尹飚[1]2000年在《碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞的影响及复合生物磷酸钙修复骨缺损的研究》文中研究表明骨缺损一直是骨科临床的一大难题，近年来利用组织工程学方法治疗骨缺损是生物工程学研究的一个热点。本实验围绕生长因子、成骨细胞、生物磷酸钙三方面来阐释这一问题。 第一部分 实验探讨不同剂量碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）对兔成骨样细胞DNA合成、碱性磷酸酶活性的影响。采用酶动力学方法检测碱性磷酸酶活性，应用流式细胞仪进行细胞DNA含量分析，取得如下结果： （一）b-FGF可明显促进兔成骨样细胞的DNA合成，但却抑制其碱 性磷酸酶的活性。 （二）b-FGF对免成骨样细胞具有双重效应，在浓度为1.0-10ng/ml，呈剂量依赖性，10ng/ml时b-FGF的作用最强。 第二部分 通过X射线衍射、多功能微探针、核磁共振波谱、红外光谱分析生物磷酸钙内部结构。将生物磷酸钙与兔成骨细胞共同做体外培养，并在相差显微镜与扫描电镜下观察。用BCP-骨髓细胞、b-FGF复合物移植修复兔尺骨骨缺损。取得如下结果： （一）该材料晶体结构与人体骨相似 （二）细胞在生物磷酸钙表面生长良好，说明生物磷酸钙是成骨细胞的良好载体，具有良好的生物相容性。 （三）BCP-骨髓细胞、b-FGF复合物移植成功修复兔尺骨骨缺损。
戴瑶[2]2017年在《β-硅酸二钙骨修复支架材料的制备和性能研究》文中研究表明创伤、肿瘤、生理性退化等因素造成的各类骨缺损严重损害着人类的健康,对于骨缺损修复的临床需求也更为迫切和重要。由于骨缺损类型众多,对相应骨修复材料的性能需求也不尽相同。因此,研究出具有针对性的支架材料成为骨缺损修复成功的关键因素之一。本论文以新型生物活性材料β-硅酸二钙作为研究对象,针对其不同性质分别构建陶瓷支架、自固化支架和复合支架,并对其相关材料学和生物学性能展开一系列基础性研究。(1)围绕β-硅酸二钙的陶瓷性质,探讨造孔剂法和模板法制备高强度β-硅酸二钙陶瓷支架的方法和机理,以满足承重骨修复对支架力学强度的需求。当造孔剂炭颗粒含量为50%,粒径为300-500μm,烧成温度为1250°C时,制备出开孔率为64.25%的陶瓷支架。MG-63细胞可在其表面黏附与增殖,表明支架具有良好的生物相容性。以聚氨酯海绵作为模板,制备出具有高强度的β-硅酸二钙陶瓷支架,该支架抗压强度最高可达28.13MPa。模拟体液浸泡实验表明,14d后可在支架表面诱导生成致密磷灰石沉积层,表现出优异的生物活性。细胞实验表明MG-63细胞能在支架表面良好黏附,生长7d后已大量增殖且迁移至支架内部,进一步的Alamar Blue实验表明支架浸提液能够有效促进细胞增殖,表明陶瓷支架具有优异的生物相容性。研究MG-63细胞生长在β-硅酸二钙陶瓷支架以及联合生物反应器力学刺激条件下相关基因转录水平的变化可以发现,β-硅酸二钙陶瓷支架能够促进细胞上调整合素配体β1、细胞外基质COLI和FN从而促进细胞黏附。陶瓷支架及同时联合力学刺激均能够促进FN和TGF-β1转录水平上调,有益于成骨细胞的增殖;能够促进ALP转录水平上调,有益于细胞成骨钙化。最后,裸鼠皮下植入实验表明β-硅酸二钙陶瓷支架具有优异的异位成骨能力。(2)基于β-硅酸二钙自固化性质,探讨低温自固化β-硅酸二钙支架的制备方法,为进一步构建复杂骨组织结构的自固化支架提供基础。通过合理改进Pechini法配方,制备出游离氧化钙含量低至0.36%,粒径约为120nm的β-硅酸二钙颗粒。采用磷酸氢钙(DCPA)掺杂改善β-硅酸二钙自固化性质,20%DCPA含量的β-硅酸二钙自固化样品(C8D2)养护1d后强度最高提升至5.29 MPa。相比于纯β-硅酸二钙自固化样品(C2S),C8D2水化速度更快,水化产物由C-S-H、Ca(OH)_2、HA和傅钙硅石构成。利用β-硅酸二钙的低温自固化性质,采用Na Cl作为造孔剂,结合粒子溶出的方法,制备出C2S和C8D2自固化支架,支架开孔率约为75%,孔径200-500μm,且具有良好的连通孔结构。浸泡模拟体液14d后,自固化支架能在其表面诱导形成由羟基磷灰石和三斜磷钙石两种磷灰石晶体层,表现出良好的生物活性。MG-63细胞能在支架上良好地黏附和增殖,支架浸提液则能显著促进细胞增殖,培养7d时,C2S和C8D2浸提液组细胞增殖率分别达到了17.5倍和18.8倍,表现出良好的生物相容性。细胞生长过程中,C8D2自固化支架通过调控MG-63细胞BMP-2和BMP-6转录上调来促进细胞增殖,上调OPG并抑制IL-6转录来促进细胞的成骨活性,并通过上调ALP转录水平促进细胞成骨钙化。(3)将β-硅酸二钙颗粒作为生物活性成分与小肠粘膜下层(SIS)材料复合,通过调控制备工艺,制备功能化的致密-多孔双相复合骨修复支架,实现致密层阻挡内皮细胞和成纤维细胞迁移,多孔层促进成骨细胞增殖和成骨相关基因转录的功能化设计目标。当SIS浓度0.8%,冷冻温度-20°C时,制备的复合支架多孔层具有优异的连通孔结构,孔径约为100μm,开孔率可达到94%,β-硅酸二钙的加入能够改善SIS的亲水性。支架的致密层由胶原纤维纵横交错排列并层叠而成,且胶原纤维间的孔隙由细胞外基质所填充,对细胞迁移具有良好的阻隔效果。细胞形貌表明复合支架的致密层对内皮细胞HUVEC和成纤维细胞HTFT具有良好的细胞相容性,但HE染色结果没有发现细胞向多孔层迁移的情况,表明其对细胞迁移具有有效的阻隔作用。MG-63细胞能够在复合支架多孔层良好黏附且快速增殖,表明支架优良的生物相容性。细胞生长过程中,复合支架能够促进MG-63细胞细胞增殖相关基因TGF-β1、FN,成骨相关基因BMP-2、BMP-4、BMP-6和成骨分化成熟相关基因RUNX2、OSX、ALP转录水平上调。综上所述,本论文针对不同骨缺损修复策略,设计并系统研究不同性质β-硅酸二钙骨修复支架,分别制备具有高力学强度的陶瓷支架,易塑形的低温自固化支架和功能化的双层结构复合支架。制备的支架均具有合适的开孔率和孔隙结构,良好的生物相容性和生物活性,能通过不同基因调控途径促进成骨细胞黏附、增殖、成骨等生命活动,有益于骨组织修复,有望作为骨修复支架应用于临床。
刘晓峰[3]2011年在《鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞及骨愈合的影响》文中提出临床上由于创伤、肿瘤、感染所造成的骨缺损很常见,目前缺乏较为理想的植骨材料：自体骨移植常受到自身供体有限性的限制以及术后供区损伤、感染等并发症,异体骨主要存在移植后的免疫排斥反应及传播疾病等问题。组织工程学的问世为人体组织器官缺损的再造和修复开辟了新的途径。模仿天然骨的成分和结构特征制造的骨替代材料,可为细胞提供与天然骨相类似的微环境。β-磷酸三钙(Beta-tricalcium phosphate, P-TCP)因其具有良好的生物相容性和成骨活性,在水溶液和体液中的溶解度是羟基磷灰石(HAP)的10-15倍,能够克服HAP在体内的降解问题而成为骨组织修复领域的主要研究对象。但因脆性大和不易成型的缺点,严重制约了其在临床上的应用。将p-TCP与具有良好韧性的有机物复合,形成无机/有机复合生物材料,既可以解决p-TCP的脆性问题,也可以利用有机物来提高材料的生物学活性。纳米β-磷酸三钙是利用纳米技术在纳米结构单元或纳米数量级(1～100nm)下生产的新型材料,具有小尺寸效应、表面效应,可以在三维空间上提高材料的强度。胶原是人体骨组织中的主要有机成分,在体内可以明显增进细胞间的相互作用,如细胞趋化、细胞增殖等。明胶是胶原蛋白的水解产物,具有与胶原相同的氨基酸,良好的生物相容性,同时还具有较好的黏附作用和骨诱导性,可被人体降解吸收以及较低的免疫原性。鹿茸多肽为鹿茸的主要药理活性成分,具有促进骨髓间质细胞分化,软骨细胞、表皮细胞及成纤维细胞增殖等作用,可明显加速骨组织再生、周围神经组织再生及创面愈合。将鹿茸多肽复合到纳米磷酸三钙明胶微球中不仅可以发挥纳米磷酸三钙材料的骨传导性又可以解决多肽类药物不易通过生物屏障,在伤口及创面易被水解酶破坏等问题,可以持续、稳定、高效地控制鹿茸多肽药物的释放速度,延长半衰期,实现药物的靶向释放,大幅度提高药物的生物利用度,从而达到修复骨缺损与药物治疗的双重效果。基于以上认识,本实验研制了鹿茸多肽纳米复合材料。实验分五个部分进行观察研究：1.鹿茸多肽纳米复合材料的制备及性能研究利用反相微乳液法制备了鹿茸多肽纳米复合材料(nano TCP/gel/VAP),扫描电镜观察纳米复合微球形态,SELDI-TOF-MS质谱仪检测复合材料的组成成分。2.鹿茸多肽纳米复合材料的生物相容性评价研究根据国际标准化组织(IS010993)我国(GB/T 16886)对于生物材料相容性的测试要求,通过急性毒性实验、溶血实验、细胞增殖实验和细胞毒性实验研究复合材料的生物安全性。3.鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞生物学特性的影响采用MTT比色法、茜素红染色方法检测nano TCP/gel/VAP对体外培养人成骨细胞的增殖、细胞分泌细胞外钙基质的影响；采用全自动生化分析仪检测成骨细胞碱性磷酸酶活性,通过电镜形态学观察复合材料对受损成骨细胞的影响。4.鹿茸多肽纳米复合材料对兔下颌骨缺损修复影响的实验研究建立兔下颌骨缺损模型,通过鹿茸多肽纳米复合材料和单纯的纳米复合材料置兔下颌骨缺损处,术后4、8、12周时通过表面观察、Micro-CT、组织病理学和扫描电镜观察评价鹿茸多肽纳米复合材料的骨修复效果。5.鹿茸多肽纳米复合材料促成骨细胞早期分化机制的初步研究通过p38MAPK信号转导阻断剂SB203580对成骨细胞增殖的影响与鹿茸多肽纳米复合材料对SB203580作用下成骨细胞分泌ALP、ColⅠmRNA表达的影响,观察鹿茸多肽纳米复合材料在成骨细胞早期分化过程中的作用。实验获得以下主要结果和结论：1.本研究研制了鹿茸多肽纳米复合材料(nano TCP/gel/VAP),扫描电镜观察纳米复合微球形貌良好,直径约20～40μm,具有高度的分散性和均一性,微球表面有纳米级孔洞；通过质谱分析,检测到明胶分子与鹿茸多肽的存在,鹿茸多肽通过静电作用包覆于明胶微球内部。微球形貌规则、尺寸可控,通过调节微球的尺寸可以满足不同骨修复的需要。2.根据国际标准化组织(ISO10993)和我国(GB/T 16886)对于生物材料相容性的测试要求,证明鹿茸多肽纳米复合材料无细胞毒性,无急性毒性,不引起溶血反应,符合相应的标准要求,具有良好的生物安全性。3.鹿茸多肽纳米复合材料可以促进人成骨细胞的黏附、增殖,并促进成骨细胞分泌细胞外基质和形成钙结节,促进成骨细胞的分化成熟,对受损的成骨细胞有保护和修复的作用。4.鹿茸多肽纳米复合材料修复兔下颌骨缺损术后12周,nano TCP/gel/VAP组的骨缺损由骨组织修复,空白对照组的则由纤维组织覆盖,nano TCP/gel组介于上两组之间,边缘是骨组织覆盖,而中心区是纤维组织。Micro-CT检查显示,复合材料组优于空白对照组,nano TCP/gel/VAP组优于nano TCP/gel组。组织学观察nano TCP/gel/VAP组见致密的板层骨,可见哈佛管系统,髓腔再通,板层骨与原骨组织紧密结合；nano TCP/gel组为编织骨修复,缺损中心仍为纤维组织；空白对照组在缺损周边部位可见极少骨岛生成,中心部位仍由纤维组织填充。扫描电镜观察nano TCP/gel/VAP组,为致密的骨样组织,nano TCP/gel组新生骨组织与边界融合不紧密,孔隙较多,结构疏松。空白对照组未见骨组织生成,仍为纤维组织。表明鹿茸多肽纳米复合材料因鹿茸多肽成分的引入在磷酸三钙的传导性基础上增加了骨诱导性能,提高了兔下颌骨缺损的修复效果。5. p38MAPK阻断剂SB203580使人成骨细胞增殖能力下降,20μM为阻断剂SB203580半数抑制浓度；ALP活性检测结果显示,阻断剂组ALP活性最低,复合材料组ALP活性最高,复合材料加阻断剂组ALP活性低于复合材料组；实时荧光定量PCR结果显示,阻断剂组ColⅠmRNA表达均低于对照组、复合材料组和复合材料加阻断剂组；与复合材料组比较,复合材料加阻断剂组ColⅠmRNA表达在干预初期二者相近,干预时间延长则复合材料加阻断剂组明显低于复合材料组,表明p38MAPK通路在人成骨细胞的分化成熟中起着重要的调控作用,鹿茸多肽纳米复合材料能够逆转阻断剂的作用,进一步促进细胞的ALP活性增高,ColⅠmRNA表达量增加。阻断p38MAPK通路并不能完全抑制复合材料促成骨细胞早期分化作用,提示鹿茸多肽纳米复合材料还可能通过其他信号通路调节成骨细胞的早期分化。本研究的创新之处,首次将天然活性多肽—鹿茸多肽复合到纳米磷酸三钙、明胶体系中,制备了具有生物活性的鹿茸多肽纳米复合材料。该项研究填补了鹿茸多肽在骨修复新型材料应用中的空白。首次证明了该新型复合材料对下颌骨缺损具有明显的修复作用。该项研究为临床骨缺损修复的新型材料的研究提供了理论和实验依据。
张晓峰[4]2018年在《PHBV纳米纤维修复骨组织及神经组织的实验研究》文中认为组织工程的三要素是由种子细胞、支架材料、生长因子组成,我们选取了PHBV这种具有生物降解性、生物相容性以及无免疫源性等特征的微生物产生的聚酯作为支架材料,并用静电纺丝法制备出PHBV纳米纤维。基于PHBV纳米纤维我们分别制备出适用于骨组织工程的非定向和定向PHBV/HA纳米纤维支架,非定向和定向PHBV纳米纤维支架以及适宜于神经组织工程的非定向PHBV/Laminin纳米纤维导管、定向PHBV纳米纤维导管以及非定向PHBV/Laminin纳米纤维导管、非定向PHBV纳米纤维导管。通过CCK-8测试干细胞在材料上的增殖情况,通过成骨标志物检查来观察材料对成骨的影响,通过对体外施旺细胞的培养来观察材料对于神经再生功能的影响。结果表明,细胞接种1,4,7天后,不含HA的非定向PHBV纤维支架更适宜BMSCs的粘附和增殖;接种1,2,4周后,检测成骨标志物:碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)以及钙结节,分化实验结果表明含有HA的纳米纤维支架更有利于促进MSCs向成骨细胞的分化。而体外施旺细胞在PHBV纳米纤维膜上的培养表明,无论定向与非定向还是有无层粘蛋白修饰,均适宜于施旺细胞的黏附和增殖细胞。通过SEM扫描我们发现,BMSCs以及施旺细胞在定向纳米纤维上会顺着纤维方向生长、伸展,而在非定向纳米纤维上细胞则呈现随机排列和伸展。在体内修复骨缺损的研究中,分别将定向及非定向PHBV纳米纤维三维支架,定向及非定向PHBV/HA纳米纤维三维支架,植入新西兰兔的梭骨缺损处,在植入术后通过大体观察,放射学检查,组织学检查,扫描电镜观察,CT扫描三维重建以及力学测试来进行评估。结果表明定向及非定向PHBV纳米纤维三维支架,定向及非定向PHBV/HA纳米纤维三维支架均可促进骨缺损的修复,其中非定向PHBV/HA纳米纤维三维支架对于骨组织的再生作用最佳,而定向PHBV纳米纤维三维支架成骨能力最弱,HA对于材料的修饰对于体内骨组织再生的影响较为明显。我们分别在术前及术后通过对新西兰兔的抽血检测,发现PHBV材料具有良好的生物相容性。在体内神经缺损修复的研究中,我们制备了基于PHBV纳米纤维的三维神经导管,分别是定向及非定向PHBV纳米纤维三维神经导管,定向及非定向PHBV/Laminin纳米纤维三维神经导管,植入SD大鼠的坐骨神经缺损处,在植入术后通过步态测试,神经电生理,大体观察,组织学检查来进行评估。结果表明定向及非定向PHBV纳米纤维三维神经导管,定向及非定向PHBV/Laminin纳米纤维神经导管均可促进神经缺损的修复,但是定向PHBV纳米纤维神经导管及定向PHBV/Laminin纳米纤维神经导管对于神经缺损的效果更好。定向纳米纤维对于神经再生的影响更为明显。我们通过对大鼠坐骨神经远端内源性神经营养因子的检测,发现材料对于神经的修复可能通过影响大鼠内源性神经营养因子的分泌而实现。
王根林[5]2008年在《可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究》文中研究指明第一部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在SD大鼠体内降解的实验观察【目的】制备丝素蛋白/羟基磷灰石(silk fibroin/hydroxyapatite,SF/HA)复合人工骨材料,并将该材料植入生物体内降解,以了解SF/HA在动物体内的降解速率及机体对SF/HA的组织学反应,为后续成骨实验提供可靠的参考数据。【方法】以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板,以家蚕丝素短纤维为增强材料,以NaCl为致孔剂,采用等静压的方法制备4种SF/HA复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组,测定4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石在0.5h、2h、6h、12h及24h不同时间点的吸水率。将4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石植入SD大鼠背部皮下,进行体内降解观察。实验组分别于术后2、6、12、16、20及24周取材,对照组分别于术后2、12及24周取材,进行大体观察及组织学检查。【结果】丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同,制备的4种SF/HA人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下:SF/HA_3、SF/HA_4>SF/HA_2、SF/HA_1 >HA。HA、SF/HA_1及SF/HA_2降解十分缓慢或基本不能降解;SF/HA_3 20～24周降解完毕;SF/HA_4 12～16周降解完毕;各种材料周围组织未见明显变性坏死等。【结论】SF/HA_1平均孔径为6.5μm,最大孔径也只有15μm,不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA_4虽然孔径、孔隙率满足要求,但力学强度较低,压缩强度只有1.59MPa,在水中很快散开,也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中,我们剔除这两种材料,将对SF/HA_3及SF/HA_2两种材料进行体外细胞相容性研究。第二部分兔骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究【目的】体外分离培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),并向成骨方向诱导培养,为SF/HA相容性提供检测细胞及为SF/HA组织工程化骨提供适宜的种子细胞。【方法】抽取新西兰白兔的骨髓5ml,通过密度梯度离心法获取BMSCs,体外贴壁培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。第2代细胞用含1×10~(-8)g/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠及50μg/l L-抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;采用MTT法测定细胞增殖情况;使用碱性磷酸酶染色及Von Kossa钙结节染色等方法,鉴定其成骨性能。【结果】BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性,细胞增殖良好,体外矿化结节Von Kossa染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性,证实其有成骨潜能。【结论】可以通过体外分离纯化兔BMSCs,在一定条件下能够向成骨方向诱导分化,并能使细胞保持较高的成骨活性,适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。第三部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究【目的】以成骨诱导的BMSCs作为检测细胞,与两种丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HA)进行体外复合培养,检测SF/HA的细胞相容性。【方法】将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的SF/HA_2及SF/HA_3材料上复合培养,以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以MTT法检测材料对细胞增殖活性的影响,以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力,以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。【结果】扫描电镜及组织学观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在SF/HA_2及SF/HA_3上能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTT法测定OD值均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。材料浸提液细胞毒性试验显示,细胞毒性分级均为0～Ⅰ级,两种SF/HA浸提液对细胞生长基本无毒性作用。【结论】SF/HA_2与SF/HA_3对BMSCs的生长和成骨功能无影响,具有良好的细胞相容性,具有构建组织工程化骨的可行性。第四部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究【目的】探讨SF/HA_2及SF/HA_3体内异位成骨的能力,并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性,为SF/HA修复节段性骨缺损提供实验依据。【方法】将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞,以5×10~7/ml的密度接种到SF/HA_2,作为实验组1;接种到SF/HA3,作为实验组2,并于3～5d后植入兔背部肌肉中。植入单纯SF/HA_2与SF/HA_3,作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型,观察组织相容性。于术后第4、8、12周,每次随机选取5只兔处死后取材,大体观察及HE染色组织学观察,并进行骨组织形态计量学分析,定量比较各组新骨形成情况。【结果】实验组术后4、8、12周均有新骨形成,随着时间延长,新骨生成量增多;骨组织形态计量学分析显示,实验组1优于实验组2(P<0.05);对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。【结论】肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示,两种SF/HA具有良好的组织相容性。SF/HA_3与SF/HA_2复合细胞后构建的组织工程化骨,具有良好的异位成骨能力,可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看,SF/HA_3更适合于作为人工骨材料,将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。第五部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究【目的】探索SF/HA_3组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性,期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。【方法】在本实验中将SF/HA_3更名为SF/HA,与诱导的兔BMSCs复合,构建组织工程化骨。麻醉生效后,充分显露兔左侧桡骨中上段,造成15mm节段骨缺损。实验组植入SF/HA+BMSCs复合物,实验对照组植入SF/HA材料,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。于术后第4、8、12及16周行X线摄片及16周时行螺旋CT扫描重建,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行HE染色及Masson染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较12周及16周时各组动物的骨修复情况。【结果】实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示,新骨生成有统计学差异(P<0.05),实验组优于实验对照组优于空白对照组;大体观察及放射学检查证实:实验组兔桡骨缺损完全愈合;实验组对照组缺损处少部分骨愈合;空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。【结论】SF/HA与BMSCs复合,降解速率适宜,能较快被骨组织取代,具有相当于自体骨的骨缺损修复能力,基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用,单独用于节段性骨缺损修复作用有限。
王福科[6]2009年在《脐血来源VECs与ADSCs联合培养移植修复颌骨缺损研究》文中认为目的:为解决组织工程骨血管化缓慢,新骨生长迟缓等问题,在构建组织工程骨时不仅需要植入有成骨潜能的干细胞,而且同时植入加速血管形成的内皮细胞。血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells,VECs)可以有力的支持脂肪干细胞(Adipose-Derived Stromal Cells,ADSCs)向成骨方向转变,还可以加快血管的发生为干细胞的成骨提供营养支持。有血管内皮细胞参与的联合培养的骨组织工程种子细胞越来越成为有希望在临床上应用。本实验研究在体、外情况下,在联合培养体系中血管内皮细胞对脂肪干细胞的增殖、成骨分化的影响;确定联合培养ADSCs和VECs作为种子细胞的生物工程骨修复骨缺损能力。方法:(1)分离大鼠脐血单个核细胞,血管内皮诱导液培养分化,于3周、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF表面标志。(2)用4种不同类型的血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CDl33、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14天进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性。(3)取脂肪干细胞与脐血源血管内皮细胞按照血管内皮细胞、3:1、1:3、1:1、脂肪干细胞的浓度共同培养;分别倒置显微镜下观察联合细胞的形态变化;MTT法描出各浓度细胞的生长曲线,比较各组细胞生长曲线差异;7、14天各组ALP试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性和饱和茜素红钙染色;倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙分泌情况;4、7、14天定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量。(4)用猪椎骨制备部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨,扫描电镜观察;脂肪干细胞和血管内皮细胞接种部分脱蛋白骨和部分脱蛋白生物骨片,MTT法检测吸光度,评价纤维粘连蛋白脂肪干细胞在PDPB生长影响及三种不同细胞组在PDPBB生长情况,分析移植最佳时机,扫描电镜观察不同细胞组在PDPBB生长情况。(5)分别用BrdU标记的血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨,植于SD大鼠两侧股部肌袋处;流式细胞仪检测外周血CD3、CD4、CD8因子情况,根据CD4/CD8分析外周血T淋巴亚群情况来分析机体植入组织工程骨的免疫排斥情况;硬组织切片计算比较新骨成骨量;硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色,观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况。(6)取健康SD大鼠60只,随机分为5组(A组:PDPBB+血管内皮细胞组;B组;PDPBB+脂肪干细胞组;C组:PDPBB+1:1联合培养细胞组;D组:单纯PDPBB组:E组:空白组),在下颌骨体部椎板咬骨钳制造0.5×0.4临界骨缺损,分别将组织工程骨植于SD大鼠下颌骨骨缺损处;E组做空白对照;X线检查及硬组织切片分析新骨面积成骨量。结果:(1)培养3周脐血单个核细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF抗体免疫荧光检测均为阳性;六周免疫荧光染色可见CD34、Flk-1、vWF为阳性,CD133部分为阳性。(2)脂肪干细胞培养新生牛血清组贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,免疫荧光检测可见CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;成骨诱导后碱性磷酸酶阳性;茜素红染色可见大量红色钙结节影;胎牛血清组大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在;多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CDl33部分为阳性,梭形细胞均为阴性;成骨诱导后多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶和钙结节阳性。(3)体外联合培养细胞1:1和3:1组14天细胞之间出现许多突触相互连接,部分细胞融合成团块状,其余组细胞未见细胞团出现。生长曲线可见各组混合细胞吸光度逐渐升高,脂肪干细胞、3:1、1:3、1;1浓度组12天时处于高峰,1:1浓度组吸光度最高;血管内皮细胞组第10天吸光度达到高峰;随后各浓度组细胞吸光度逐渐下降,差异有统计学意义。(4)体外培养第7天时ALP染色脂肪干细胞、3:1、血管内皮细胞组呈阴性反应,1:3和1:1组混合培养细胞部分细胞阳性;茜素红骨钙检测各组均未发现红色阳性细胞。14天时ALP染色脂肪干细胞、血管内皮细胞组仍呈阴性反应,3:1、1:3和1:1组混合培养细胞可见片状阳性细胞;茜素红骨钙检测3:1、1:3和1:1组混合培养细胞极少数阳性细胞,其余各组未发现阳性细胞;各组ALP检测量随时间延长逐渐增高,各时间1:1组ALP最高;脂肪干细胞组和血管内皮细胞组ALP基本没有变化;1:1组和其它各组之间两两比较均有显著统计学意义(P＜0.01);各组OC检测量随时间延长逐渐增高,4天时1:3组OC最高;7天和14天时1:1组OC最高;1:1组和其它各组之间两两比较均有显著统计学意义(P≤0.01)。(5)猪椎骨制备部分脱蛋白骨孔隙分布均匀,由大量的羟基磷灰石纤维编织而成;部分脱蛋白生物骨表面可见大量颗粒状蛋白结晶;细胞在部分脱蛋白骨上增殖曲线呈“S”形,在部分脱蛋白生物骨增殖曲线失去“S”形,第10天均达到高峰,各分组之间差异有统计学意义(P＜0.01);各细胞组在PDPBB上吸光度逐渐增加,第10天均达到高峰,1:1混合细胞组最高,各细胞组之间差异有统计学意义(P＜0.01);10天联合培养细胞细胞组大量细胞与PDPBB附着,呈巢状分布。(6)异位成骨第2周肉芽组织已经长入组织工程骨孔隙内,4周大量多核巨大破骨细胞位于支架材料周围长入材料内部,破坏、吸收支架材料;混合细胞组支架材料边缘开始出现均质、无细胞的类骨物质,孔隙内大量滋养血管形成;12周各组支架材料部分吸收,边缘模糊,易碎裂;各组边缘均可见均质的类骨物质出现,单纯PDPBB组较少,混合细胞组最多;部分切片上材料周边骨化中心;各组未见大量淋巴细胞侵润;新生骨形成联合细胞组最多,单纯PDPBB组较少,复合联合细胞组与各组之间差异有统计学意义(P＜0.01)。(7)外周血T淋巴亚群CD4/CD8变化曲线:单纯PDPBB组大鼠外周血CD4/CD8在1-8周期间逐渐升高,第8周时位于最高点,之后逐渐降低,与空白组比较有统计学意义(P＜0.05);复合VECs组第一周最高,1-3周逐渐降低,3-12周基本成直线状;复合ADSCs组、复合混合细胞组和空白组基本成直线状,与空白组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。(8)Brdu免疫荧光染色各组植入种子细胞开始呈分散状分布,细胞逐渐增殖呈巢状,血管内皮细胞组和联合培养细胞组植入内皮细胞增殖形成大量新生血管;未标记BrdU空白组未见阳性细胞出现。(9)修复骨缺损第2周各组大量纤维组织包绕植入组织工程骨;空白组纤维组织已经封闭骨缺损;第4周各组植入材料不能移动,PDPBB复合血管内皮细胞组周围肌肉及纤维组织明显增厚,把组织工程骨和下颌骨连接成一体,组织工程骨血供较其他组丰富;第8周PDPBB复合联合培养细胞组组织工程骨空隙已经消失,与下颌骨骨性连接,表面部分材料已皮质化;第12周各组均已和下颌骨骨性连接,单纯PDPBB组、PDPBB复合脂肪干细胞和复合血管内皮细胞组材料部分吸收,材料大体形态还保留有原来形态;PDPBB复合联合培养细胞组形态大体和正常下颌骨相似,材料表面已皮质化;空白组骨缺损未被修复,骨断裂部分已经被骨皮质封闭,形成半圆形骨缺损区。(10)X线检查PDPBB复合血管内皮细胞组2周支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较宽,周围有新生骨痂生成;4-8周骨痂逐渐增多,12周时支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较前明显减淡,但支架材料大体形态依然存在。PDPBB复合脂肪干细胞组2周骨缺损周围骨痂开始生成,12周组织工程骨骨密度与正常骨质相比已基本相同;PDPBB复合联合培养细胞组4周-12周骨缺损周围骨痂生成随时间延长逐渐增加,8周已经骨性联合,骨缝已经消失;12周骨密度明显增加,骨形态已经基本恢复正常;单纯PDPBB组12周时支架材料骨密度较前减轻,与正常骨质对比明显;空白组8周和12周图像骨缺损面积减小,骨皮质已经封闭缺损端,仅剩下半圆或三角形缺损。(11)组织血检查新生骨形成混合细胞组最多,复合血管内皮细胞组次之,单纯PDPBB组较少,混合细胞组与各细胞组之间差异有显著差异(P＜0.01);复合血管内皮细胞组与复合ADSCs比较有统计学意义(P＜0.05);和单纯PDPBB组比较差异有显著差异(P＜0.01)。结论:(1)大鼠脐血来源的单个核细胞在体外诱导3周可以分化为EPCs,6周部分细胞分化为成熟血管内皮细胞。(2)新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞;脂肪干细胞培养胎牛血清培养含有大量的血管内皮细胞。(3)血管内皮细胞和脂肪干细胞体外培养下,细胞相互促进增殖;血管内皮细胞能在体外诱导脂肪干细胞向成骨细胞方向分化,1∶1比例细胞联合培养可以达到最好效果。(4)纤维粘连蛋白能促进细胞在PDPB支架材料上的增殖。(5)1∶1混合细胞在PDPBB支架材料上的增殖优于单种细胞,10天为最佳移植时机。(6)联合培养细胞组异位成骨能力最强,血管内皮细胞能增强组织工程骨成骨能力;各复合细胞组织工程骨机体内未引起明显免疫排斥反应。(7)组织工程骨植入种子细胞在体内能大量增殖,参与新组织和新生血管的形成。(8)联合培养细胞组修复骨缺损能力最强,血管内皮细胞能增强组织工程骨成骨能力。
谢求恩[7]2009年在《磷酸钙骨水泥复合bFGF与VEGF修复兔桡骨缺损的实验研究》文中提出目的观察分别混合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和bFGF+VEGF的磷酸钙骨水泥(CPC)移植修复兔桡骨骨缺损的成骨作用,评价bFGF与VEGF单独及联合应用治疗骨缺损的效果。方法选取36只健康家兔,体重为2.5～3.0kg。所有动物均建立双侧桡骨1.0cm的骨缺损实验模型。采用完全随机法将72侧前肢分为A、B、C、D四组,每组18侧。其中A组为对照组,实验组分为B、C、D三组。A组于骨缺损部位植入单纯CPC;B组植入复合bFGF的CPC;C组植入复合VEGF的CPC;D组植入联合应用bFGF和VEGF的CPC。分别于术后3、6、12周三个时间点切取标本,每组每个时间点根据随机原则取6个标本,通过X线摄片、骨密度测量、生物力学测试、组织形态学观察及评分等手段,观察各个时期新骨形成的情况。结果1、大体解剖观察显示12周时,D组骨缺损完全修复,B、C两组骨缺损亦基本修复,而A组仅有较多新骨形成,骨缺损未修复。2、X线摄片显示12周时D组骨缺损完全修复,材料基本降解;B、C两组骨缺损基本修复。骨密度测量结果显示术后各时间点,实验组结果均高于对照组。术后12周时D组骨密度明显高于B、C两组(P＜0.05),B、C两组之间无明显差异(P＞0.05)。3、生物力学测试(12周时)显示实验组最大抗折载荷明显高于对照组(P＜0.05)。D组明显高于B、C两组(P＜0.05);B、C两组之间无明显差异(P＞0.05)。4、组织形态学观察显示在3周时,实验组骨小梁生长旺盛,有透明软骨形成;而对照组中骨小梁稀少。6周时,实验组中类骨组织转变为编织骨,形成骨性骨痂,且D组新骨量明显多于B、C两组。12周时,编织骨改建为成熟的板层骨,D组中皮质骨和髓腔的正常关系以及骨小梁正常的排列结构重新恢复,B、C两组则未见骨髓腔再通;A组中新骨仅少量增加。新骨形成及骨塑形评分显示术后各时间点D组均高于A、B、C三组(P＜0.05)。结论1、CPC/bFGF、CPC/VEGF和CPC/bFGF+VEGF三种复合物均能促进骨组织生长及加速骨缺损的修复;2、CPC/bFGF+VEGF复合物促进骨组织生长的能力明显优于CPC/bFGF以及CPC/VEGF复合物,说明bFGF与VEGF促进骨生长具有协同作用。
沈健坚[8]2011年在《计算机辅助设计、制作个性化骨缺损修复体的研究》文中认为目的：将组织工程学(TE)、计算机辅助设计(CAD)、快速成型(RP)、逆向工程(RE)、有限元分析(FEA)等技术相结合；通过对比格犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行分离、培养及定向诱导分化为成骨细胞,为骨缺损修复的种子细胞；计算机辅助设计、快速成型技术制作个性化骨缺损修复支架,在体外联合构建成骨细胞和个性化骨缺损修复支架的组织工程骨支架；采用有限元法对不同内固定方式+个性化骨缺损修复体修复重建骨缺损、计算机辅助设计个性化骨缺损体修复肿瘤型骨缺损进行静力结构分析,为个性化骨缺损修复提供力学依据。方法：1.采用密度梯度离心法和贴壁细胞分离法相结合的方法,对比格犬骨髓间充质干细胞进行分离、培养、扩增、以及骨髓间充质干细胞的生物学特性的鉴定。2.采用成骨细胞诱导液对BMSCs进行定向诱导分化,通过对诱导后的细胞进行形态学、组织化学和免疫组化染色等鉴定。3.计算机辅助设计骨组织工程支架内部结构的基本结构单元；有限元法分析不同基本结构单元的的应力和整体变形情况,筛选获取合适的基本结构单元；计算机辅助设计孔径、孔隙率和连通性可控的骨组织工程支架。4.通过立体光固化成型制作骨组织工程支架的负型模具和外套的光敏树脂模型；在骨组织工程支架负型模具中灌注β-TCP浆体,通过原位凝固和高温烧结,形成孔径、孔隙率和连通性可控的骨组织工程支架。5.将诱导后的成骨细胞复合多孔β-TCP陶瓷支架构建组织工程骨支架,观察成骨细胞在多孔β-TCP陶瓷支架上的粘附和增殖情况。6.计算机辅助建立胫骨骨缺损的三维模型,计算机辅助设计与骨缺损外形相匹配的个性化骨修复体的三维模型；计算机辅助建立Golf钢板和髓内钉固定修复骨缺损的三维模型；采用有限元法分析不同固定方式重建骨缺损后的应力情况。7.计算机辅助建立胫骨近端骨肿瘤的三维模型、测量肿瘤病灶范围、设计肿瘤病灶切除截骨平面；计算机辅助设计个性化骨修复体、建立Golf钢板固定修复骨缺损的三维装配体模型。采用有限元法分析Golf钢板+个性化同种异体骨修复体修复重建膝关节周围肿瘤切除后大段骨缺损的应力、应变分布情况。结果：1.经密度梯度离心法和贴壁细胞发分离获取的骨髓间充质干细胞原代培养14天细胞达90%以上融合,细胞呈长梭形、并沿一定方向放射状排列生长,连续传代培育3代,细胞形态、增殖特性未发生改变；P2代BMSCS的G1期为74.38%、G2期为0.4%、S期为25.23%；BMSCS组织化学染色结果：糖原PAS呈阳性,油红O染色为阴性,碱性磷酸酶染色为阴性。2.采用含有β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松和10%FBS/DMEM的成骨细胞诱导液对BMSCs诱导培养14天后的细胞呈多边形或多角形；组织化学染色显示：碱性磷酸酶染色阳性、茜素红染色阳性、银染色阳性；I型胶原免疫反应阳性；证实诱导后的细胞为成骨细胞。3.成功实现计算机辅助设计骨组织工程支架不同的基本结构单元；有限元分析证实：开口立方体结构单元力学性能最强、立方体-圆柱结构单元次之、立方体-球体结构单元最差；在计算机辅助设计软件中,可以设计出孔径、孔隙率和连通性可控的骨组织工程支架,以及与支架阴阳互补的负型模具。4.采用快速成型技术,可以制作出孔径、孔隙率和连通性可控的骨组织工程支架负型模具；采用原位凝固成型法结合快速原型技术可以制备孔径、孔隙率和连通性可控的β-TCP陶瓷支架。5.成骨细胞与多孔β-TCP陶瓷支架体外培养7天后,见成骨细胞在支架中粘附、增殖情况良好,HE染色显示：多孔β-TCP陶瓷支架的孔壁均有成骨细胞的粘附生长。6.计算机辅助建立Golf钢板固定和髓内钉联合个性化骨缺损修复体修复骨缺损的三维模型；建立‘'Golf钢板+个性化骨缺损修复体”、“髓内钉+个性化骨缺损修复体”的有限元模型；Golf冈板固定修复骨缺损的最大等效应力为24.37Mpa,髓内钉固定修复骨缺损的最大等效应力13.51Mpa；对于胫骨骨干处的大段骨缺损修复,髓内钉固定较钢板固定合适。7.借助于逆向工程软件和计算机辅助设计软件,成功设计与肿瘤切除后骨缺损病灶外形匹配的个性化骨缺损修复体；有限元分析显示：轴向加压试验中,Golf钢板固定修复胫骨近端肿瘤型骨缺损的最大等效应力为18.26Mpa；扭转试验时最大等效应力为64.466Mpa; Golf钢板+个性化骨缺损修复体修复胫骨近端肿瘤型骨缺损能够提供足够的稳定性。结论：1.骨髓间充质干细胞是骨组织工程研究理想的种子细胞。2.采用计算机辅助设计技术,可以设计出不同内部结构的骨组织工程支架。3.计算机辅助设计-快速成型制作相结合,可以制备孔径、孔隙率和连通性可控的β-TCP陶瓷支架。4.β-TCP具有良好的生物相容性。5.逆向工程-计算机辅助设计相结合,可以设计出与骨缺损病灶外形相匹配的个性化骨缺损修复体。6.有限元分析可以为骨缺损修复重建提供力学依据。
张丽君[9]2003年在《bFGF基因转染成骨细胞的生物学性质及成骨研究》文中进行了进一步梳理许多研究结果表明碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)直接与成骨细胞联合植入体内能明显促进骨形成过程，这对临床治疗骨折、骨缺损、骨坏死等骨科疾病有一定的效果。但是bFGF在体内易降解，因此bFGF和成骨细胞联合植入时直接外源给予bFGF需反复多次注射，造成使用不方便、易感染，而且bFGF浓度不易控制，影响疗效。因此本课题设计基因治疗与骨组织工程学相结合的方法以改变外源性加入bFGF蛋白的不足之处，即将成骨细胞经bFGF基因转染后进行体外扩增，并进一步研究其体内外成骨能力，得出如下结果： 应用PCR技术从克隆载体PBR322-bFGF载体上扩增获得bFGF cDNA基因，采用基因重组技术将bFGF cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-C3上。重组质粒分别经双酶切、PCR分析及序列测定验证了插入片段的正确性后，用脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-bFGF和pEGFP-C3-bFGF转染3T3细胞。荧光显微镜观察转染细胞的荧光表达情况，细胞爬片免疫组化以及细胞培养上清的ELISA检测bFGF表达情况。结果表明pcDNA3.1-bFGF和pEGFP-C3-bFGF可表达bFGF蛋白，而且pcDNA3.1-bFGF能够分泌表达bFGF蛋白。 研究中通过比较分批消化收集法和植块培养法分离培养成骨细胞的效果，确定采用这两种方法相结合即植块消化培养法分离成骨细胞，而后对所分离的细胞进行了鉴定并研究了其生长曲线，结果发现细胞前二天处于适应期，从第三天开始进入对数生长期，当培养至第8天进入稳定期。取对数生长期细胞进行bFGF重组质粒转染。 以pEGFP-C3-bFGF重组质粒转染成骨细胞，比较脂质体(Lipofectamine~(TM)2000)和聚乙烯亚胺(jetPEI~(TM))转染成骨细胞的情况，结果发现虽然脂质体的转染效率要高于聚乙烯亚胺，但其对细胞的毒性也大于聚乙烯亚胺，因此确定采用聚乙烯亚胺介导bFGF基因转染成骨细胞。通过荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况确定重组质粒在成骨细胞内代谢时间大约为14天，G418粗筛阳性克隆的浓度为600ug／ml。 将pcDNA3.1-bFGF重组质粒转染成骨细胞，进行bFGF基因在成骨细胞中表达情况和bFGF基因转染对成骨细胞生物学性质的影响研究。RT-PCR、细胞免疫组化、Western Blot、ELISA及MTT细胞增殖实验等分析结果表明：pcDNA3.1-bFGF成功转染成骨细胞并分泌表达bFGF蛋白；所表达的bFGF具有促进3T3细胞增殖的生物学活性。通过比较pcDNA3.1-bFGF转染前后成骨细胞生长曲线以及碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白分泌情况，显示转染成骨细胞的适应期延长至3—4天，
张纲[10]2007年在《bFGF、rhBMP-2聚乳酸纳米微球促进下颌骨骨折愈合的实验研究》文中指出颌面部骨折是口腔颌面外科的常见病和多发病。随着我国交通事故的发生率逐年递增,颌面部骨折的发生率也逐年增加。对颌面部骨折的诊治的研究已成为国内外研究的热点之一。颌面部骨折同全身其他部位骨折相比,其独特性有:复位和固定时要求更严格;在复位固定后,也往往因限制进食影响到骨折的愈合;必须在功能恢复的基础上满足患者对外观的要求。因此,颌面部骨折的治疗必须要求严格的复位和固定,并力求骨折尽可能快地愈合。分子生物学研究表明,骨折愈合是一个多种细胞生长因子参与调控的复杂过程,其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形成蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2)与骨折愈合密切相关。bFGF对成骨细胞、成软骨细胞的增殖和分化都有明显的刺激作用,因而在骨折愈合过程中发挥重要作用。BMP-2是骨折修复时的启动因子,通过调控细胞核内相关基因的表达,诱导细胞的分化从而促进软骨及骨的形成。分子创伤学的发展使采用外源性细胞生长因子加速骨折愈合成为可能。但目前有关采用细胞生长因子加速颌骨骨折愈合的研究结果都存在着一定的缺陷,表现为细胞生长因子一方面生物活性大,生理作用强。另一方面体内半衰期短,清除率高,非注射给药生物利用度低,不能持续有效的促进骨折愈合。为此一些学者采用骨折局部注射BMP-2和bFGF,或者研制多种缓释bFGF和BMP-2载体材料等方法试图解决这一难题,但都存在bFGF和BMP-2降解快,效果短暂,操作复杂,不能稳定而持久地发挥作用等情况。纳米技术是一门在纳米级的尺度下,对物质进行制备和工业化,并相互交叉发展的综合性的科技体系。纳米微球被器官或组织吸收,能显著延长药效、提高利用度。通过对包裹材料的调控,可以实现纳米微球在体内的缓释和靶向分布。基于以上分析,结合国内外研究进展,本课题通过药剂学实验,采用聚乳酸(polylactic acid,PLA)为包裹材料,制备bFGF- PLA纳米微球(bFGF-PLA-Ns)、rhBMP-2-PLA纳米微球(rhBMP-2-PLA-Ns),探讨bFGF和BMP-2缓释系统加速颌骨骨折愈合的方法。我们将bFGF-PLA-Ns,rhBMP-2-PLA-Ns胶体液分别制成冻干粉剂和凝胶,研究微球药物形态和粒经分布;载药量和包封率;体外缓释时间、缓释方程和生物学特性等。通过原代培养兔成骨细胞,探讨bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞的生物学效应。观察不同浓度bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞增殖的影响;对增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的作用;对碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和对矿化度的影响;在rhBMP-2-PLA-Ns干预下,探讨成骨细胞对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响。建立兔下颌骨骨折模型,分别通过HE染色,免疫组化研究PCNA和Ⅷ因子相关抗原的变化,四环素荧光染色新骨的生成,原位杂交研究rhBMP-2-PLA-Ns对VEGF的作用等方法,探讨bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对兔下颌骨骨折愈合的作用。实验方法和结果:1、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的制备和其物理、化学特性:PLA纳米微球制备:Malvern激光粒度分布测试仪测定三组PLA胶体平均粒径分别为161nm,154nm,160nm,达到实验要求。对bFGF和rhBMP-2进行精密度、二氯甲烷和丙酮混合物中稳定性测定,证实bFGF和rhBMP-2精密度和稳定性可靠。采用复乳-干燥法(w/o/w)将bFGF和rhBMP-2制备成bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2- PLA-Ns,通过电镜和Malvern激光粒度分布测试仪测定,显示微球的粒茎为30～50nm,该纳米微球表面光滑圆整,球体大小均匀,粒径分布范围窄。通过处方优化采用1%乳糖作为支架剂,载药量和包封率研究证实bFGF-PLA-Ns包封率和载药量分别为91.72±1.31%和[(27.65±0.44)×10~(-3)]%,rhBMP-2-PLA-Ns包封率和载药量分别为90.54±1.32%和[(124.73±0.41)×10~(-3)]%。模拟体内环境研究表明,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns在14d内,不仅一直持续释放bFGF和rhBMP-2,而且所释放出的bFGF和rhBMP-2浓度可以保持在一定的水平。平均浓度分别是bFGF-PLA-Ns为(72.47±6 .26)ng/ml,rhBMP-2-PLA-Ns为(73.44±5.38)ng/ml。以累积释放率和时间进行拟合,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的体外释药规律均符合Higuichi方程,分别为:Q=27.7636t~(1/2)-13.4247,r=0 9975,Q=26.7687t~(1/2)-12.3283,r=0 9962。2、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞体外生物学效应研究:兔成骨细胞原代培养并进行形态观察和鉴定。观察bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞的增殖效应(MTT法)。结果提示,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns微球均能显著的增加成骨细胞的增殖(p<0.05)。茜素红染色研究表明,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns都对矿化结节的形成有显著的刺激作用(p<0.05)。通过对成骨细胞ALP活性的研究,证实bFGF-PLA-Ns能显著促进成骨细胞的分化(p<0.05)。免疫组化研究bFGF-PLA-Ns对成骨细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达影响,结果表明bFGF-PLA-Ns能增强PCNA活性(p<0.05);免疫荧光研究rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞PCNA表达影响,表明rhBMP-2-PLA-Ns能增强PCNA活性。Western blot研究rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞VEGF表达的影响,结果表明rhBMP-2-PLA-Ns可以刺激成骨细胞自分泌VEGF的增加。3、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns促进下颌骨骨折愈合的动物实验:建立兔下颌骨骨折模型,实验分为5组,设立空白组,单纯bFGF组,bFGF-PLA-Ns凝胶试验组,单纯rhBMP-2组和rhBMP-2-PLA-Ns凝胶试验组。分别在术后1周,2周,4周,8周处死动物。对骨折断段病理切片行HE染色观察。结果提示:与空白组和对照组相比,试验组术后1周有新生骨小梁形成;术后2周有较多编织骨形成,成熟度高;术后4周编织骨进一步增多、成熟、融合,可见大量新生血管和继发性骨痂形成,骨痂比例明显高于空白组和对照组。原位杂交检测VEGF mRNA的阳性表达证实,rhBMP-2-PLA-Ns实验组要高于空白组和对照组(P<0.05)。骨折断段病理切片PCNA免疫组化研究结果证实,实验组与对照组、空白组相比,在1、2周PCNA阳性细胞增多(P<0.05)。病理切片血管内皮细胞行Ⅷ因子相关抗原免疫组化研究表明,bFGF-PLA-Ns能够刺激血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的高表达。四环素荧光证实bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns实验组均可以加快新骨的形成,有统计学意义。结论:1、以PLA为载体,采用复乳-干燥法(w/o/w)制备的bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns达到纳米微球的各项要求,各项组成无免疫原性,具备良好的生物安全性。2、实验采用的微球制备方法和工艺确实可行。通过中国、美国、欧盟、日本等专利检索,“碱性成纤维生长因子聚乳酸缓释纳米微球凝胶及其制备方法”具有原创性,已经申请中国知识产权局技术发明专利(申请号:200610095316.9)。3、体外研究表明bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对兔成骨细胞具有明显的生物学效应。4、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns凝胶能够促进兔下颌骨骨折愈合,表明其在加速骨折愈合上具有良好的临床应用前景。
参考文献：
[1]. 碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞的影响及复合生物磷酸钙修复骨缺损的研究[D]. 尹飚. 第一军医大学. 2000
[2]. β-硅酸二钙骨修复支架材料的制备和性能研究[D]. 戴瑶. 湖南大学. 2017
[3]. 鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞及骨愈合的影响[D]. 刘晓峰. 吉林大学. 2011
[4]. PHBV纳米纤维修复骨组织及神经组织的实验研究[D]. 张晓峰. 东南大学. 2018
[5]. 可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究[D]. 王根林. 苏州大学. 2008
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[8]. 计算机辅助设计、制作个性化骨缺损修复体的研究[D]. 沈健坚. 广州中医药大学. 2011
[9]. bFGF基因转染成骨细胞的生物学性质及成骨研究[D]. 张丽君. 华南理工大学. 2003
[10]. bFGF、rhBMP-2聚乳酸纳米微球促进下颌骨骨折愈合的实验研究[D]. 张纲. 第三军医大学. 2007
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