游大慧[1]2004年在《白菜型油菜EPSPs全长cDNA的克隆和原核表达》文中指出细菌、真菌、藻类、顶配位寄生虫和高等植物中有一个莽草酸途径，其第6步是由烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruv ylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPs)将烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)与莽草酸-3-磷酸(shikjmate-3-phosapha te，S3P)合成5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)，因此，EPSP合成酶在这些物种中就具有非常重要的作用。 根据本实验室未发表的白菜型油菜EPSPs 3’端序列，并根据诸葛菜和欧洲油菜的保守序列设计了两个引物5’-ATGGCGCAAGCTAGCAGA ATC-3’和5’-GCATTGACACGAACAGGAGGAC-3’用RT-PCR方法从白菜型油菜中克隆出了长630bp的EPSPs 5'cDNA，与其3’cDNA拼接起来得到EPSPs的全长cDNA，共有1726个碱基，其中开放阅读框长1545bp，编码514个氨基酸。将白菜型油菜EPSP合成酶的cDNA序列与GenBank上的8个序列比对，发现它与欧洲油菜的同源性最高，为93％，与诸葛菜为92％，与拟南芥为88％，与西红柿和矮牵牛为68％，与烟草为67％，与华九头狮子草为65％，与水稻仅为64％。因GenBank中的牛筋和玉米都只有部分cDNA序列，因此未将它们列入比对。从EPSPs的cDNA序列来看，白菜型油菜与欧洲油菜的亲缘关系最近，其次是它的近缘种诸葛菜，而与单子叶植物水稻的分支较早，这些结果符合传统的形态学分类的结论。将其推导蛋白质序列与上述8种植物的氨基酸做同源性比对，发现它与欧洲油菜和诸葛菜EPSPS的同源性都为95%，与拟南芥的为92%，与西红柿74%，与烟草73%，与华九头狮子草和矮牵牛的为72%，与水稻的同源性最低，为71%。 设计一对引物:5’一CGGAATTCATGGCGCAAGCTAGCAGAATC一3’和5’一TTAGTGCTTTGTGATACTTTCAAGGAC一3’，用PCR方法将白菜型油菜EPSPs的编码区扩增出来后插入到改造自Pharmacia公司的pGEX一ZT的表达载体GTK中，在大肠杆菌OHSQ中用工PTG诱导成功地表达了EPSPs和谷胧营肤一S一转移酶(GST)的融合蛋白质EPSPs--GST。试验发现，用0.lmM IPTG诱导的效果优于0.3InM、0.5耐、IlnM的IPTG的效果;37℃的培养温度比30℃的培养温度表达效率高;培养1一2小时时的表达效率最高，超过2小时则表达量下降。另外，融合蛋白的表达效率低于GST的表达效率，原因有待分析。关键词:EPS尸合成酶白菜型油菜RT一PCR原核表达
于海涛[2]2012年在《抗草甘膦真菌的分离及EPSPS基因克隆与表达研究》文中提出草甘膦是一种高效、低毒、广谱、内吸的非选择性灭生除草剂。它于1974年在美国被注册登记,是全世界除草剂消费量最大的品种之一。草甘膦能防除绝大多数一年生及多年生杂草,但由于其非选择性,在杀死杂草的同时对农作物也具有毒害作用。而提高作物对草甘膦的抗性,有利于草甘膦在农业生产中的应用并降低生产成本。因此,抗除草剂基因的发掘与利用己成为当今生物基因工程领域研究的重点。从抗除草剂微生物中分离抗性基因是最主要的途径。从受除草剂极端污染的土壤中筛选抗除草剂菌株是一种有效的方法。本研究从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选到一株高抗草甘膦的真菌,并对其进行了形态学鉴定、生理生化特性测定及18S rRNA分子鉴定。利用SMARTer技术构建了菌株的全长cDNA文库。以抗草甘膦菌株假丝酵母菌TY-JM(Candida palmioleophila)和黄曲霉TZ1985(Aspergillus flavus)为材料,首次从假丝酵母与黄曲霉中分离得到EPSPS基因,并将其转化大肠杆菌验证其具有抗草甘膦功能,国内外未见报道。期望能为转基因抗除草剂作物新品种的培育提供新的基因资源。主要研究结果如下：1.利用瓶培养富集技术,从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选到一株抗草甘膦浓度高达900mmol/L的真菌,命名为TY-JM。结合形态学观察、生理生化特性及18S rRNA序列分析,TY-JM被鉴定为假丝酵母菌Candida palmioleophila.形态学特征和生理生化特性与前人研究结果一致,18S rRNA系统进化分析表明其与假丝酵母同源性高达99%,序列上传至GenBank登录号为JN656713。2.以菌株TY-JM总RNA为模板,利用Clontech公司CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了TY-JM的cDNA文库,并对文库质量进行了鉴定。原始文库滴度为2.58×106cfu/ml,文库库容为2.58×106cfu,扩增后滴度为3.42×109cfu/ml,重组率97.6%,文库插入片段范围为500bp-3kb,主要集中在1kb附近,说明该文库cDNA片段的序列比较完整,文库质量符合标准。3.通过比较基因组学的方法,分离得到了假丝酵母TY-JM和黄曲霉TZ1985的EPSPS蛋白编码序列。编码序列长度分别为1311bp和1353bp,分别编码436个氨基酸和450个氨基酸,理论分子量分别为46kDa和48kDa,等电点分别为5.77和6.04。TY-EPSPS(TY-JM的EPSPS)和TZ-EPSPS(TZ1985的EPSPS)基因推导的氨基酸序列经NCBI Protein BLAST程序分析表明,TY-EPSPS基因与热带假丝酵母、杜氏假丝酵母和白假丝酵母等具有80%的序列一致性；与核盘菌、棒曲霉具有66%的序列一致性,TZ-EPSPS基因与烟曲霉、棒曲霉、黑曲霉、白曲霉和土曲霉具有90%的序列一致性；与杜氏假丝酵母、白假丝酵母和热带假丝酵母具有68%的序列一致性。采用MIEGA4.0软件分析TY-EPSPS和TZ-EPSPS基因与其它种的EPSPS的进化关系,结果表明,TY-EPSPS和TZ-EPSPS均与真菌的EPSPS亲缘关系较近,而与植物和细菌的(?)PSPS亲缘关系较远。其中TY-EPSPS与酵母属亲缘关系最近,TZ-EPSPS与曲霉属的亲缘关系最近。4.将TY-EPSPS和T.Z-EPSPS连接pET-30a载体后转入大肠杆菌BL21(DE3)后,使大肠杆菌对草甘膦的抗性从原来的50mmol/L提高到了75mmol/L,高于空质粒阴性对照。说明重组质粒转化大肠杆菌后在其体内成功进行复制表达,提高了大肠杆菌对草甘膦的抗性。
陈洁[3]2016年在《甘蓝型油菜WAX INDUCER1/SHINE1在高渗透胁迫中的作用及水稻CLCc3基因克隆》文中研究表明蜡脂由长链脂肪酸及其衍生物组成,主要分布于植物表面,在减少水分流失、抵御病虫侵害等方面起着重要的作用,是植物适应不良环境和生长发育过程中必不可少的重要成分。油菜作物在生长期间经常遇到干旱、盐胁迫、涝害和病菌侵害。植株表面的蜡质具有多重保护功效,在抗逆育种方面具有重要意义。然而,目前有关植物蜡质合成代谢的调控研究主要以模式植物拟南芥居多,在油菜方面相对较少。本研究首先分析了甘蓝型油菜WAX INDUCER1/SHINE1(BnWIN1)基因的表达模式,表明BnWIN1在不同时期和不同组织器官均可检测到相对较高的表达量,且在成熟时期的茎、花、花蕾、叶片和角果中表达量较高,而在根部表达量较低。同时从甘蓝型油菜中克隆超表达BnWIN1,表明超表达BnWIN1可促进叶片表皮在盐胁迫下积累较多的蜡质,从而增强植株的耐盐性,且叶片的叶绿素含量显着高于野生型,植株生长比野生型旺盛。此外,由于叶片表面蜡质的疏水保护作用也增强了植株的耐涝性,超表达植株在雨后田间过度积水的条件下生长胜于野生型、分支较多,后期存活率也较高。这些结果表明BnWIN1不仅正调控植株的耐盐性,也有助于植株的耐涝性。此外,WIN1不仅参与蜡质合成代谢,而且在正常生长条件下BnWIN1超表达植株成熟种子的油脂含量显着高于野生型,说明BnWIN1在正常条件下也参与正调控油脂合成代谢,而胁迫下超表达种子含油量与野生型相当,表明盐胁迫下的蜡质累积并没有消减种子油脂的累积,却显着提高植株的耐盐性和生物产量。通过BnWIN1-GFP荧光融合蛋白的观察发现BnWIN1定位于细胞核,表明了 BnWIIN1可能作为转录因子调控脂质合成代谢相关基因的表达。因此,BnWIN1对油菜作物遗传改良具有应用前景。此外,本研究还初步分析了水稻中氯离子通道(Chloride Channel c3,CLCc)蛋白CLCc3。分离鉴定了 clcc3突变体,同时构建了 CLCc3的超表达、GFP和GUS载体,并获得转基因植株;通过GUS报告基因和real time PCR分析了CLCc3的表达谱,表明CLCc3在嫩叶及成熟期的根和叶片中表达量相对较高。
参考文献：
[1]. 白菜型油菜EPSPs全长cDNA的克隆和原核表达[D]. 游大慧. 四川大学. 2004
[2]. 抗草甘膦真菌的分离及EPSPS基因克隆与表达研究[D]. 于海涛. 东北农业大学. 2012
[3]. 甘蓝型油菜WAX INDUCER1/SHINE1在高渗透胁迫中的作用及水稻CLCc3基因克隆[D]. 陈洁. 华中农业大学. 2016