1.淮安市疾病预防控制中心 江苏淮安 223001；2.江苏省疾病预防控制中心 江苏南京 210009
摘要：目的 建立黄鱼中酸性橙Ⅱ的HPLC测定方法。方法 选择HPLC法测定黄鱼中酸性橙Ⅱ的理想色谱条件，并测定黄鱼中酸性橙Ⅱ的含量及加标回收率，作方法学论证。结果 酸性橙Ⅱ在0.1~20 µg/ml的范围内，线性良好，线性方程y=34.94x－2.697，r= 0.9998。酸性橙Ⅱ最低检出浓度为0.08 mg/L。样品添加浓度为0.5～10 mg/kg时，方法回收率为93.5%～96.6%。结论 以HPLC法检测非法添加于黄鱼中酸性橙Ⅱ的含量，操作简便、定量准确可靠。
关键词：酸性橙Ⅱ；黄鱼；HPLC
Abstract Objective To establish an HPLC method for quantitation of acid orangeⅡ in yellow croaker.Methods Selecting the best chromatograph conditions to determine the concentration of acid orangeⅡ in yellow croaker and the added standard recoveries of it.Then do the HPLC methodology demonstration using the selected chromatograph conditions.Results This HPLC method exhibited a linear relation within 0140～100100μg/ml acid orangeⅡ content.The regression equation was y=34.94x－2.697（r = 0.9998）and the minimum detectable limit of this method was 0.1 mg/L.Furthermore，the recoveries of basic orange were 93.5%～96.6% while the contents of added standard were 0.5～10 mg/kg.Conclusion This is a simple，accurate and reliable HPLC method for determination of acid orangeⅡ in yellow croaker.
Key words Acid orangeⅡ；Yellow Croaker；HPLC
色素酸性橙Ⅱ又名金橙Ⅱ，二号橙，桔黄橙，酸性金黄Ⅱ或酸性艳橙GR，俗名金黄粉，化学名为2-萘酚偶氮对苯磺酸钠。酸性橙Ⅱ是一种工业染料，主要用于蚕丝、羊毛织品和皮革的染色，禁止作为食品添加剂使用。但由于酸性橙Ⅱ具有色泽鲜艳，着色稳定和价廉的特点，一些不法食品生产者在食品中违规添加酸性橙Ⅱ，极大危害消费者的身体健康。卫生部重新汇总发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中“产品类别”增加“鲍汁、腌卤肉制品、红壳瓜子、辣椒面和豆瓣酱”。但因酸性橙为化工原料，目前对食品中酸性橙Ⅱ的检测在国家标准及地方标准中仍是空白。
文献报道酸性橙Ⅱ的测定方法有纸层析法、分光光度法、反相高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等[1-4]。本文旨在通过研究和优化酸性橙Ⅱ在黄鱼中的定量和定性检测方法，建立快速、准确、实用的高效液相色谱检测方法，为黄鱼的市场质量监督以及安全检测提供理论依据。
1 材料与方法
1.1仪器
高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器及数据处理器，Agilent公司）；超声波清洗器（和创公司）；食品粉粹机；漩涡混匀器（Scientific Industries公司）；氮吹仪；固相萃取装置（Supelco公司）。
1.2试剂
酸性橙Ⅱ；甲醇（色谱纯，Merk公司）；乙醇、氨水等均为分析纯；聚酰胺固相萃取柱：1000 mg/ 6ml。
1.3色谱条件
色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）或性能相当者；流动相：甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液；流速：1 mL/min，梯度洗脱见表1；柱温：30 ℃；检测波长：484 nm；进样体积：10 µL。
1.4 分析方法
1.4.1 标准曲线绘制：精密称取0.10 g酸性橙Ⅱ，于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的酸性橙Ⅱ标准贮备液。用流动相将储备液稀释，配制成浓度为0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.5 µg/mL、1.0 µg/mL、2.0 µg/mL、5.0 µg/mL、10.0 µg/mL、20.0 µg/mL 的系列标准溶液，供高效液相色谱测定。
1.4.2 样品处理：将黄鱼样品打碎成肉泥状，混匀后取适量，准确称取2 g粉碎样品于15 mL具塞离心管中，加入10 mL乙醇震荡提取5 min，5000 r/min离心5 min，取上清液于另一离心管中，残渣中加乙醇10 mL，重复提取一次，合并两次上清液，备用。聚酰胺固相萃取柱依次用3 mL水、3 mL乙醇活化，备用液过柱，控制流速小于2 mL/min。用水3 mL和乙醇3 mL淋洗，乙醇-氨水-水溶液4 mL洗脱，收集洗脱液，于80 ℃氮气吹干，用流动相1.0 mL溶解残余物，涡旋1 min，10000 r/min离心5 min，取上清液，供高效液相色谱测定。
1.4.3 测定方法 取试样溶液和相应的对照溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。对照溶液及试样溶液中酸性橙Ⅱ响应值应在仪器检测的线性范围之内。
2 结果与讨论
2.1 波长选择
取5.0 μg/mL的酸性橙Ⅱ标准使用液在1.3的色谱条件下进样，在200~600 nm范围内对酸性橙Ⅱ进行全扫描（图1），选定484nm作为检测波长。
2.2 流动相及洗脱方式的选择
实验中采用了甲醇－乙酸铵（80：20）溶液、甲醇－乙酸铵（15：85）溶液和甲醇－乙酸铵溶液梯度洗脱三种流动相。结果表明，采用甲醇－乙酸铵（80：20）溶液洗脱时，出峰时间过短，甚至不出峰，色素和干扰物之间均不能实现很好的分离；采用甲醇－乙酸铵（15：85）溶液洗脱时，出峰时间过长，峰型较宽与干扰物难以分离；采用甲醇-乙酸铵溶液梯度洗脱，从谱图（图2）可以看出效果非常理想，具有基线稳定，灵敏度高，峰型尖锐，杂质干扰少等优点。因此，本实验选择甲醇－乙酸铵溶液梯度洗脱方式。
2.5 精密度实验
以酸性橙Ⅱ标准溶液5.0 μg/mL，连续进样6次，每次10 µL，测得酸性橙Ⅱ平均峰面积为162.17，RSD为0.128%。
2.6 稳定性实验
以标准溶液5.0 µg/mL，每隔2 h 进样，每次10 µL，测得碱性橙平均峰面积为164.57，RSD为0.150%。结果表明：供试品溶液在12 h内所测得的结果基本一致。
2.7 重复性实验
取同一黄鱼样品6份，按1.4.2的方法制成供试溶液。在上述色谱条件下，测定酸性橙Ⅱ（图4）平均含量为4.45 mg/kg，RSD为1.54%。
2.8 方法回收率实验
精密称取已知酸性橙Ⅱ含量（4.45 mg/kg）的样品9份，分别作5.00、10.00、15.00 mg/kg 3种浓度的加标回收实验，按1.4.2的方法制成供试品溶液，并按上述色谱条件测定碱性橙的含量，计算回收率（表2）。结果，该3种浓度的加标回收率在85.4%~89.2%之间，RSD在4.39%~6.77%之间。
3 小结
综上所述，本方法操作简便，精密度高，回收率好，在0.1～20μg/mL的浓度范围内线性关系良好，为酸性橙Ⅱ标准方法制定提供理论支持及市场上染色黄鱼的卫生监督提供较好的判定依据。
参考文献：
[1]陈大义.纸层析定性示波极谱法测定非食用色素酸性橙[J].中国卫生检验志，2001，2：170-171.
[2]雷波，分光光度法对混合染料浓度的同时测定[J].染整技术，2003，3：35-37.
[3]张秀尧，蔡欣欣.反相高效液相色谱法快速测定良品中违规使用的酸性橙Ⅱ染料[J].中国卫生检验杂志，2004，14（2）：204．
[4]刘华良，荣维广，王联红，等．液相色谱串联质谱法检测鲍鱼汁中的酸性橙Ⅱ[J]，中国食品卫生杂志，2010，22（1）：16—18．
作者简介：冯晓青（1984-），男，硕士，检验师，主要从事理化检验工作
论文作者:冯晓青1,刘华良2,阮丽萍2,王,芹1,王,露1
论文发表刊物:《健康世界》2014年23期供稿
论文发表时间:2016/4/5
标签：酸性论文; 溶液论文; 乙酸铵论文; 黄鱼论文; 色谱论文; 甲醇论文; 浓度论文; 《健康世界》2014年23期供稿论文;