【摘要】目的：通过检测宫颈鳞癌细胞在龙葵、顺铂及两者联合作用下细胞凋亡及ABCG2mRNA的表达，探讨龙葵抗宫颈鳞癌的作用及机制。方法：选取临床及病理确诊的宫颈鳞癌组织60例，常规培养,取对数生长期细胞，随机分为4组，分别加入不同药物：（1）空白对照组；（2）龙葵组；（3）顺铂组；（4）龙葵与顺铂联合应用组。流式细胞术检测各组细胞凋亡率，观察各组药物对宫颈鳞癌细胞凋亡的影响；应用RT-PCR 方法检测以上各组中宫颈鳞癌细胞ABCG2 mRNA的含量，观察各组药物对宫颈鳞癌细胞ABCG2mRNA的表达的影响。结果：（1）流式细胞术结果显示不同药物作用后宫颈鳞癌细胞凋亡率龙葵<顺铂<两者联合；（2）单独应用顺铂宫颈鳞癌细胞ABCG2mRNA表达无明显变化，龙葵全草水煎剂单独应用及其与顺铂联合用药均可使ABCG2mRNA表达下降。结论：龙葵可增加人宫颈鳞癌细胞凋亡，可能与抑制ABCG2mRNA的表达有关,且龙葵能够增加宫颈鳞癌细胞对顺铂的敏感性，减轻肿瘤细胞对顺铂的耐药性。
【关键词】宫颈鳞癌；龙葵；ABCG2mRNA； RT-PCR
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）26-0084-03
多项研究表明ABCG2在多种肿瘤的多药耐药中起着重要作用，而肿瘤的多药耐药是引起化疗失败及肿瘤复发的重要原因之一。龙葵是一种常见的传统中药，有临床报道显示，应用龙葵全草或果实水煎液及其复方制剂治疗肝癌、肺癌、宫颈癌、食道癌、乳腺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤，取得较好疗效[1]。本研究旨在通过龙葵对宫颈鳞癌细胞ABCG2表达的影响，探讨龙葵抗作用机制，为临床治疗提供实验依据。
1.材料与方法
1.实验方法
1.1 药物的粗提和制备
1.1.1龙葵全草水煎剂的制备：龙葵全草1000g粉碎后用水煎煮两次，时间分别为2h,1.5h，过滤、合并水煎液，减压浓缩，得水提液，定容至浓度为1.0g/ml(以生药计算)，灭菌后4℃冰箱保存，使用时以无菌的磷酸盐缓冲液( PBS) 稀释至所需浓度。
1.1.2顺铂配制液：于100ml生理盐水中加入20mg的顺铂,使其充分完全溶解,配制浓度为0.2mg/ml，实验过程中新鲜配制。
1.2 细胞培养
选取临床及病理确诊的宫颈鳞癌组织60例，用含有10%灭活新生小牛血清,100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基在37℃，饱和湿度,5%CO2条件的培养箱中常规培养,取对数生长期细胞，用于实验。
1.3 药物干预分组
将宫颈鳞细胞接种于96孔板，细胞附壁后分成按药物干预分以下几组：（1）对照组，生理盐水；（2）单用龙葵（0.1g/ml，以生药计算）组；（3）单用顺铂组(0.2mg/ml)；（4）龙葵与顺铂联合应用（龙葵0.1g/ml+顺铂0.2mg/ml）组,培养 24h。
1.4 流式细胞术检测
宫颈鳞癌细胞凋亡率：分别取药物干预后培养24h细胞，细胞仪0.25%胰酶消化，PBS缓冲液洗2遍后，加碘化丙锭染液 100ul，避光作用30分钟后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组均设3各复孔，实验重复3次。
1.5 RT-PCR 方法检测
宫颈鳞癌细胞ABCG2mRNA表达量：分别取药物干预后培养24h细胞，用4℃预冷的PBS缓冲液洗2遍细胞后加入Trizol试剂1ml，常规一步法提取总RNA。RT-PCR方法采用两步法（1），ABCG2上游引物5′-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3′，下游引物5′-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3′。扩增片段280bp.GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTG-3′，扩增片段452bp。扩增条件为94℃5min，94℃30s，63.1℃30s，72℃30s，共30个循环，72℃10min。对扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像分析仪下成像，用Gel-proAnayzer3.1软件分析扩增产物的光密度（optical density，OD），计算ABCG2 OD值与 GAPDH OD值的比值，对 ABCG2mRNA 表达强度进行光密度半定量分析。
1.6 统计学方法
计数资料计算阳性率，计量资料采用(x-±s)表示。阳性率之间的比较采用χ2检验及Fisher确切概率计算法；均数比较采用t检验、单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法，所有统计学结果均采用SPSS11.5软件进行处理。当P＜0.05时，认为有统计学意义。
2.结果
2.1 流式细胞术检测龙葵与顺铂对宫颈鳞癌细胞凋亡率的影响
流式细胞仪分析显示，顺铂单独作用24h后，宫颈鳞癌细胞的凋亡率与对照组相比显著增高（P＜0.05）；龙葵单独作用 24h后，宫颈鳞癌细胞的凋亡率同对照组相比差异无显著性（P＞0.05）；龙葵与顺铂联合作用24h后，宫颈鳞癌细胞的凋亡率同单独应用顺铂组比较显著增高（P＜0.01）见表1。
表1 不同药物对宫颈鳞癌细胞凋亡率的影响[(x-±s)%]
3.讨论
宫颈癌是女性最严重的恶性肿瘤之一，严重威胁人们的健康。顺铂是常用的宫颈鳞癌化疗药物，为细胞周期非特异性药物，进入细胞后，抑制DNA复制和转录，导致DNA断裂和错码，抑制细胞有丝分裂。近年研究显示顺铂治疗过程中，随着用药时间的延长，对肿瘤的抑制作用会逐渐减弱，这种肿瘤耐药与ABCG2的表达有关。ABCG2主要参与多种分子的跨膜转运，它是一种能量依赖性转运蛋白，越来越多的研究表明ABCG2可以通过结合和水解ATP将抗肿瘤药物等底物排出细胞而介导肿瘤多药耐药(MDR) [2]。已有大量文献[3-6]报道ABCG2参与多种肿瘤细胞多药耐药机制，甚至被作为肿瘤干细胞的标志，用来筛选肿瘤干细胞。
随着近年对中药研究的深入，一些传统中药在抗肿瘤方面的作用日益受到重视。龙葵是一种常见的传统中药，全草均能入药，具清热解毒、活血散瘀、利水消肿、止咳祛痰之功[7]。有临床报道显示，应用龙葵全草或果实水煎液及其复方制剂治疗肝癌、肺癌、宫颈癌、食道癌、乳腺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤，取得较好疗效[1]。
本研究显示龙葵全草水煎剂单独应用使宫颈癌细胞的凋亡率无显著改变，但其联合顺铂应用使宫颈鳞癌细胞的凋亡率较单独应用顺铂明显升高，提示两者在抗宫颈鳞癌方面具有协同作用。RT-PCR方法检测不同用药情况下宫颈鳞癌细胞ABCG2mRNA表达情况，显示龙葵全草水煎剂单独应用及与顺铂联合应用均可使ABCG2mRNA表达下降。结合鳞癌细胞凋亡率及ABCG2mRNA的表达两者结果，推测龙葵可能通过影响ABCG2mRNA的表达，减少ABCG2蛋白合成，减少抗癌药顺铂的泵出，从而提高顺铂的抗癌的作用，减轻肿瘤对化疗药物的耐药性。
综上，本研究通过多种实验方法探讨了龙葵在宫颈鳞癌化疗中的应用及作用机制，为妇科肿瘤领域研究提供新的实验参考和技术支持。今后的研究中，还需要对龙葵使用的浓度和时间，方法等做更进一步的研究。
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论文作者:田玉燕,鉴凤梅,袁征（通讯作者）,赵如同
论文发表刊物:《心理医生》2017年26期
论文发表时间:2017/10/30
标签：宫颈论文; 癌细胞论文; 龙葵论文; 细胞论文; 药物论文; 凋亡论文; 肿瘤论文; 《心理医生》2017年26期论文;