吕健龙[1]2016年在《重组人白介素-2纯化工艺的改进及放大研究》文中提出白介素-2作为一种免疫调节的细胞因子。能够促进B细胞的增殖和分化;促使T细胞得快速增殖;可以对NK细胞进行诱导实现其分化以及增殖。目前市售的白介素-2主要以基因工程表达的重组人白介素-2为主;生产工艺主要以基因工程菌为基础,利用生物发酵法配合大规模的分离纯化技术,得到高纯度的重组人白介素-2,制成重组人白介素-2成品。由于目前重组人白介素-2生产工艺及设备产能较小,不能满足市场的需求。为了紧跟市场发展,适应市场需求,对重组人白介素-2的生产情况进行研究,进行产能升级。主要通过对菌体破碎环节进行设备更新,实现菌体破碎的产生升级;并对下游纯化规模进行放大,实现生产工艺的产能提升。本文的具体研究如下:1.细胞破碎工艺改进及放大针对现有破碎工艺处理能力不足的问题,采用高压匀浆破碎仪代替原有工艺,对该工艺中的参数进行了研究,确定了最优的工艺条件为:匀浆压力55MPa,匀浆破碎两遍,初始温度不高于14℃,对整个匀浆过程冷却处理;实验结果显示,菌体破碎率、产品电泳纯度和单位时间的处理量均达到最优;与现有工艺相比,重组人白介素-2的电泳纯度提高了 9.2%,温度升率降低了 63.7%,单位时间的处理量提高了 27倍。2.凝胶层析工艺放大研究了层析柱规格对重组人白介素-2纯化效率的影响,确定了层析柱规格为φ20cm×80cm的层析柱,线性流速为0.19cm/min情况下,目标蛋白质的收率、电泳纯度较原工艺保持一致,单位时间的处理量较原有纯化工艺有了提高;与现有工艺相比,单位时间的处理量提高了4倍。3.复性过程放大研究了直接稀释复性中,不同复性规模和复性时间对重组人白介素-2复性效果的影响情况。确定了复性体积10L,复性时间5小时为最佳条件,复性后的生物学活性增和单位时间的处理量均有明显提高;与现有工艺相比,电泳纯度保持稳定,生物学活性与比活性均上升了 16.8%,单位时间的处理量提高了 3.7倍。
邹险峰[2]2004年在《重组人白细胞介素-2的化学修饰》文中指出重组人白细胞介素-2（Recombinant Human Interleukin-2，rhIL-2）由133个氨基酸组成的单链多肽，有3个半胱氨酸残基，分别位于第58位、105位、125位，第58位和第105位半胱氨酸残基形成二硫键。分子量理论值为15420道尔顿，等电点为pH7.7—8.2，比活性大于1.0x107IU/mg蛋白。白细胞介素-2是一种具有多种免疫调节功能的淋巴因子，能激活淋巴细胞杀灭肿瘤等异己细胞，恢复和提高机体的抗病能力。但其在中性溶液中溶解度低、半衰期短、有免疫原性，在临床应用上有一定的局限性。因此，本研究采用聚乙二醇（PEG）化学修饰的方法来克服白细胞介素-2的这些缺点。本研究根据IL-2分子表面的游离氨基（主要为Lys的ε-NH2）具有较高的亲核反应活性,可以与活化的亲水惰性高分子PEG共价结合,而在IL-2分子表面形成一种屏蔽，从而使修饰过的IL-2不易被机体当做异源物质识别，抑制相应的免疫反应，降低血浆清除率，延长半衰期，减少血浆中药物浓度的波动。PEG的生物相容性已经通过美国食品和药品管理局（FDA）的认证，被认为是对蛋白质或多肽类药物进行化学修饰的首选原料。本研究通过对MPEG叁聚氯氰和MPEG硝基苯基碳酸盐两种活化PEG修饰rhIL-2进行比较，得出对rhIL-2应该挑选其适当的活化PEG，不同修饰剂对
邹险峰, 马晓锋, 李险峰, 高长城, 陈星[3]2008年在《聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-2纯化及体外理化性质》文中指出目的研究重组人白细胞介素-2(rhIL-2)的聚乙二醇(PEG)修饰物的分离纯化方法,分析修饰产物的体外理化性质。方法采用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析和Superdex 75 prepgrade分子筛层析分离纯化PEG-rhIL-2,将rhIL-2与PEG-rhIL-2分别进行热稳定性、胰酶消化和水溶性实验,不同时间取样测定活力保留。结果得到了2分PEG修饰rhIL-2的修饰产物,分子量为27000,且产物的热稳定性,抗胰酶能力和水溶性都有明显提高。
郑建华[4]2006年在《白介素-2研究进展》文中研究说明白细胞介素-2是白细胞介素家族中的重要成员之一,它的生物学作用是以刺激T细胞增生为主,故又称T细胞生长因子,除此之外还有其它重要功能。以重组白细胞介素-2(IL-2)为物质基础的肿瘤治疗研究,在近20年来一直都很活跃。本文对介素-2的结构、生物学功能,及国内外相关研究作一介绍。
邹险峰, 张焕, 杨丛飞, 于中民[5]2006年在《聚乙二醇活化酯修饰重组人白细胞介素-2》文中指出目的研究单甲氧聚乙二醇叁聚氯氰(Methoxypolyethylene Glycol activated with cyanuric chloride,CC-mPEG)和单甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸盐(Methoxypolyethylene Glycol p-nitrophenyl carbonate,NC-mPEG)两种PEG活化酯修饰重组人白细胞介素-2(rhIL-2)的修饰条件和修饰后的性质。方法在不同反应条件下用CTLL-2细胞/MTT法测定rhIL-2修饰后的生物学活性。结果随着PEG活化酯的摩尔比提高,修饰率增加,用CC-mPEG修饰rhIL-2后生物学活性损失很大,PEG400的加入可以降低CC-mPEG的投料摩尔比;NC-mPEG修饰的rhIL-2后生物学活性基本保留。
王立夫, 吴裕忻, 乔敏敏[6]1998年在《聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-2及其生物学特性》文中研究说明采用聚乙二醇活性酯（ＰＥＧ－５０００）化学修饰重组人白细胞介素－２（ｒＩＬ－２）及修饰后复性制得修饰产物ＰＥＧ－ｒＩＬ－２。ＰＥＧ－ｒＩＬ－２系列研究：经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＣＴＬＬ－２短期细胞培养结合３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定，ＰＥＧ－ｒＩＬ－２分子量为２５ｋＤ，生物活性保留６９．７％；采用ＬＤＨ释放法测定证实ＰＥＧ－ｒＩＬ－２激活的ＬＡＫ细胞对人体肝癌细胞ＢＥＬ－７４０２和Ｋ５６２细胞的杀伤作用和ｒＩＬ－２相近甚至强于ｒＩＬ－２；小鼠体内的药代动力学研究表明，经静脉给药后，ＰＥＧ－ｒＩＬ－２较ｒＩＬ－２的系统清除率降低了７．７倍，清除相半衰期延长了１２倍。提示ＰＥＧ修饰ｒＩＬ－２后可能改变目前肿瘤免疫法中ｒＩＬ－２的剂量方案，减少其用量和不良反应。
李波[7]2009年在《人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白的发酵与纯化研究》文中研究指明人白介素2(Interleukin-2,IL-2)是由激活的辅助性T细胞产生的一种重要免疫因子,临床上可用于肿瘤、肝炎、免疫缺陷型疾病的治疗。为延长IL-2的半衰期,提高临床上的治疗效率,课题组构建了携带有重组人白介素-2-人血清白蛋白(rhIL-2-HSA)融合基因的表达质粒pPIH,并在毕赤酵母GS115中成功表达。在此基础上,本论文研究了重组菌P. pastoris GS115/pPIH在摇瓶和发酵罐中的培养条件,探讨了rhIL-2-HSA融合蛋白的分离纯化方法,并对其活性进行了鉴定。本文通过培养基成分的正交实验,确定了发酵培养基组成为甘油40 g/L,酵母粉15 g/L,蛋白胨20 g/L,100mmol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0,MgSO4 0.45 g/L, FeSO4 0.75 g/L,MnSO4 0.75 g/L。通过诱导条件的正交试验,确定了诱导条件为甲醇浓度1.5%,pH 6.5,生长相与诱导相体积比1:0.3,诱导时间为4天。在此条件下,rhIL-2-HSA表达量达到了338.2 mg/L。分别采用有机氮源和无机氮源培养基,在5 L发酵罐中比较了不同的溶氧条件、甲醇补料方式、诱导pH等因素对rhIL-2-HSA表达量的影响。结果表明重组菌在有机氮源培养基中的表达量最高达到712 mg/L,而在无机氮源培养基中达到了1.46 g/L,且大大降低了发酵成本。建立了rhIL-2-HSA的分离纯化路线。发酵液经离心和超滤浓缩后,依次进行Blue Sepharose、Octyl Sepharose和DEAE Sepharose层析,融合蛋白回收率为16.4%。SDS-PAGE结果显示为一条带,HPLC检测结果显示纯度达到95%以上。Western Blot杂交结果表明目的蛋白为HSA和IL-2的融合分子。CTLL-2细胞增殖实验表明该纯化方法较好的保留了目的蛋白的活性,其比活性为1.147×107 IU/mg。
独军政[8]2003年在《鸡白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达》文中研究表明白细胞介素15(IL-15)是1994年才发现的一种能促进细胞生长和分化的细胞因子，主要由天然免疫细胞产生。它与白细胞介素2(IL-2)有相似的生物学活性，但其结构和组成与IL-2毫无相似之处。已有的研究表明，鸡细胞因子在功能活性方面与人类和哺乳动物的细胞因子相似，尤其是IL-2与干扰素γ(IFN-γ)均具有较强的免疫增强作用。鸡IL-15(ChIL-15)是一种新发现的且与IL-2活性相似的细胞因子，作为疫苗佐剂研究的重要候选细胞因子有巨大潜力。 参考已发表的ChIL-15基因序列，设计合成引物，应用RT-PCR技术从刀豆球蛋白A(ConA)活化的白来航鸡脾淋巴细胞中克隆ChIL-15 cDNA，将其与SmalⅠ酶切处理的pUC19载体连接，构建重组质粒pUC19ChIL-15；用PCR技术从pUC19ChIL-15中扩增出去信号肽的成熟ChIL-15(mChIL-15)基因，与pMD 18-T载体相连构建重组质粒pMDChIL-15；然后用KpnⅠ／PstⅠ双酶切下mChIL-15基因片段，定向亚克隆到经同样酶切处理的带有6个组氨酸标签的表达载体pP_RoEX~(TM)HTa中，构建重组质粒pP_RoChIL-15，对其测序确认读框正确后，转入大肠杆菌DH5α中诱导表达并进行纯化，用重组ChIL-15(rChIL-15)免疫豚鼠，制备多克隆抗体；再用HindⅢ／PstⅠ从质粒pP_RoChIL-15上切下mChIL-15基因，定向亚克隆到经同样酶切处理的杆状病毒转移载体pMelBacB中，经酶切、PCR和序列测定鉴定后，与杆状病毒线形化DNA(Bac-N-Blue~(TM) DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经叁轮蚀斑纯化，构建重组杆状病毒rBac-ChIL-15，用该重组病毒感染处于对数生长期的Sf9细胞，按不同的时间收取样品，离心后对其上清和沉淀进行SDS-PAGE和Western blot分析。 结果显示，本研究所用白来航鸡IL-15 cDNA 5’非编码区有两个框外ATG起始密码子，开放阅读框由564bp组成，编码187个氨基酸，其中N末端信号肽含有66个氨基酸残基，在第48、149和166位的天冬酰胺残基上有叁个潜在的N-糖基化位点。mChIL-15含有4个高度保守的半胱氨酸残基，可形成两个链内二硫键。与已发表的ChIL-15基因序列相比，该序列编码区第365、397、407、457、474、556、557位的核苷酸发生了变化，分别由A、C、G、G、A、G、C依次变成了G、T、T、T、G、A、T，推导的氨基酸序列在第122、133、136、153和186位发生了改变，分别由原来的天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸、丙氨酸依次变成了甘氨酸、色氨酸、亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸，其中第474位碱基的变化是同义突变，这表明ChIL-15可能存在多态性；rChIL-15融合蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达，其分子量约为18 kDa，扫描分析含量在30％左右，用离子亲和树脂对rChIL-15进行了有效的纯化，并成功制备出了豚鼠抗rChIL-15多克隆抗体；重组杆状病毒rBac-ChIL-15感染Sf9细胞后24小时已表达rChIL-15蛋白，96小时表达量达到高峰，其分子量约为22 kDa，占细胞总蛋白的25％，在Western blot实验中，该重组蛋白可被豚鼠抗原核rChIL-15多克隆抗体识别。
陆源, 李利云, 陈伟[9]2014年在《白细胞介素的分子改造研究进展》文中研究说明研究背景:白细胞介素(interleukin)是一类由多种细胞产生的具有重要免疫调节作用的细胞因子。在临床应用中发现白介素类药物的副作用大、半衰期短、清除率高,使其在临床的广泛应用受限。因此,对白介素的分子结构进行改造,改善其理化性质和药代动力学性质,以获得生物学活性和稳定性更高而副作用更低的白介素。目的:通过文献查阅和复习,综述近年来国内外针对白细胞介素进行分子改造的新技术和方法,为研究开发生物学活性和稳定性更高而副作用更低的白细胞介素类药物提供参考。方法:从Springer LINK、ScienceDirect OnLine、PubMed、CNKI等数据库查阅近5年来国内外关于白细胞介素分子改造的研究报告,进行分类归纳和整理,阐述相关的新技术与新方法。结果:①通过定点突变方法用丝氨酸(Ala)取代125Cys,得到的重组人IL-2变异体,比活性提高30%,稳定性增强,解决了IL-2复性过程中易S-S错配导致无活性异构体或多聚体产生的问题。②利用基因重组技术将IL-2基因与其它蛋白质分子基因嵌合,表达出IL-2的融合蛋白,在这方面国内的研究取得了较多进展。如张辛燕等用哺乳动物细胞表达的抗体-IL-2融合蛋白183B2scFv-IL-2,能将IL-2靶向于表达OC183B2抗原的卵巢癌细胞,既提高了融合蛋白穿透组织的能力和肿瘤组织的浓聚,又避免了大剂量全身应用细胞因子所引起的副作用。沈粤春等用人源化抗Her2/neu单链抗体与人IL-2连接的双功能融合蛋白(H520C9scFv-hIL-2)对荷瘤小鼠进行的动物体内实验表明=该双功能融合蛋白对Her2/neu阳性肿瘤具有明显的抑瘤效果。此外,用毕赤酵母表达的人IL-2与人血清白蛋白(HSA)的重组融合蛋白,可延长IL-2的半衰期。③采用聚乙二醇对IFN-λ进行化学修饰,可使IFN-λ在半衰期和稳定性方面得到提高,同时最大限度地保留IFN-λ的生物学活性。结论:通过对白细胞介素的分子结构进行改造,以改善其理化性质和药代动力学性质,可望获得生物学活性和稳定性更高而副作用更低的白细胞介素,是该类药物研发的重要发展方向。
汪淑芳[10]2006年在《聚乙二醇化重组人白细胞介素-6的临床前药代动力学研究》文中提出白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一种由多种细胞产生的具有复杂生物学功能的细胞因子，是至今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，对免疫、造血、消化、内分泌、神经系统等具有广泛的调节作用。目前国外开发重组IL-6已进入Ⅲ期临床试验，我国也将重组IL-6的开发列为重点项目，已进入临床前研究阶段。IL-6可治疗因化疗、放疗引起的血小板减少症。但IL-6在体内由于蛋白酶的水解而呈现出低稳定性，同时由于快速的肾排泄和广泛的组织分布其生物半衰期很短。因此，为使血小板数有效的增长，通常采用高剂量和频繁给药，这就会产生如发热、急性期反应、食欲减退等副作用。 研究表明，生物活性蛋白质和多肽经过以聚乙二醇(PEG)为代表的水溶性聚合物的化学修饰可克服副作用。IL-6经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过减少；PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，同时减少了抗体的产生，这些均有助于IL-6循环半衰期的延长，从而可降低给药剂量，增强促进血小板生成的效果，减小副作用。我国有关单位开发了以治疗血小板减少症为目的的聚乙二醇化重组人白细胞介素6(PEG-rhlL-6)，目前正拟申报一类新药。为研究该药物在大鼠体内的药代动力学规律，阐明药代动力学特点，建立数学模型，提供重要的药代动力学参数，为过渡到临床研究提供必要的依据。本研究采用~(125)I同位素示踪法研究PEG-rhIL-6不同给药途径及不同给药剂量下在大鼠体内的药代动力学、组织分布以及排泄规律。所得结果如下： 1．PEG-rhIL-6在大鼠体内的药代动力学研究： 单次静脉注射3，20，40ug／kg~(125)I-PEG-rhIL-6后，在大鼠体内的代谢模型为二室模型。其主要药代动力学参数是：血药浓度-时间曲线下面积(AUC)分别为348.4443、1833.2331、3942.9973(ng／ml)~*h；全身清除率(CL_s)分别为8.8795、12.0909和10.9744ml／kg／h；分布相半衰期(t1／2α)分别为1.9286、1.6027、1.7787h；消除半衰期(t1／2β)分别为17.5370、18.7805、17.8113h；平均滞留时间(MRT)分别为20.4308、18.8870、19.4752h。除AUC外，各剂量组的主要药代动力学参数相似，经统计学检验分析无显着差异(P＞0.05)。 单次皮下注射3，20，40ug／kg~(125)I-PEG-rhIL-6后，在大鼠体内的代谢模型为一室模型。其主要药代动力学参数是：AUC分别为120.4932、988.2223、1651.9407(ng／ml)
参考文献：
[1]. 重组人白介素-2纯化工艺的改进及放大研究[D]. 吕健龙. 北京化工大学. 2016
[2]. 重组人白细胞介素-2的化学修饰[D]. 邹险峰. 吉林大学. 2004
[3]. 聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-2纯化及体外理化性质[J]. 邹险峰, 马晓锋, 李险峰, 高长城, 陈星. 广东技术师范学院学报. 2008
[4]. 白介素-2研究进展[J]. 郑建华. 海峡药学. 2006
[5]. 聚乙二醇活化酯修饰重组人白细胞介素-2[J]. 邹险峰, 张焕, 杨丛飞, 于中民. 广东技术师范学院学报. 2006
[6]. 聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-2及其生物学特性[J]. 王立夫, 吴裕忻, 乔敏敏. 中国免疫学杂志. 1998
[7]. 人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白的发酵与纯化研究[D]. 李波. 江南大学. 2009
[8]. 鸡白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达[D]. 独军政. 甘肃农业大学. 2003
[9]. 白细胞介素的分子改造研究进展[C]. 陆源, 李利云, 陈伟. 第九届全国免疫学学术大会论文集. 2014
[10]. 聚乙二醇化重组人白细胞介素-6的临床前药代动力学研究[D]. 汪淑芳. 四川农业大学. 2006
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