王柳[1]2001年在《马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建》文中指出马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。由于慢病毒给人类和动物的健康造成了严重的威胁，因此慢病毒的免疫预防，尤其是艾滋病的免疫预防成为研究的热点。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的动物模型。马传贫驴白细胞弱毒疫苗（DLA-EIAV）是将分离自辽宁省的EIAV L株通过驴体传代，使其毒力明显增强（称为驴强毒，DA-EIAV），然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。在这一过程中，EIAV L株由强毒变为弱毒，用此弱毒疫苗接种动物后不表现临床症状，但可诱导免疫保护。为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制，为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴，我们对马传贫驴白细胞弱毒及其亲本马强毒EIAV L株前病毒进行了全基因克隆和序列测定，比较分析了二者的前病毒基因组核苷酸序列，在此基础上构建了EIAV驴白细胞弱毒株的感染性分子克隆和叁株含有EIAV强/弱毒嵌合病毒基因组的重组质粒，并对EIAV弱毒株长末端重复序列（LTR）的启动子活性进行了初步研究。 本研究以DLA-EIAV感染细胞总DNA及其亲本强毒EIAVL株感染马外周血液白细胞中DNA为模板，应用PCR方法分段扩增出DLA-EIAV和L株的前病毒，并将各段扩增产物克隆后进行测序。根据国外发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列，推导出DLA-EIAV和L株全基因组核苷酸序列，经比较分析，DLA-EIAV株前病毒基因组全长8266个碱基，EIAV L株前病毒基因组共有8235bp。DLA-EIAV株与其亲本马强毒L株和驴强毒DA-EIAV株核苷酸序列相比，同源率分别为97.0%和97.5%。DLA-EIAV株和L株相比，长末端重复序列（LTR，由U3、R、U5组成）、编码囊膜糖蛋白的基因env及ORF S2的变异率很高，U3、R、U5、env及ORF S2核苷酸序列差异率分别达13.2%、7.5%、5.1%、2.7%和3.9%，env基因及ORF S2推导的氨基酸序列差异率分别为4.4%和8.8%。EIAV L株与国外已发表的一些相关毒株相比核苷酸序列差异很大，同源性只有79%，RTase的氨基酸同源率只有86%，Gag蛋白的的同源率只有79%，说明EIAV L株与国外已报道的几个EIAV毒株的亲缘关系较远。 通过对EIAV L株与DA-EIAV、DLA-EIAV及国外相关毒株的gp90推导的氨基酸序列进行比较，发现在同一毒株系列内，N-连接糖基化位点增多与病毒毒力具有正相关性。这一现象提示我们，DLA-EIAV株gp90 N-连接糖基化位点的减少可能是弱毒产生免疫保护的原因之一。 马传贝性贫血病驴白细跑弱耳及其亲本马强霉儿株）王 柳 基因组序列比较分析以及弱霉感染性分子克巨的构建2001年6月 DLA－EIAV与L株在前病毒U3增强子区的主要差别是，DLA－EIAV含有转录因子bHLH作用一致序列E－oX，而L株U3增强子区不存在这一基序。通过对DLA－EMV和L株比较发现二者TAR的二级结构不同，DLA－EIAV株TAR茎的起始部位发生了改变，形成一个尿啼陡突起。由于病毒基因的表达受细胞转录因子和反式激活蛋白Tat的调控，驴白细胞弱毒增强子区卜七Ox的引入和病毒反式激活应答区TAR结构的改变，可能使弱毒的细胞嗜性改变和在体内复制能力下降，表现为毒力减弱。 将克隆的DLA－EDeV株各个片段顺次连接，获得了一个含有EMV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为EIAV－ps．2，经核昔酸序列分析，证明ps二含有EIAV前病毒的全基因。用EMV－ps．2转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶，说明在驴白细胞中由ps二衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后，第4天出现病变，经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，进一步证明EMV－ps二具有感染性，获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆。 为了进一步研究弱毒LTh和env基因的变异与毒力减弱及诱导免疫保护之间的关系，我们将 DLA－EL＼V感染性分子克隆的乙h用 EInV L株的 LTR替换，另外将DLA－EMV感染性分子克隆的gp90编码区用乙株的gp90编码区替换，并将EIAV L株的LTh和gp90编码区同时替换DLA－EMV株感染性分子克隆的相应片段，获得了叁株含有EIAV强溺毒嵌合病毒基因组的重组质粒。 将我国马传贫病毒弱毒株的长末端重复序列克隆于含CAT基因的载体中，获得重组质粒 pCAT七TR，用 pCAT－LTh分别转染驴胎皮肤细胞（FDD）、胶质母细胞瘤 （TJ－905）细胞、驴臼细胞及接种 EtaV弱毒的 FDD和驴白细胞，结果以 EIAV弱毒的LTR为启动于，CAT在这几种细胞中均获得了不同程度的表达，证实了我国EMV弱毒株的LTh在FDD、TJ－905及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能，并能被反式激活表达。 总之，本研究首次获得了我国DLA－EIAV和L株前病毒全基因克隆，确定了DLA－EIAV和 L株前病毒基因组核昔酸全序列，?
刘红全[2]2001年在《马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组克隆及序列分析》文中研究指明马传染性贫血病病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）是马传染性贫血病（Equine infectious anemia，EIA）的病原。它与人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiency virus，HIV）同属于反转录病毒科慢病毒属，二者在病毒形态、基因组结构、遗传性、抗原性、细胞嗜性、变异性等方面都极为相似，因此，EIAV可作为研究HIV分子致病机理的动物模型。我国的EIAV弱毒疫苗是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，成功地控制了我国EIA的流行。该毒株是由EIAV L株（EIAV L）通过驴体传代，使其毒力明显增强，然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。为揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱的分子机制，为HIV及其他慢病毒疫苗的设计和研究提供有价值的理论依据，在已测得马传贫驴强毒（Donkey-adapted equine infectious anemiavirus，DA-EIAV）及驴白细胞弱毒（Donkey leukocyte attenuated equine infectiousanemia virus，DLA-EIAV）全序列的基础上，我们对EIAV L株前病毒进行了全基因组克隆和序列测定。 本研究以EIAV L株感染马的外周血液白细胞DNA为模板，利用PCR技术，分四个片段扩增EIAV L株前病毒DNA，并分别克隆到载体质粒pBluescript SK中，再经亚克隆最终得到EIAV L株前病毒全基因克隆pLV。该前病毒基因组全长8235bp，其中G+C含量为38％。基因组两端是长为316bp的LTR，其中U3区长为197bp，R区为80bp，U5区为39bp。前病毒基因组有叁个较长的开放阅读框架（ORF），分别是gag、pol和env基因。gag基因位于713-1912位碱基之间，全长1200bp；pol基因位于1708-5109位碱基之间，全长3402bp；env基因位于5305-7896位碱基之间，长2592bp。此外前病毒还有叁个小的ORF，S1位于5113-5265位碱基之间，长153bp，S2位于5279-5482位碱基之间，长204bp，S3位于7245-7646位碱基之间，长402bp。 通过使用计算机软件DNAsis分析，EIAV L株与DA-EIAV和DLA-EIAV序列同源性分别为98.4％和96.9％。同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外EIAV L株与DA-EIAV的同源性高于其与DLA-EIAV的同源性，这符合DLA-EIAV的衍生过程。EIAV L株与国外已发表的一些相关毒株相比核苷酸序列差异很大，同源性只有79％，RTase的氨基酸同源率只有86％，Gag蛋白的同源率只有79％，说明EIAV L株与国外已报道的几个EIAV毒株的亲缘关系较远。 尽管EIAV L、DA-EIAV及DLA-EIAV毒株与国外的几株EIAV病毒差异很大，但是在EIAV生命周期中起重要作用的几个已知功能区是保守的。P9的YXXL基序、P11的两个锌指结构以及大多数反转录病毒蛋白酶中均具有的N端D-T-G基序和C端的L/I-G-R-D/N基序在所有的毒株中都是一致的；各毒株Gp90有六个N-连接糖化位点位置高度保守；Gp45有四个N-连接糖化位点在所有毒株中均是保守的，并且在免疫决定区内对维持Gp45构象起重要作用的两个Cys在所有毒株中的位置是保守的；Tat蛋白中起转录激活作用的核心区在各毒株中完全一致，基本区中对与TAR结合所必须的Glu在各毒株中的位置也完全保守；Rev蛋白的基本区在各毒株之间也很保守。这些保守区的确立，为进一步研究EIAV的结构与功能提供了极有价值的信息。 刘红全 槽要20（）年5月 EIAV L株的pOI基因在重迭区没有起始码ATG，DA－EIAV、DLA－EIAV株也是如此； 对 EIAV各毒株 omol重迭区 5’端分析表明，都存在一个保守的茎－环结构，进一步 证明了EIAV P。1的翻译机制为移框阅读。 TAR是Tat蛋白的反式激活应答区。通过对EIAV L株及相关毒株进行比较，只有 DLA－EIAV株TAR茎的起始部位发生了改变，这可能影响到转录的效率，并使其毒力减弱。 总之，本研究首次克隆了我国EIAV L株前病毒全基因组，测定了EIAV L基因组核 苔酸全序列，并对 EIAV L、DA－EIAV、DLA－EIAV及国外相关的 EIAV毒株进行了比较分析， 为揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱的分子机制奠定了重要的分子生物学基础，进一步 丰富了慢病毒的基础理论研究。
杨志彪, 王柳, 童光志, 孔宪刚, 仇华吉[3]2001年在《马传染性贫血病病毒驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组核苷酸序列分析》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病病毒 (EIAV)是马传染性贫血病 (简称马传贫 ,EIA)的病原。我国的EIAV弱毒疫苗是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗 ,成功地控制了我国EIA的流行。本研究从EIAV弱毒疫苗株 (DLA)感染的驴白细胞中提取前病毒DNA ,以提取的前病毒DNA为模板 ,利用PCR技术分 3个片段扩增EIAV前病毒 ,这 3个片段覆盖全部前病毒DNA。将这 3个片段分别克隆到载体质粒pBluescrtiptsK中 ,得到 3个重组质粒P2 .8,P2 .4,P4.1,经酶切鉴定后 ,测序。对测序结果分析、拼接 ,得到EIAV驴白细胞弱毒疫苗株前病毒基因组全序列。EIAVDLA株前病毒基因组全长 82 6 6bp。基因组两端是长为334bp的LTR ,其中U3为 2 14bp ,R为 81bp ,U5为 39bp。前病毒基因组有 3个较大的开放阅读框架 (ORF) ,分别编码gag、pol和env基因。gag基因位于 732～ 1931位碱基之间 ,全长 12 0 0bp ;pol基因位于 172 7～ 5 12 8位碱基之间 ,全长 34 0 2bp ;env基因位于5 32 4～ 7912之间 ,长为 2 5 89bp。此外前病毒还有 3个小的ORF ,S1位于 5 132～ 5 2 84位碱基之间 ,长为 15 3bp ;S2位于 5 2 98～ 5 5 0 1位碱基之间 ,长为 2 0 4bp ;S3位于 72 5 8～ 76 5 9位碱基之间 ,长为 40 2bp。本研究结果为进一步确定EIAV的基因功能、揭示马传贫疫苗毒的致弱?
耿庆华[4]2006年在《我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究》文中提出本研究用PCR方法对马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株(Agen-EIAV)感染马外周血白细胞的前病毒DNA进行了分段扩增,克隆和序列测定,并参考Genbank已经发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列,应用基因分析软件拼接出Agen-EIAV全基因核苷酸序列。经分析Agen-EIAV株前病毒基因组全长为8227bp,与我国马传贫辽宁强毒株(LN)、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株(DLV)及美国代表毒株(AF028232)核苷酸序列比较,同源率分别为65%、65%和75%。与AF028232株gag、pol和env、gp90和gp45基因核苷酸同源率分别为99%、99%、75.6%、69.4%和80.4%;而与我国DLV的同源率分别为79.7%,82.3%,72.8%,65.2%和78.6%。Agen-EIAV株gag和gp90推导氨基酸序列与美国4个毒株的氨基酸序列高度同源,而与我国4个毒株却存在很大的差异。 本研究对接种Agen-EIAV的试验马(16#)出现的四个发热期(23d、40d、51d和70d)的外周血单核细胞前病毒DNAgag和gp90的核苷酸序列进行了监测,结果发现四个发热期中前病毒gag核苷酸序列变化不明显,变异率在1%之内。gp90核苷酸序列变化较大,变异率在8～10%之间,可划分出A1、A2、A3和A4四个高变区。其中A1、A3和A4在马体发病的整个过程中均发生一次变异,而A2区在第叁个发热期发生变异后,在第四个发热期又回复了突变。结果表明,gag在马传染性贫血病毒与宿主细胞基因组整合之后非常稳定,可以选择此区域设计鉴别诊断的引物。从gp90推导的氨基酸序列可划分为5个可变区,都与N-连接的糖基化位点有关系,进一步证明马传贫病毒囊膜糖基化位点的变化与毒力相关。 本研究在对马传染性贫血病毒美洲等流行毒株和我国弱毒疫苗株全基因序列比较分析的基础上,共设计了11条引物,用于在病毒接种驴白细胞培养物上进行PCR鉴别诊断引物的筛选,通过试验筛选确定选用在gag区设计的6条引物。通过对2匹健康马(2#和31#),9匹分别接种我国DLV(1#、9#和10#)、Agen-EIAV(16#、45#和46#)和美国代表毒株(Wyoming-EIAV)(3#、4#和44#)试验马的检测及PCR反应条件的进一步优化,而确定鉴别马传贫病毒美洲流行毒株和我国弱毒疫苗株的套式多重PCR方法。试验结果表明当用引物C1/C2n/C3n进行第二轮PCR扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出与设计相符的两个片段,分别为675bp和400bp,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞只能扩增一条675bp的片段;当用引物C1/AF2n/C3n进行扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出一条675bp的片段,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞却能扩增出两个片段,分别为675bp和400bp。而健康马外周血白细胞扩增不任何条带。本试验同时对3匹疫苗免疫马、2匹美洲流行毒株慢性传贫马(45#和46#)和4匹急性传贫马(16#、3#、4#和44#)进行了长时间的跟踪检测,分别可在接毒后最早第7-30天从外周血中检出病毒,至接种后12个月大都可以检出。结果表明本试验建立的PCR鉴别诊断方法具有很好的稳定性和可重复性。本试验还用real-time PCR的方法检验本试验建立的PCR鉴别诊断方法的敏感性,结果表明套式多重PCR可以检出我国DLV免疫马最低病
涂亚斌[5]2005年在《马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用》文中指出马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)属反转录病毒科慢病毒属,是马传染性贫血(EIA,简称马传贫)的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗,该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行,是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列(LTR)对病毒复制有重要的调控作用,影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白,由于其基因的高度变异性,受到病毒学研究的普遍关注,通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析,发现二者的LTR和env基因(尤其是gp90编码区)差异较大。 为了研究env基因gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用,我们以EIAV强毒辽宁株(L株)接种健康马,从不同时期发热期马血清中以RT-PCR扩增包含完整S2基因和gp90基因片段;同时以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段,将所得的强弱毒共30个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒(如HIV、SIV)研究过程中发现,糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现,gp90基因V3到V5区在强毒和弱毒之间差异显着,而在各自内部相对保守,变异较小。对27个S2基因进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,S2基因中也存在着3个非常一致的点突变,没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV-DLA env基因变异研究的基础上,我们将马传贫强、弱毒gp90全长及部分(V3-V5区)分别连接到逆转录病毒载体pBABE-puro,通过转染将马传贫强、弱毒env基因整合到包装细胞系PA317中,利用抗性筛选到稳定表达细胞系;然后将马传贫强、弱毒gp90全长及V3-V5区分别连接到高效真核表达载体pcDNA3.1(+),转染293T细胞系并经抗性筛选及亚克隆后获得高效稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-V5区基因的细胞系,为研究gp90及V3-V5区结构与功能打下了良好的基础。然而,我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为主的慢病毒研究表明LTR和env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,构建了一系列N-连接糖基化突变分子克隆,力图对N-连接糖基化在我国马传染性贫血病毒致弱过程中的作用进行阐述,通过转染驴白细胞并盲传10代后仍未获得N-连接糖基化突变病毒,我们推测可能的原因是由于N-连接糖基化的突变均位于env基因的V3-V5区,影响了在驴白细胞上的细胞嗜性。 为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,我们在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆和EIAV-L株前病毒DNA全基因组分子克隆的基础上,用EIAV-L株的LTR和gp90编码区分别替换EIAV-DLA株感染性分子克降的相应片段,
王雪峰[6]2007年在《中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析》文中指出马传染性贫血病毒是反转录病毒科慢病毒属的重要成员,是马传染性贫血的病原体。在上世纪七十年代我国成功研制的马传染性贫血白细胞弱毒疫苗,为我国成功控制了马传染性贫血的流行。马传然性贫血白细胞弱毒疫苗的致弱机理将为其他慢病毒疫苗的开发提供借鉴。本文为阐明马传染性贫血弱毒疫苗的致弱机制和免疫保护机理,结合准株理论,利用LA-PCR技术对马传染性贫血病毒驴强毒株(DV)和驴白细胞弱毒疫苗株(DLV)的前病毒DNA分两段进行扩增,挑取多个克隆测序。最后获得10个DLV前病毒序列,4个DV前病毒DNA序列,21个DLV的LTR,19个DV的LTR,并构建了DV的全长克隆。通过分析比较得出,DV前病毒基因组与DLV前病毒基因组的平均差异率是2.8%。其中S2、LTR和env基因差异较大,核苷酸序列差异率分别是4.1%、3.9%和3.1%;S2、S3和env推导的氨基酸的差异率较大,分别是10.4%、5.6%和4.8%。与国外毒株相比,中国马传染性贫血病毒属于独特的一个支系。本实验首次发现体外培养的DLV株的至少有5种类型的LTR混合存在。gp90推导的氨基酸序列上中国EIAV强毒株比弱毒株多2个N-糖基化位点,其中强毒株有3个特有的N-糖基化位点;弱毒株有1个。总之,本文结合准株理论对中国马传贫驴强毒株和白细胞弱毒疫苗株前病毒基因组核苷酸进行分析,对中国马传贫病毒强弱毒株间的一致性变化进行了讨论,并成功构建了DV株的全长基因组克隆,为进一步研究EIAV毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定了基础。
鲁山[7]2006年在《马传染性贫血病毒分离株WH17全基因组克隆、序列分析及LTR启动子活性研究》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一，可以引起马属动物的一种急性烈性传染病，以贫血、持续感染、反复发热为特征，终生持续感染，是马属动物最重要的传染病之一。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列(LTR)对病毒复制有重要的调控作用，影响到病毒的复制动力学、细胞嗜性、致病力等方面。 本研究利用PCR方法分四个片段扩增了从自然感染马分离的马传染性贫血病毒(简称马传贫)的前病毒DNA，将PCR产物克隆于pMD18-T载体，得到四个重组质粒P2.8、P2.4、P2.6、P1.2。经PCR、酶切鉴定后进行序列测定，分析、拼接得到马传染性贫血病毒野外分离株前病毒的全基因组序列，其基因组全长8268bp。通过DNAStar分析，此分离株与马传贫病毒L株(L-EIAV)、马传贫驴强毒株(DA-EIAV)、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)的序列同源性分别为86.0％、85.8％和85.2％。 通过对EIAV分离株WH17的LTR与L株、DA和DLA株的LTR序列进行比较，发现其在在U3-R结合处多一个E-box基序，推测该基序的变化可能会起到促进转录作用，为此将EIAV强毒株(DLA-25)、驴白细胞弱毒株(DLA-118)、EIAV分离株WH17以及U3-R结合处的E-box基序点突变的LTR分别克隆到pCAT3-basic质粒中的报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的上游，获得一系列受不同LTR控制的CAT表达质粒。分别将含有不同来源LTR的CAT表达质粒转染驴胎皮肤细胞(FDD)、驴白细胞及接种EIAV弱毒的FDD及驴白细胞，结果显示：在驴白细胞Tat蛋白可以特异性地增强EIAV-DLALTR的启动子活性，分离株WH17LTR的U3-R结合处的E-box基序对Tat的反式激活作用并无明显影响，而在驴胎皮肤细胞中，LTR启动活性也没有检测到。结果提示：EIAV分离株WH17的LTR U3-R结合处的E-box基序没有起到促进转录的作用，LTR是病毒嗜性影响的因素之一。
刘红全, 王柳, 杨志彪, 孔宪刚, 童光志[8]2001年在《马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组核苷酸序列分析》文中指出本实验所用的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）Ｌ株（ＥＩＡＶ－Ｌ）是我国研制成功的ＥＩＡＶ弱毒疫苗的原始强毒株。以ＥＩＡＶ－Ｌ感染马外周血液白细胞中ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术，分４个片段扩增ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒ＤＮＡ，并分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中，得到 ４个重组质粒ｐ２．８、ｐ２．４、ｐ３．１和 ｐ１．２，经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接，得到 ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全序列。ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全长 ８２３５ｂｐ，其中 Ｇ＋Ｃ含量为 ３８％。通过使用计算机软件ＤＮＡＳＩＳ分析，ＥＩＡＶ－Ｌ与马传贫驴强毒和马传贫驴白细胞疫苗毒序列同源性分别为９８．４％和９６．９％。同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外 ＥＩＡＶ－Ｌ与驴强毒的同源性高于其与驴白细胞弱毒疫苗株的同源性，这符合驴白细胞弱毒疫苗株的衍生过程。基因组两端是长为３１６ｂｐ的ＬＴＲ，其中Ｕ３为１９７ｂｐ，Ｒ为８０ＢＰ，Ｕ５为３９ｂｐ。前病毒基因组有 ３个较大的开放阅读框架（ＯＲＦ），分别编码 ｇａｇ、ｐｏｌ和 ｅｎｖ基因。ｇａｇ基因位于 ７１３～１９１２位碱基之间，全长１２００ｂｐ；ｐｏｌ基因位于 １７０８～５１０９位碱基之间，全长 ?
佚名[9]2002年在《创新研究群体:童光志 仇华吉 王柳 王云峰 刘胜旺 蔡雪辉 周艳君 韩凌霞 薛强 袁秀芳研究方向:动物病毒分子生物学》文中研究表明童光志博士领导的研究小组近十年来一直坚持不懈地从分子生物学水平对动物病毒病进行广泛而深入的研究,取得了丰硕的成果。他本人曾两次赴美留学都如期而归,扎根于我国畜牧兽医科研领域,其精神难能可贵。在学术方面,他们率先报道了牛Ⅳ型疱疹病毒基因组的精确大小及物
李强[10]2009年在《马传染性贫血病毒部分致弱毒株体外和体内的进化分析》文中指出我国研制成功的马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株DLV是将一株来源于马体的EIAV强毒LV (辽毒株)经过驴体连续传代100余代使其病毒毒力增强后获得了驴强毒株DV(对马和驴致死率为90%),然后将该驴强毒株通过驴白细胞体外连续培养驯化120余代,使该毒株病毒毒力丧失的同时又保持了良好的免疫原性,最终培育成功了EIAV驴白细胞弱毒疫苗。将驴白细胞弱毒疫苗株进一步通过驴胎皮肤细胞继代,又获得比驴白细胞弱毒疫苗免疫保护效果更好的驴胎皮肤细胞弱毒疫苗FDDV。为探讨驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株FDDV在免疫成熟马体内的进化规律,本研究采用nest PCR方法对FDDV免疫成熟马(FDDV免疫24个月后)体内的低拷贝的FDDV前病毒基因组DNA进行了分段(5段)扩增和序列分析,旨在找出FDDV长期在免疫马体内的进化规律并推导出其在体内的优势序列,通过与体外FDDV基因组进行比较分析,找到驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株FDDV体内体外演化过程中保守及变化区域。最终每段得到5个阳性克隆的序列。通过比较分析发现:免疫马体内LTR与FDDV3-8 LTR的同源率平均为98.8%,env编码的氨基酸序列的同源率平均为96.1%。免疫马体内外FDDV的囊膜蛋白gp90变异较大,与体外gp90相比免疫马体内gp90的N-糖基化位点有增加现象。为阐明EIAV疫苗的致弱机制和免疫保护机理,本研究采用LA-PCR技术对驴白细胞弱毒疫苗株减毒过程中第92代次毒株(DLV92)前病毒基因组DNA进行了扩增和序列分析,旨找出潜在的与毒力变化和免疫保护相关的稳定变异位点和相关特性。本实验成功的得到了8株接近DLV92全长的8Kb的前病毒基因组核酸序列。通过比较分析得出:DLV92与DLV878(疫苗株DLV ,GenBank中登陆号为AF327878)同源率平均为98.1%,与LV877 (EIAV强毒辽宁株LV,GenBank中登陆号为AF327877)核苷酸序列的同源率平均为97.7%。DLV92囊膜蛋白gp90上存在17个N-糖基化位点,与疫苗株DLV878一致,比亲本强毒LV877的囊膜蛋白gp90少4个糖基化位点,比DLV61少2个糖基化位点。本研究结果将为进一步研究EIAV致弱过程中毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定基础。
参考文献：
[1]. 马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建[D]. 王柳. 中国农业科学院. 2001
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[4]. 我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究[D]. 耿庆华. 中国农业科学院. 2006
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[6]. 中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析[D]. 王雪峰. 内蒙古农业大学. 2007
[7]. 马传染性贫血病毒分离株WH17全基因组克隆、序列分析及LTR启动子活性研究[D]. 鲁山. 华中农业大学. 2006
[8]. 马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组核苷酸序列分析[J]. 刘红全, 王柳, 杨志彪, 孔宪刚, 童光志. 中国农业科学. 2001
[9]. 创新研究群体:童光志 仇华吉 王柳 王云峰 刘胜旺 蔡雪辉 周艳君 韩凌霞 薛强 袁秀芳研究方向:动物病毒分子生物学[J]. 佚名. 科技和产业. 2002
[10]. 马传染性贫血病毒部分致弱毒株体外和体内的进化分析[D]. 李强. 黑龙江大学. 2009
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