（1西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系 陕西西安 710061)
（2安康市中心医院 陕西安康 725000）
【摘要】目的：研究社会隔离对老年APP/PS1小鼠抑郁样行为及脑内中缝背核束间部5-HT能神经元的影响。方法：15月龄APP/PS1小鼠，随机分为社会隔离组（SI）和群养对照组（GR），分别予以单笼饲养和群养，3个月后，通过旷场实验和强迫游泳实验检测行为学表现。行为学检测结束24h后灌注取脑，恒冷箱冰冻切片，挑选含中缝核的脑片进行5-HT免疫组化染色。结果：与GR组相比，SI组小鼠旷场实验中中央区时间比减少，穿越中央区的次数减少，总休息时间增加；强迫游泳实验中累计不动时间延长。脑内中缝背核束间部5-HT能神经元数量减少。结论：社会隔离使老年APP/PS1小鼠产生抑郁样行为，降低了脑内中缝背核束间部5-HT能神经元的数量。
【关键词】社会隔离；APP/PS1小鼠；旷场实验；强迫游泳实验；5-HT神经元；中缝背核
【中图分类号】R741 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）29-0103-02
Effects of social isolation on depression-like behaviors and 5-HT neurons in interfascicular part of dorsal raphe nucleus of the old APP/PS1 mice Zheng Caifeng1,2, Hui Jianjun1,2,Feng Gaifeng1
1 The human anatomy and tissue embryos of department in Xi 'an jiaotong university school of medicine, Xi 'an 710061,China
2 The center hospital in Ankang, Ankang 725000,China
【Abstract】Objective To study the effects of social isolation on depression-like behavior and 5-HT neurons in interfascicular part of dorsal raphe nucleus of the old APP/PS1 mice. Methods 15-month old APP/PS1 mice were randomly separated into 2 groups: socially isolated mice (SI) and group reared mice (GR). SI mice were singly housed, GR mice were group housed (4 mice per cage). 3 months later, open field test (OFT) and forced swimming test (FST) were carried out to evaluate the behaviors of the mice. Then the mice were sacrificed and the brains were removed. Immunohistochemistry was used to measure the 5-HT neurons in interfascicular part of the dorsal raphe nucleus. Results SI mice spent less time in the central area in the open field test. They crossed the center area less times. The whole rest time was prolonged in the SI mice. In the forced swimming test, the total immobility time was longer in the SI mice. 5-HT neurons of interfascicular part of the dorsal raphe nuclei were decreased in SI mice. Conclusion Social isolation induced depression-like behavior and pathology in old APP/PS1 mice.
【Key words】Social isolation(SI); APP/PS mouse; Open field test (OFT); Forced swimming test (FST);5-HT neuron; Dorsal raphe nucleus
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)是以进行性记忆障碍为临床特征的一种中枢神经系统退行性疾病。除了老年斑和神经原纤维缠结等特征性病理改变外，AD患者脑内各区域有不同程度的神经元的丢失。虽然AD病因和病理机制尚未完全明了，但社会隔离（social isolation，SI）作为一种慢性应激，与该病的发生和发展有密切关系[1-2]。同时，社会隔离也是产生其他心理、精神异常，特别是抑郁的重要原因之一[3]。AD患者由于受记忆、社会活动能力下降的影响，更容易产生心理上（主观上）孤独感和客观上的社会隔离，但社会隔离对AD患者抑郁相关症状和神经病理改变的影响报道甚少。鉴于此，本研究采用目前世界公认的AD模-APP/PS转基因小鼠，通过3个月的单独饲养，观察社会隔离对老年APP/PS1小鼠抑郁相关行为学和脑内（中缝背核束间部interfascicular part of dorsal raphe nucleus, DRI）5-羟色胺能神经元的影响。
1.材料和方法
1.1 实验动物及其分组
15月龄雄性APP/PS1小鼠24只（购于南京大学模式动物中心），随机分为社会隔离（SI组）和正常群养（GR）两组，每组12只。SI组小鼠单笼饲养，GR组小鼠每4只群养于饲养笼内。饲养条件：室温（23±1）℃，湿度（55±5）%，光暗周期12 h/12h， 动物自由饮食。
1.2 行为学检测；3月后，进行行为学检测。
1.2.1旷场实验(open field test)，并稍加改进。实验设备包括由灰色有机玻璃制作的40cm×40cm×40cm、顶部开放的实验箱和计算机实时监测分析系统SMART VIDEO-TRACKING （Panlab Harvard Apparatus Smart V3.0.05,美国）。摄像机置于实验箱顶部上方，与计算机相连接。
实验步骤：在SMART系统中选择旷场模式，设定相关参数和记录时间（10min），将小鼠放入旷场中央，点击“开始”命令后进行实验，计算机自动记录运动总距离、休息时间、平均速度、中央区的时间比率和穿过中央区的次数等指标。每只动物实验结束后，清除实验箱内动物的大小便，用20%酒精擦洗箱底和四壁，以避免实验动物的残留气味影响后续实验。
1.2.2小鼠强迫游泳实验[4]的方法。设备包括由透明有机玻璃制作的直径11cm,高30cm的强迫游泳桶和计算机实时监测分析系统SMART VIDEO-TRACKING（Panlab Harvard Apparatus Smart V3.0.05,美国）。摄像机置于强迫游泳桶前方，记录小鼠的行为数据。
实验步骤：在强迫游泳桶中加水（水深20cm，水温25±1℃）。选择SMART系统中的强迫游泳模式，设定相关参数及指标，记录时间为5min。将小鼠放入，点击“开始”，记录小鼠在游泳过程中不动(即小鼠停止游泳或四肢有轻微动作以保持头部露出水面呼吸，呈漂浮状态）的累积时间。每次测试前, 桶中的水需更换。
1.3 病理检测：免疫组织化学反应。
行为学测试后24h，小鼠经水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛主动脉灌注后，断头取脑，后固定4h。切取含中脑和脑桥部分的脑块，入30%蔗糖过夜。OCT包埋，恒冷箱冰冻切片机连续冠状切片，片厚30μm。从出现中缝核开始，挑选切片，隔5取1，常规免疫组化ABC法进行漂浮染色：一抗为山羊多克隆抗5-HT抗体（ab66047,1: 6000，Abcam,)，二抗（生物素标记兔抗山羊IgG）和SABC来自于博士德SABC免疫组化染色试剂盒（SA2003，博士德，武汉），DAB显色。对照实验：用正常山羊血清代替一抗孵育切片，其余反应过程同上，结果为阴性。
细胞观察和计数：根据小鼠脑图谱，观察中缝背核束间部 5-HT阳性神经元的形态、分布，并对其计数。
1.4 统计学分析
实验数据以均数±标准差（x-±s）表示, 两组间采用t检验进行数据分析，以P＜0.05为有统计学差异。
2.结果
2.1 旷场实验
在旷场实验中，可见两组小鼠运动轨迹大部分位于旷场周边，中央区较少，但SI组中央区更少（图1A，B）。SI组小鼠较GR组小鼠中央区活动时间，穿过中心次数减少, 总休息时间增加（P＜0.05），总运动距离减少, 平均运动速度降低，但没有统计学意义（P＞0.05）（图1)。
图1 旷场实验 A：GR组小鼠典型运动轨迹；B：SI组小鼠典型运动轨迹；C：GR与SI组小鼠的总运动距离；D：平均速度；E：中央区时间比；F：通过中央区的次数；G：总休息时间。（* P＜0.05）
Fig.1 The open field test
2.2 强迫游泳实验
初入水时，两组小鼠在游泳桶内均表现出努力快速游泳，试图逃离。经过尝试，当发现逃逸无望，便会出现不动状态。记录显示，SI组累计不动时间明显长于GR组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05） （图2）。
图2 强迫游泳实验 （* P＜0.05）
Fig.2 The forced swimming test
2.3 免疫组化反应染色
两组小鼠中缝背核各部均可观察到 5-HT免疫阳性神经元。DRI位于内侧纵束之间，在近颅侧冠状切面上，位于DRV的腹侧；在近尾侧的切面上，DRI位于DRC的腹侧，二者的阳性细胞呈背腹方向的条索状（图3）。5-HT免疫阳性细胞大而密集，胞体形态多样，以椭圆形或梭形居多，核为阴性。部分细胞可见1-2个突起。与GR组相比，SI组鼠DRI中的5-HT 免疫阳性神经元数量较少（GR组825.16±13.36，SI组554±15.83），统计分析表明差异有显著性（P＜0.05）。除数量减少外，细胞形态也有一定的变化，可见部分细胞染色较淡，突起较短或消失。
图3 中缝背核5-HT能神经元。A: GR组(颅侧）；B：SI组(颅侧）；C: GR组(尾侧） D:SI组(尾侧）
Aq：中脑水管；DRD：中缝背核北侧部；DRV：中缝背核腹侧部；DRC：中缝背核尾侧部；DRI：中缝背核束间部。Bar=200μm
Fig. 3 The 5-HT positive neurons in the dorsal raphe nuclei
3.讨论
随着世界人口老龄化的进展，AD的发病率也在逐年增加。由于没有确切的治愈方法，AD对患者本人及其家属造成了沉重的思想压力和精神负担。研究报道，AD与老年抑郁症密切相关， 50%的AD 患者会出现抑郁症状[5-6]，而抑郁是AD发生发展的危险因素[6]。
研究发现，社会隔离可增加老年人抑郁症的发生率[7]，加重AD模型小鼠的学习记忆障碍和病理改变[8]。但社会隔离是否使AD模型小鼠产生抑郁样行为学和病理改变，抑郁在其中的作用尚有待研究。
由于受伦理等因素影响，直接在人体进行相关研究有明显的障碍。APP/PS1转基因鼠是在C57小鼠的基因组中插入人类AD患者的两个重要的变异基因APP和PS1,该鼠成功地模拟了AD患者的学习记忆功能障碍，脑内出现特征性的病理改变-老年斑，是目前世界公认的AD模型[9]。在AD的病因、病理机制和治疗等研究方面发挥了巨大的作用[10]。
本研究对老年APP小鼠进行为期3个月的社会隔离，然后进行旷场实验和强迫游泳实验。正常小鼠对陌生开阔场地既有畏惧感，又有强烈的好奇心和探索欲[11]。旷场实验基于此原理，常用来评判小鼠的自主运动和探索性等指标。本研究中SI组小鼠较GR组小鼠在旷场实验中，总休息时间增加，总运动距离减少，在中央区时间和穿越次数减少，提示其自主行动和对外界的空间探索行为明显减少，兴趣淡漠。强迫游泳实验模拟行为绝望，动物经历一段时间的挣扎后就会由积极状态（试图逃脱而不断游泳）变为消极状态（停止游泳，仅保持头部浮出水面），抑郁的动物出现消极状态早，不动时间就会增加[12]。本实验中，SI组小鼠较GR组小鼠游泳不动时间显著增加，说明其出现了抑郁样行为表现。因此，与GR组相比，SI组小鼠在旷场实验中自主探索性活动减少，强迫游泳实验中不动时间增加。说明社会隔离可产生抑郁样行为，与文献报道一致[13]。
5-HT作为一种神经递质，在中枢神经系统，参与多种行为、情绪活动,在应激反应中发挥着重要作用。脑内5-羟色胺能系统的异常是抑郁症患者的一个重要的神经病理改变，针对5-HT的抗抑郁治疗有显著的疗效[14]。中缝背核(dorsal raphe nuclei，DRN)位于脑干中缝附近，含有大量的5-羟色胺能神经元。根据其解剖、功能和纤维联系，中缝背核可分为数个亚群。其中，中缝背核的束间部（DRI）是含有抗抑郁样的5-羟色胺能神经元[15]。本实验中，GR和SI组小鼠中缝背核的各亚核均可观察到5-HT免疫阳性神经元。与GR组相比，SI组鼠中缝背核束间部5-HT免疫阳性神经元明显较少，突起较短或。说明社会隔离可使老年APP小鼠脑内的5-HT能系统受损。
AD和抑郁是严重影响老年人生活生存质量的疾病。但单纯的抑郁症或AD相对来说比较容易引起家属或周围人的注意，而AD合并的抑郁常常被忽视。随着我国空巢家庭、独居老人的增多，AD患者社会隔离现象也日益严重。本研究显示SI可使老年AD小鼠表现出抑郁样行为学和部分病理表现，因此，避免老年AD患者的社会隔离，可能对防止其抑郁的发生或发展，进而对AD病程有一定的作用。本实验观察了社会隔离对5-HT神经元在DRI中的变化，但其它部位（如杏仁核）、其它类型神经元（如DA神经元）及5-HT 受体等，是否参与其中，尚需进一步研究。
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论文作者:郑才峰1,2,惠建军1,2,冯改丰1
论文发表刊物:《心理医生》2017年29期
论文发表时间:2017/12/4
标签：小鼠论文; 中缝论文; 神经元论文; 抑郁论文; 游泳论文; 社会论文; 羟色胺论文; 《心理医生》2017年29期论文;