南昌市第三医院检验科 江西南昌 330009
摘要：目的 探讨分析2016年-2017年我院乳腺癌患者切口感染分离的金黄色葡萄球菌中MecA基因的分布及耐药性分析。方法 收集我院临床2016年1月-2017年12月分离的101株金黄色葡萄球菌，MIC法对其进行药敏试验，采用 WHONET5.6进行药敏数据分析，采用聚合酶链反应（PCR）法对mecA基因进行筛查。结果 101株SAU中，所有菌株均对万古霉素、利奈唑胺、达托霉素敏感。对青霉素的耐药率最高，为92.1%（93/101），对苯唑西林的耐药率为25.7%（26/101）。对红霉素、克林霉素的耐药率大于40%，对四环素的耐药大于10%，其余莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、喹奴普丁/达福普汀、复方新诺明和利福平的耐药率均小于10%。101株SAU中发现mecA基因25株。结论 我院乳腺癌患者术后切口感染的SAU耐药情况逐年上升，mecA基因普遍存在MRSA当中。临床应严格进行无菌操作及合理使用抗菌药物，并加强对MRSA菌的耐药性监控。
关键词：乳腺癌；金黄色葡萄球菌；mecA基因；耐药性分析
乳腺癌是常见的需做切除手术治疗的癌症之一。由于手术创口大、时间较长及术后渗出液较多等原因，易导致术后切口感染。据报道[1]，乳腺癌患者术后切口感染率是普通外科切除手术的4~6倍左右。金黄色葡萄球菌（SAU）是临床上引起乳腺癌患者术后切口感染常见的病原菌之一。SAU可引起人类局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。近年来，由于广谱抗菌药物的乱用及滥用，在抗菌药物的选择压力之下，SAU的耐药性不断升高，耐多药SAU，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的持续出现，由于治疗MRSA感染的选择有限，已造成巨大的经济负担和对公共卫生的关切。本文主要针对引起我院乳腺癌患者术后切口感染的SAU中mecA基因的分布以及耐药性进行分析，为临床合理用药、控制多重耐药菌的产生，提高乳腺癌手术治疗质量提供实验室依据。
1 材料和方法
1.1 菌株来源 收集2016年1月-2017年12月南昌市第三医院乳腺癌患者术后切口感染分离的101株SAU，剔除同一患者相同部位重复分离菌株。
1.2 主要仪器和设备 全自动微生物分析仪MicroScan-Walkaway 40 Plus及配套鉴定卡（西门子公司产品）；PCR 仪（杭州朗基科学仪器有限公司产品）；二氧化碳培养箱；美国Thermo Scientific公司超低温冰箱。PCR试剂、琼脂糖、DNA Marker均为北京天根生化科技有限公司产品；PCR 引物由杭州擎科生物工程有限公司合成。
1.3 菌株鉴定和药敏试验 采用MicroScan-Walkaway 40 Plus全自动微生物分析仪对所有菌株进行鉴定，采用革兰阳性杆菌药敏试验卡进行药物敏感试验，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213、ATCC25923。药敏试验结果参照2017年CLSI文件标准进行判读及结果解释。药敏结果统计时中介归为耐药。
1．4 PCR扩增与基因检测 采用试剂盒法提取金黄色葡萄球菌总DNA，对取血平板上纯培养的1~2单个菌落接种于LB肉汤中培养过夜，离心收集细菌，取细菌1~5ml，12000r/min离心2min，弃上清液。在沉淀中加入1mg/ml溶葡萄球菌素5μL，采用革兰阳性菌基因组DNA提取试剂盒，提取各受试菌株基因组 DNA，测定其浓度和纯度，-70℃保存备用耐药基因进行扩增。
1.5 基因检测扩增体系一致，即：DNA模板、正向引物（F）、反向引物（R）各 1μL，2×mix12.5μL，用无菌三蒸水定容至 25μL。实验用引物见表 1。反应条件：94℃预变性5min，?94 ℃30s、55 ℃ 30s、72℃ 30s，30个循环后 72℃ 延伸10min。5μLPCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统观察结果并记录，并将目的产物送杭州擎科生物工程有限公司进行双向测序，测序结果经 BLAST 与已知序列比对以确定其基因型。
表1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mec A引物序列
1.6 统计学处理
采用 WHONET5.6进行药敏数据分析
2 结果
2.1 标本分布 101株金黄色葡萄球菌中，标本主要为切口分泌物及血液。其中，切口分泌物98株（97%），静脉血3株（3%）。
2.2 药敏试验结果 101株SAU对15种常用抗菌药物的耐药率见下图1，所有菌株均对万古霉素、利奈唑胺、达托霉素敏感。101株实验菌对青霉素的耐药率最高，为92.1%（93/101），对苯唑西林的耐药率为25.7%（26/101）。对喹诺酮类的耐药率基本一致较低，莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率分别为，2%（2/101）、9%（9/101），3%（3/101）。对庆大霉素、红霉素、克林霉素、四环素、喹奴普丁/达福普汀、复方新诺明和利福平的耐药率分别为 7.9%（8/101），，45.6%（46/101），50%（50/101），12.9%（13/101），5%（5/101），2%（2/101），3%（3/101）。
注：M：DNA maker
图（2）mecA基因阳性株电泳图谱，1-16为SAU的PCR产物
3 讨论
自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在1960年被发现以来，目前已在全世界范围内的许多医疗卫生机构流行性传播开来，其高耐药率成为了临床医生面临的棘手问题，威胁着患者的健康和生命。而我院自2010发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）以来至今MRSA的检出率以高达13.3%，但仍低于全国细菌耐药监测网上公布的MRSA分离率35.3%[3]，可能与地区差异关。mecA基因能够编码青霉素结合蛋白2a（PBP2a），而PBP2a为葡萄球菌属 PBP2a的异构体，虽然同样具有转肽酶活性，但与β-内酰胺类结合力比PBP2较弱，故PBP2a对 β-内酰胺类药物体表面现耐药性，mecA基因是造成MRSA对苯唑西林等β-内酰胺类抗菌药物耐药的根本原因[4，5]。
本研究一共收集了101株乳腺癌手术后切口感染分离的SAU，SAU对临床常用的15种常用抗菌药物的耐药情况一般，耐药率低于10%的抗菌药物有11种。101株SAU对青霉素的耐药率最高，为92.1%（93/101）。其次是对红霉素和克林霉素的耐药率较高，耐药率大于40%，分别为45.6%（46/101），50%（50/101）。SAU对大环内酯类药物耐药机制包括，作用靶位的改变、灭活酶的产生及主动外排系统的参与过程密切相关[6]，而本组SAU对其耐药的具体原因有待进一步的研究。对苯唑西林的耐药率为25.7%（26/101）。26株对苯唑西林耐药的MRSA中，有25株检测出mecA基因，阳性率为96.2%。而剩余75株苯唑西林敏感的SAU均未检测出mecA基因，这与王欢[7]等在mecA 基因与金黄色葡萄球菌感染患者的耐药性研究中结果不同，并未检出表型敏感但具有潜在耐药性的菌株，这可能是由不同地域用药习惯不同所导致的。26株MRSA当中有一株mecA基因阴性，耐药表型与基因不一致，推测可能存在其他的耐药机制，如其他亚型的青霉素结合蛋白的改变或产β-内酰胺酶[7，8]。对四环素的耐药率为12.9%（13/101），SAU对四环素耐药的机制主要是合成核糖体保护蛋白将四环素类从30S亚基上释放，从而阻止四环素抑制细菌蛋白合成的作用；另可通过外排泵主动外排四环素[9，10]。101株SAU中，并未发现万古霉素和利奈唑胺耐药的实验菌。
综上所述，在我院乳腺癌患者术后切口分离的SAU中MRSA的分离率呈进行性升高，而mecA基因是导致SAU对β-内酰胺类的抗菌药物耐药的主要原因，是检验MRSA的金标准[11]。临床应加强对乳腺癌患者术前、术中及术后的管理，术前应采取措施给予营养支持及免疫治疗；术中应严格操作规范、控制手术时间；术后应及时换药、保持引流管畅通，对带管出院患者加强随访[12]，避免出现切口感染。对已造成切口感染的患者必须注意抗感染治疗应以抗菌药物药敏试验结果为依据，合理使用抗菌药物，同时临床医护工作者应加强医院感染意识，做好消毒隔离措施，注意无菌操作及手卫生，保持仪器和环境清洁，防止耐药菌株的播散。
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基金项目：江西省自然科学基金资助项目（20171BAB205067）。
论文作者:蒋沁炆,刘春峰,李清祥通讯作者
论文发表刊物:《健康世界》2019年13期
论文发表时间:2019/10/29
标签：葡萄球菌论文; 西林论文; 基因论文; 切口论文; 金黄色论文; 耐药性论文; 乳腺癌论文; 《健康世界》2019年13期论文;