叶志伟[1]2003年在《脂质体作为干扰素-α载体的研究》文中研究表明干扰素是机体免疫细胞产生的一种细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗增殖和免疫调节机能等生物学活性。常规给药需频繁注射，常常会引起一系列不良反应，而且治疗费用也较高。脂质体具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮细胞吞噬，能激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体作为干扰素的载体，能改变干扰素的药动学性质、组织分布以及增加干扰素的吸收。由于干扰素是水溶性的大分子药物，所以制备的脂质体包封率低，而且在制备的过程中受有机溶剂的影响而活性降低。本课题的目的就是要研究一种制备工艺简单，避免干扰素直接与有机溶剂的接触，保持其生物学活性，适合进一步大规模生产的干扰素前体脂质体的制备方法，通过工艺和处方优化，使制备的干扰素脂质体包封率高，稳定性好，并进一步研究其体内动力学和组织分布。通过对干扰素脂质体的研究，为生物大分子药物脂质体给药系统的开发提供一种新的工艺方法。 本研究采用均匀设计法筛选最佳处方，粉末床研磨法制备空白前体脂质体，与干扰素-α混合得到干扰素-α脂质体；透射电子显微镜观察脂质体粒子形态；库尔特粒子分析仪测定粒子大小和分布；凝胶过滤法和超滤膜分离纯化脂质体；酶联免疫方法(ELISA)进行干扰素体内外分析；用氧化率评价脂质体的化学稳定性；气相色谱法检测脂质体乙醚残留检测；考察脂质用量、胆固醇与大豆磷脂的比例、载体粒子大小对水化后形成脂质体的平均粒度的影响；考察不同分离方法、类脂用量、胆固醇与大豆磷脂比例、电荷比例对脂质体的包封率的影响；通过放置时间对脂质体粒径和包封摘要研究生:叶志伟导师:梁文权率的影响、泄露率以及凝聚动力学试验叁种方法考察脂质体的物理稳定性;考察冻融过程中乳糖浓度对干扰素一Q脂质体的包封率及粒子大小和分布的影响;进行干扰素-。脂质体的溶血试验;以高、中、低叁种剂量小鼠尾静脉注射干扰素一Q脂质体和空白脂质体，进行急性毒性试验;用大鼠尾静脉注射干扰素一Q溶液和干扰素一Q脂质体研究其药代动力学;用小鼠尾静脉注射干扰素一。溶液和干扰素一Q脂质体，测定组织中药物浓度，研究其组织分布，用3P87软件进行药动学数据处理。 研究结果表明，用ELISA法测定体内外的干扰素的蛋白含量，操作方便，方法重现性好，回收率稳定，准确性高，特异性好，其灵敏度高。心、肝、肾、脾、肺各组织和血清的干扰素一。回收率大于94%，RSD为1 .4%，最低检测为10P岁ml。前体脂质体制备的最佳条件:保护剂为山梨醇，保护剂与脂质的质量比为5:1，十八胺和脂质的质量比为1:9，磷脂与胆固醇质量比为9:1。制备所得的干扰素一Q脂质体的粒径大小为80.8士36nm，包封率为68.2士4.5%。类脂的用量，膜材组成比例对干扰素一Q脂质体的粒度基本没有影响，但是载体材料的颗粒大小有一定的影响。当载体材料预先经过100目筛网处理以后，制备所得的前体脂质体水化后形成的脂质体的粒子大小基本恒定。类脂的用量以及十八胺的用量对于脂质体包封率的影响较大，其包封率随着用量的增加而增加。制备所得的脂质体乙醚残留量低于23.8p留g，符合制剂生产的要求。脂质体中磷脂的氧化率仅为0.607士0.034%，氧化指数小于0.2，符合规定。水化后所得的干扰素一Q脂质体在四小时内，泄漏量较少。热凝聚实验表明冻融后的脂质体活化能从冻融前的29.92kJ/mol增加到104.犯kJ/mol，稳定性提高，当乳糖浓度为1%时，经过冻融的脂质体的包封率可以达到68%左右。前体脂质体在4℃冰箱中保存半年，粒子大小和水化后所得的干扰素一Q脂质体包封率基 本没有变化。制备的前体脂质体水化后形成的干扰素一Q脂质体不溶血;急性毒性试 验显示，干扰素一Q脂质体和空白脂质体没有毒性。动物研究显示，大鼠尾静脉注射 干扰素一。溶液和干扰素一。脂质体后，血药浓度曲线都符合二室模型，干扰素一。溶液 和干扰素一a脂质体的分布相半衰期Tl。。分别为“.15士1.36min和48.35士1.06min， 消除相半衰期Tl几p分别为1286.n士171.23和676.59士52.54，表观分布容积分别为 11.4土0.2 ml和14.0士0.3 ml，药时曲线下面积分别为35740.95士2117.27n岁ml·min·摘要·脂质体作为干扰素·Q载体的研究和17356.68士14.97 ng/ml·min，两者的相对生物利用度为205.92%，统计矩方法分析其MRT分别为692.31士117.9 min和293.02士21.23 min。小鼠的组织分布研究表明，与干扰素一。水溶液组相比，静脉注射干扰素一Q一脂质体后，在肝、脾、肾、肺、心中干扰素的分布分别是对照组的2.5倍、1 .7倍、0.78倍、1.11倍和0.94倍。干扰素-。水溶液静脉注射后在肝和脾中的分布百分率分别为巧.2%和21.1%;干扰素一Q-脂质体静脉注射后在肝中的分布百分率分别为28.4%和27.1%，是干扰素一a水溶液的1 .9倍和1.3倍。干扰素一a一脂质体在肝脾等组织中的分布比千扰素一。水溶液高，同时也改变了干扰素在肾脏的分布。 本研究建立了粉末床研磨法制备空白前体脂质体的新方法，前体
杨芳[2]2015年在《犬干扰素α的克隆表达及其修饰产物的研究》文中提出随着经济发展,犬类饲养量日益增多,但是犬病,特别是病毒病的发病率也在不断升高,常常导致犬的死亡,给人类造成精神和经济上的损失。干扰素是一类具有抗病毒活性的细胞因子,其中干扰素α的抗病毒作用广谱而强效,犬干扰素a (CaIFNa)在治疗多种犬类病毒病中有显着疗效,因此有良好的应用前景。但是传统的生产方法成本高、制备工艺复杂,导致CaIFNα价格昂贵。同时目前市场上的CaIFNα活性时间短,需要频繁注射、治疗周期长。因此成本低廉且长效的CaIFNα研发成为热点。目前国内外关于基因工程克隆CaIFNα的研究报道较多,但是利用基因工程表达纯化得到活性CaIFNα的完整报道不多,其中主要以大肠杆菌(E.coli)作为表达系统,且大部分CaIFNa以包涵体形式表达。包涵体需要变性复性,不仅增加纯化过程而且蛋白复性产率偏低,因此包涵体变复性技术至今仍是应用E.coli表达系统制备蛋白质的主要瓶颈问题之一,研究者通常希望获得可溶性的目的蛋白。本文以E.coli作为表达系统,选用不同的标签蛋白与CaIFNα融合表达,分别得到了包涵体形式和可溶性蛋白形式的融合蛋白,并对两者进行比较,为获得大量有活性的CaIFNα提供途径。两亲性聚合物做为纳米药物载体,包裹药物后能延长药物活性、提高药物靶向性,被广泛应用和研究,因此是得到长效CaIFNα的可能途径。聚谷氨酸(PGA)是由生物发酵的大分子,来源易得、生物可降解,目前有众多研究证明其是良好的药物载体。但是PGA具有很强的亲水性,单独在水中难以自组装,不能直接作为CaIFNα的载体。因此本文将疏水性的苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE)通过酰胺化反应连接到PGA的羧基上,将PGA改造成两亲性聚合物材料PGA-PAE。 PGA-PAE同时具有亲水区域和疏水区域,所以在水中能自组装形成内部疏水和外部亲水结构的稳定纳米颗粒(NP),在形成过程中能装载水相中的犬干扰素α,自组装成为犬干扰素α纳米颗粒(NP-CaIFNa).本文对制备得到的NP及NP-CaIFNα进行了表征、制备条件优化和性质研究。本文的研究结果主要包括以下两方面：1.CaIFNα的克隆表达纯化及活性测定将CaIFNα的基因序列按照E.coli密码子进行优化,随后构建叁个表达载体,使CalFNα与不同标签蛋白(Trx-tag、GST-tag、Nus-tag)融合表达,分别得到融合蛋白Trx-CaIFNα、GST-CaIFNα及Nus-CaIFNα。其中Trx-CaIFNα的表达量最高,37℃时表达量占菌体蛋白的71.9%；而Nus-CaIFNα的可溶性最高,当诱导温度为25℃时100%可溶。对包涵体Trx-CaIFNα进行复性及纯化,对可溶性蛋白Nus-CaIFNα进行纯化。纯化后Trx-CaIFNα和Nus-CaIFNα两个蛋白的纯度均大于90%,得率分别为74.8%和6.5%。用犬肾细胞-疱疹性口炎病毒病(MDCK-VSV)体系测定Trx-CaIFNα和Nus-CalFNα的体外抗病毒活性,结果测得两者的活性分别为(2.14±2.79)×1014 U/mol和(1.87±0.92)×1012 U/mol。用肠激酶切除Trx-CaIFNa的标签蛋白,得到CaIFNa,得率为38%,其抗病毒活性为(1.87±0.76)×1015U/mol。本文通过Nus-tag和降低诱导温度使Nus-CaIFNa全部可溶,不需要变性复性,节约了纯化过程的时间和成本,该提高可溶性的方法值得借鉴；包涵体Trx-CaIFNa的表达量最高,高于其他两种融合蛋白Nus-CaIFNa和GST-CaIFNa,更远高于其他研究报道,且复性得率高达74.8%；融合蛋白仍然保留了CaIFNa的抗病毒活性。2. NP-CaIFNa的制备和性质研究用枯草芽孢杆菌DL发酵制备PGA,经过酒精沉淀和酸降解得到分子量为15-30kD的PGA。用碳化二亚胺作为催化剂,使PAE的氨基与PGA的羧基通过酰胺化反应连接,合成PGA-PAE材料。核磁共振结果表明材料中同时出现PGA和PAE的特征峰,表明材料的正确合成。将PGA-PAE材料与等体积纯水混匀,在水中自组装成纳米载体NP,透射电镜下可见NP为球状纳米颗粒,分散性良好,粒径分布均匀。当PGA-PAE的浓度为40mg/mL、PGA的降解时间为9min、 PGA与PAE的摩尔比(即PAE的投料比)为0.68时,NP粒径为132nm,PDI为0.114,zeta电势为40.7mV,浓度为1.77×1013 particles/mL,表明制备得到稳定的纳米载体NP。以活性较高的Trx-CaIFNα为例,研究NP-CaIFNα。将PGA-PAE材料与等体积Trx-CaIFNα溶液混匀,水相中自组装成NP-CaIFNα,电镜下可见NP-CaIFNα为纳米尺寸的颗粒状结构,分散性良好。在优化制备条件下,NP-CaIFNα粒径为165nm,PDI为0.157,zeta电势为42.1mV,浓度为7.29×1012 particles/mL。NP-CaIFNα的体外抗病毒活性为(0.44±3.59)×1014 U/mol,保留了Trx-CaIFNα活性的20%左右。Trx-CaIFNα的体外释放实验证明有血清存在时Trx-CaIFNα能缓慢释放,30d约释放80%Trx-CaIFNα,提示NP-CaIFNα在体内可能缓慢释放Trx-CaIFNα,延长抗病毒活性。同时NP-CaIFNα在PBS中不会释放Trx-CaIFNα,提示NP-CaIFNα在体外能保持稳定。综上所述,本文用基因工程技术纯化得到Nus-CaIFNa、Trx-CaIFNα两种融合蛋白。其中Nus-CaIFNα蛋白全部为可溶性表达,为CaIFNα的可溶性研究提供借鉴；包涵体Trx-CaIFNα的表达量最高,37℃时表达量约占菌体蛋白的71.9%；以上结果为大规模生产CaIFNα提供了两条途径。本文还制备合成了基于PGA的NP-CaIFNα,研究证明NP-CaIFNα具纳米尺寸,保留了Trx-CaIFNα体外抗病毒活性,并在有血清条件下缓慢释放Trx-CaIFNα,提示在体内可能具有长效抗病毒活性。本文首次将基于PGA的两亲性纳米药物载体应用到CaIFNα上,为长效CaIFNα的开发提供了新思路。
吕平[3]2008年在《猪干扰素α、β、γ在293T细胞中的表达研究》文中研究说明干扰素(Interferon,IFN)是一种具有抗病毒,影响细胞生长、分化和免疫调节等功能的蛋白质,在兽医临床上,干扰素在对疾病的预防、治疗以及疫苗佐剂的应用等方面发挥着重要作用。目前,IFN已广泛应用于人医临床多种疾病的治疗。相对而言,兽医界对动物干扰素的研究起步较晚。由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展,同时也对人类健康存在着巨大危害。因此,动物干扰素的研究对动物传染性疾病的防治具有重大的经济价值和社会意义。本研究以猪干扰素α(PoIFN-α)、猪干扰素β(PoIFN-β)与猪干扰素γ(PoIFN-γ)为研究对象,构建了pcDNA3.1-EGFP-PoIFN-α/β/γ(命名为pcDNA3.1-IFN-α/β/γ)和rAAV-PoIFN-α/β/γ(命名为AAV-PoIFN-α/γ)真核表达载体,并转染哺乳动物细胞293T,Western-blot检测到了293T细胞中干扰素蛋白。主要研究内容如下:1.pcDNA3.1-IFN质粒构建和制备根据本实验室已扩增到的PoIFN-α/β/γ全长基因设计引物,在PoIFN-α/β/γ上下游引入NheⅠ和HindⅢ酶切位点,以PoIFN-α/β/γ全长基因为模板,PCR扩增得到PoIFN-α/β/γ基因,将该基因亚克隆到pcDNA3.1-IFN载体上,转化大肠杆菌DH5α,挑选单菌落,LB培养基培养,菌液PCR鉴定,经测序鉴定获得正确pcDNA3.1-PoIFNd质粒,扩大培养,大量提取质粒并纯化。2.rAAV-IFN质粒构建和制备根据本实验室已扩增到的PoIFN-α/β/γ全长基因设计引物,使得PoIFN-α/β/γ上下游引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,以PoIFN-α/β/γ全长基因为模板,PCR扩增得到PoIFN-α/β/γ基因,将该基因亚克隆到AAV载体上,转化大肠杆菌DH5α,挑选单菌落,LB培养基培养,菌液PCR鉴定,证明获得正确AAV-PoIFN质粒,扩大培养,大量提取质粒并纯化。3.猪干扰素在293T细胞中的表达腺相关病毒载体叁质粒系统(AAV-PoIFN、AAV-RC、AAV-pHelper,按1:1:1的比例混合),pcDNA3.1-PoIFN,lipofectamine~(TM)2000脂质体转染293T细胞,Western-blot检测了培养液上清中干扰素蛋白。
王玉梅, 李秀芝, 迟春萍, 王志武[4]2005年在《干扰素脂质体的药代动力学和生物利用度》文中认为目的研究干扰素α2b脂质体药代动力学和生物利用度。方法采用旋转逆相蒸发法制备干扰素α2b脂质体。将小鼠分成2组,分别尾静脉注射干扰素α2b脂质体(L-IFN)和干扰素α2b(IFN),给药后分8个时间点采血,并取肝脏组织检测干扰素α2b含量。计算药代动力学参数和生物利用度。结果L-IFN组小鼠血液及肝脏组织中干扰素α2b消除速度低于IFN组,血中相对生物利用度为237·47%,肝脏中相对生物利用度为191·73%。结论干扰素α2b脂质体可明显提高小鼠的吸收和利用。
李晗, 梅兴国[5]2014年在《多囊脂质体递送蛋白质/多肽类药物的研究进展》文中进行了进一步梳理目的就多囊脂质体作为蛋白质/多肽类药物载体的制剂研究情况进行综述。方法根据国内外文献报道,对近年来蛋白质/多肽类药物开发为多囊脂质体的研究情况进行分析和归纳。结果与结论蛋白/多肽类药物由于稳定性差、半衰期短以及清除率高,通常在临床上使用注射剂,且需要频繁给药。多囊脂质体(multivesicular liposomes,MVLs)是采用贮库泡沫技术的一种新型脂质体,可用于运载亲水性和大分子药物,弥补了普通脂质体对该类药物包封率低的缺点,具有广阔的发展前景。
孙达权[6]2008年在《山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染》文中研究说明基因打靶通过DNA转移手段将外源DNA导入靶细胞或组织中,利用外源DNA序列与靶细胞内基因组中部分DNA序列间的同源性使它们在分裂前期发生DNA间的同源重组,从而对靶细胞基因组上的某一确定位点或座位进行精确的遗传修饰的一门新技术。乳腺生物反应器是基于胚胎操作和转基因技术平台,外源基因导入动物基因组中并利用内源基因的启动元件使外源基因在动物乳腺中表达,并利用动物乳腺的分泌能力从乳汁中获得具有重要使用价值的药用蛋白等外源蛋白的一类转基因动物的总称。随机整合将外源基因随机导入靶细胞基因组中,由于“位置效应”而导致外源基因表达低下甚至沉默。为提高外源蛋白在转基因动物中的表达量,本研究以基因打靶等技术构建山羊乳腺特异性载体,并通过稳定转染和细胞筛选来获得中靶转基因山羊胎儿成纤维细胞,以中靶体细胞为核供体细胞生产乳腺生物反应器动物,解决了外源基因由于随机整合而产生“位置效应”这一难题,并利用乳蛋白基因的启动元件在乳腺中高效表达外源基因。本试验以山羊β-酪蛋白基因座为打靶位点,从西农萨能奶山羊血液中提取DNA基因组,利用LA-PCR分两段扩增了山羊的β-酪蛋白基因,经TA克隆和鉴定后再用LA-PCR的方法从中克隆了该基因的5’端包括调控序列和信号肽在内的3 kb的DNA序列和3’端2 kb的DNA序列作为两条同源臂。同时以在两个LoxP之间插有新霉素磷酸转移酶基因(neo)并在两个LoxP外侧各有一个疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶载体pA2T为骨架载体,构建了乳腺特异性条件性基因打靶载体。采用具有广谱抗菌、抗病毒、改善免疫、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血块、保持血管的畅通等作用且半衰期相对较长的指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂基因为打靶载体的外源目的基因,两者均通过PCR从带有该基因的载体中克隆出来的,并通过酶切和连接的方法构建打靶载体。另外,试验以带有核定位信号的AcGFP基因为标记基因,外源目的基因通过具有独立起始翻译随后基因作用的IRES序列与AcGFP基因相联系。以质粒pEGFP-C1为骨架载体,先通过改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表达,再将具有增强剪接作用的间插序列(IVS)与IRES序列与GFP基因相连,再在IVS前加入另一个带有多克隆位点的IVS,构建了载体p3I-GFP,通过细胞转染确实发现载体p3I-GFP及去除了MluI位点的p3I-GFPN能够高效表达标记基因,且荧光亮度要明显高于购买的pIRES2-AcGFP-Nuc载体。再以p3I-GFPN为骨架载体,将人溶菌酶基因导入多克隆位点,通过细胞转染发现的确能够表达绿色荧光蛋白。在此基础上,在CMV启动子和人溶菌酶基因之间插入山羊CSN2的启动子,再将GFP基因用从人胎盘中以PCR的方法扩增获得的干扰素A基因替代,最终构建了一个乳腺中独立表达人溶菌酶和人干扰素蛋白的载体,用于乳腺炎防治的研究。为获得中靶山羊胎儿成纤维细胞株,本试验以山羊胎儿成纤维细胞为打靶体细胞,脂质体2000转染细胞后用含800μg/ml的遗传霉素初步筛选培养,7天后用含400μg/ml的遗传霉素和200 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞筛选液筛选培养,初步筛选中靶细胞。为获得纯化的中靶细胞株,首先建立一个单细胞培养体系,即以5 mg/ml丝裂霉素C处理2h的山羊胎儿成纤维细胞为饲养层和新鲜的细胞培养液,以这个单细胞培养体系培养初步筛选的中靶单个细胞,最后得到扩增的细胞株,再用含400μg/ml的遗传霉素和100 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞培养液培养,获得纯化的中靶山羊胎儿成纤维细胞株。
王玉娇, 卢雪梅, 金小宝, 朱家勇[7]2015年在《肝靶向干扰素的研究进展》文中研究说明干扰素是一种具有广泛抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性蛋白,是目前治疗病毒性肝炎、肝癌的疗效药,被广泛应用于临床。但因其在肝脏中富集较少,肾脏清除率很高,导致药物有效浓度较低从而影响治疗效果。本文对肝靶向干扰素的研究进展进行综述。
丁艳华[8]2007年在《古菌组蛋白（HphA）介导小发夹RNA抑制HCV 5'NCR和C区表达的研究》文中研究说明全世界目前己有1.7亿HCV感染者,我国普通人群抗-HCV阳性率为3.2%。急性HCV感染者中,大约80%可发展为慢性持续感染,其中20%的患者经历20-30年将发展为肝硬化,1%-5%的患者可进展为肝细胞癌。HCV所导致的终末期肝病是重要的死亡原因之一,也是肝移植的原因。目前慢性丙型肝炎的标准治疗是干扰素联合利巴韦林,但有效率仅仅40%-80%左右,人们试图开发新型、高效的治疗药物来解决这一问题。自RNAi技术发现以来,已广泛应用于分子生物学领域的研究,并且已经证实其在细胞水平能有效抑制HIV、脊髓灰质炎病毒、HBV及HCV的复制和表达。本文构建了叁个靶向(targeting to)HCV 5'NCR和C区的小发夹RNA质粒表达载体,与含有HCV 5’NCR和C区部分基因及荧光素酶报告基因的质粒共转染人肝细胞HL-7702。通过检测荧光素酶报告基因和Western blot来检测目的蛋白表达。发现靶向HCV 5'NCR NCR和靶向C区的shRNA能明显抑制HCV 5'NCR和C区的表达。目前小干涉RNA进行体内实验的主要障碍是缺乏安全有效的转基因载体。我们应用了一种非病毒类载体古菌组蛋白(HPhA)作为转基因载体。在实验中发现HPhA能与DNA结合,毒性很小,能在血清存在的条件下转染小干涉RNA表达质粒进入细胞抑制HCV 5’NCR和C区的表达。所以HPhA有潜力发展为适合体内实验的转基因载体。本文首次应用HPhA作为转基因载体,为小干涉RNA抗病毒基因治疗的体内实验提供了重要的理论基础、技术路线和实验方法。
郭桥, 陈爽, 盛军[9]2004年在《干扰素鼻腔给药系统的研究进展》文中研究指明干扰素鼻腔给药系统是目前研究的热点。干扰素作为细胞因子被用来治疗 30多种疾病 ,其鼻腔内给药可预防和治疗呼吸道病毒感染 ,如病毒性感冒和病毒性肺炎等。鼻腔局部给药使干扰素通过和鼻粘膜上的相应受体结合而得到良好的吸收 ,具有吸收迅速、完全 ,能避免肝脏首过效应等优点 ,扩大了干扰素的应用范围 ,减少毒副作用的发生。
刘菲[10]2011年在《天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究》文中研究表明我国是水禽生产大国,天府肉鹅具有良好的遗传特性,在整个西南地区的占有率很高,养殖规模较大,社会和经济效益显着。随着集约化养鹅业的发展,研究开发出能有效增强鹅疫苗的免疫力和对鹅病毒具有抑制或杀灭作用的生物制剂,对鹅病的有效防治具有重要的意义。IFN-α干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能。本研究采用基因工程及相关技术,借鉴相关研究,对天府肉鹅IFN-α(tf-GoIFNα)进行克隆、表达及其功能与应用研究。1天府肉鹅干扰素-α基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增出其IFN-α基因(tf-GoIFNα);并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对tf-GoIFNα基因的核酸及氨基酸序列进行分析,同时分析13个与其相关的基因序列的相似性及进化情况。实验结果表明,tf-GoIFNα克隆成功,完整的ORF基因全长576个核苷酸,编码191个氨基酸,表达蛋白分子质量为21670.7Da,潜在的信号肽切割部位位于第28位的A(丙氨酸)和第29位的F(苯丙氨酸)氨基酸之间,二级结构主要由0-螺旋(H)和无规则卷曲组成,大致包括10个抗原表位；tf-GoIFNα基因编码的氨基酸序列含有2个潜在的N-糖基化位点,9个潜在的O-糖基化位点,含有5个潜在的磷酸化位点,第一个疏水区同信号肽位置一致,提示信号肽引导蛋白分泌到胞外作用,没有跨膜区,亚细胞定位预测,tf-GoIFNα表达的蛋白大约会有55.6%在细胞外,22.2%在细胞质,l 1.1%在线粒体,11.1%在细胞核；序列分析及比较结果显示tf-GoIFNα与同类的水禽(鸭、鹅)有90%之上的相似性,在进化树中位于同一分支。与狮头鹅的同源性最近,其中核酸相似性达到99.3%,氨基酸相似性达到97.9%；基因密码子特征分析表明,本研究所克隆的tf-GoIFNα为高表达、密码子偏性较高的基因,其密码子偏爱性情况与鸭IFN-α相近,与鸡IFN-α基因的密码子偏爱性有所不同,提示可以参照和借鉴已经开展的鸭IFN-α基因的表达,开展tf-GoIFN-α的表达及进一步的深入研究。2 tf-GoIFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测参照已克隆的tf-GoIFNα完整ORF基因序列设计引物,克隆到了成熟肽基因,基因全长486bp。将成熟肽基因与原核表达载体pET32a连接,构建原核表达载体pET32-mtf-GoIFN-α,并于表达菌Rosetta中表达,成功表达大小为38kDa的蛋白。表达蛋白经过Ni-IMAC亲和层析纯化以及稀释透析复性后,SDS-PAGE显示蛋白己纯化为单一条带。采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性,纯化复性的重组质粒pET32-mtf-GoIFN-α表达蛋白抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5×103U/mmg。并且在GEF和DEF中检测到鹅IFN-α重组蛋白抗VSV效果是一致的。SYBR Green real-time PCR检测,复性后的tf-GoIFNα重组蛋白进行抗GPV,IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显着性差异(P<0.05),tf-GoIFNα重组蛋白具有抗GPV的活性作用,对GPV病毒的相对抑制率达89.4%。3鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAE50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度,制备兔抗鹅IgG酶标抗体。结果表明：粗提的IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度可达到94.5%；免疫扩散得出兔抗鹅IgG抗血清效价约1：32,抗体酶标后效价为1：3000,具有应用价值。4 tf-GoIFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达为了进一步研究tf-GoIFNα基因的特性和功能,将tf-GoIFNα基因克隆到pcDNA3.1-(+)真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞,应用间接免疫荧光、ELISA和Western-blot法检测GoIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测。结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-GoIFN-α构建成功,目的蛋白在转染12h后就可以被检测出,36h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢；重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子量为38kDa,比预测的分子质量(约21kDaA)大；间接免疫荧光显示,tf-GoIFNα基因产物由细胞核向细胞浆发散；表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及小鹅瘟病毒(GPV)的活性。5tf-GoIFN-α真核表达质粒对GPV-VP3基因疫苗的免疫佐剂效应为检测tf-GoIFN-α真核表达质粒(pcDNA-GoIFN-α)对GPV-VP3基因疫苗的佐剂作用,将pcDNA-GoIFN-α以每只50、100、200μg叁个剂量与GPV-VP3基因疫苗一起用肌肉注射法分别免疫28日龄鹅,同时设分子佐剂gIL2对照组、分子佐剂GoIFN-α与gIL2联合免疫佐剂组、空载体质粒pcDNA3.1(+)对照组、小鹅瘟弱毒对照组和空白对照组,接种后第3、7、14、21、28、35、49d采抗凝血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鹅外周血T淋巴细胞转化；第3、7、14、21、28、35、49、63、77 d采凝血用间接ELISA法以及中和试验检测血清抗体水平。结果显示：(])淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值)pcDNA-GoIFN-a以不同剂量与GPV-VP3基因疫苗一起免疫鹅后,各实验组的T淋巴细胞增殖反应在第3d基本维持同一水平,从第3d到第28d稳步上升,在28 d达到了最高峰,而pcDNA-VP3免疫组在第35d达到高峰。在第28d,佐剂组的OD值均极显着(P≤0.01)高于pcDNA-VP3基因疫苗组、GPV弱毒组、pcDNA3.1 (+)和生理盐水对照组。GoIFN-α佐剂组只在第21d显着(P<0.05)高于gIL2佐剂组,其他时间点差异不显着。联合佐剂组在第14d、第28d到第49d均显着高于GoIFN-α或gIL2佐剂组(P<0.05)。(2)外周血抗体IgG水平(OD值)佐剂免疫组的ELISA抗体水平从第3d的增长趋势为先慢后快,至第35d到达最大值,之后逐渐下降,但仍明显高于pcDNA-VP3基因疫苗组和GPV弱毒组。gIL2佐剂组在第28d到第42d和63d到第77d显着高于GoIFN-α佐剂免疫组(P≤0.05),GoIFN-α和gIL2联合佐剂免疫组在第21d到第77d极显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂免疫组(P≤0.01)。在GoIFN-α佐剂组中,佐剂作用呈一定的剂量相关性。(3)外周血中和抗体效价在免疫后第60d和第75d,GoIFN-α/gIL2联合佐剂组极显着(P≤0.01)高于GoIFN-α或gIL2佐剂组(表8-5)。佐剂组的中和抗体效价在第45d到第75d期间均显着(P≤0.05)或极显着(P<0.01)高于pcDNA-VP3组。GPV弱毒组在第45d显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂组诱导的中和抗体水平(P≤0.05),与GoIFN-α和gIL2联合佐剂组所诱导的中和抗体水平差异不显着。整个检测过程中,注射pcDNA3.1(+)和生理盐水的鹅对照血清不能保护细胞对抗病毒的感染。实验证明,pcDNA-GoIFN-α能使GPV-VP3基因疫苗诱导的T淋巴细胞转化能力增强,血清抗体IgG水平和中和抗体效价升高,是一种良好的增强GPVVP3基因疫苗的分子佐剂,分子佐剂goIFN-α和golL2联合免疫组效果最佳,pcDNA-goIFN-α肌肉注射200μg/只的效果次之。6 tf-GoIFNα在毕赤酵母中的分泌表达及其活性检测为了更好的利用基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂,应用PCR技术从含有tf-GoIFNα完整ORF的重组质粒pMD18-T-GoIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因,亚克隆于穿梭载体pPICZαA上,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经sacⅠ线性化后,电转化入酵母表达菌X33；1%的甲醇诱导表达3株不同的菌72小时后,斑点杂交筛选出高拷贝的转化子,Elisa法鉴定筛选最佳表达时间和甲醇浓度。重组子经诱导表达,TCA浓缩后,SDS-PAGE和Western-blot分析,并采用微量细胞病变抑制法分析研究其生物活性。结果表明,成功构建了重组鹅IFN-α的酵母表达质粒,并实现了其在毕赤酵母中的分泌表达；SDS-PAGE和Western-blot分析显示获得分子量约为22kDa的表达蛋白,比预测的蛋白分子量(18.7kDa)略大,估计是糖基化的原因；表达产物对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/mL。
参考文献：
[1]. 脂质体作为干扰素-α载体的研究[D]. 叶志伟. 浙江大学. 2003
[2]. 犬干扰素α的克隆表达及其修饰产物的研究[D]. 杨芳. 华东师范大学. 2015
[3]. 猪干扰素α、β、γ在293T细胞中的表达研究[D]. 吕平. 华中农业大学. 2008
[4]. 干扰素脂质体的药代动力学和生物利用度[J]. 王玉梅, 李秀芝, 迟春萍, 王志武. 中国生物制品学杂志. 2005
[5]. 多囊脂质体递送蛋白质/多肽类药物的研究进展[J]. 李晗, 梅兴国. 中国药学杂志. 2014
[6]. 山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染[D]. 孙达权. 西北农林科技大学. 2008
[7]. 肝靶向干扰素的研究进展[J]. 王玉娇, 卢雪梅, 金小宝, 朱家勇. 广东药学院学报. 2015
[8]. 古菌组蛋白（HphA）介导小发夹RNA抑制HCV 5'NCR和C区表达的研究[D]. 丁艳华. 吉林大学. 2007
[9]. 干扰素鼻腔给药系统的研究进展[J]. 郭桥, 陈爽, 盛军. 中国生物制品学杂志. 2004
[10]. 天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D]. 刘菲. 四川农业大学. 2011