SA1684蛋白活性口袋有两处碱基结合位点,可以结合长度不同的核苷二磷酸(NDPs)和核苷叁磷酸(NTPs)。在不同的复合物结构中都存在两个金属离子,两个金属离子之间都存在一个保守的水分子,根据与同源蛋白结构比对我们推测这个水分子可能通过亲核攻击底物上的磷原子来参与水解反应。
参考文献：
[1]. 酿酒酵母氧化应激反应活性衍生物的初步研究[D]. 马超颖. 天津科技大学. 2003
[2]. 高温和氧化条件下酵母细胞应激产生活性物质的研究[D]. 杨华. 天津科技大学. 2004
[3]. 糠醛对酿酒酵母应激作用的初步分析[D]. 黄强. 贵州大学. 2008
[4]. 茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激机制研究[D]. 陆筑凤. 贵州大学. 2009
[5]. 茅台酒高温发酵对活性酵母衍生物产生的影响[D]. 白爱琴. 贵州大学. 2008
[6]. 活性酵母细胞衍生物的初步研究[J]. 马超颖, 戚薇, 路福平, 杜连祥. 微生物学通报. 2003
[7]. 高温和H_2O_2诱导酵母细胞产生活性衍生物的研究[J]. 路福平, 杨华, 王玉, 杜连祥. 微生物学通报. 2004
[8]. H_2O_2应激条件下的活性酵母细胞衍生物的研究[J]. 马超颖, 戚薇, 路福平, 杜连祥. 生物技术. 2003
[9]. 氯碘喹啉对细胞金属离子稳态的调控作用研究[D]. 王连秋. 东华大学. 2016
[10]. 酿酒酵母ARB2结构域和GAPDH3蛋白及金黄色葡萄球菌SA1684蛋白的结构生物学研究[D]. 沈辉. 中国科学技术大学. 2017