1.昆明医科大学第四附属医院 云南省第二人民医院 650021；
2.昆明医科大学第四附属医院 云南省第二人民医院 血管外科中心 650021
摘要：目的：探讨125I粒子对结直肠癌SFRP2及P16基因甲基化的作用。方法：以人结直肠癌HCT-8细胞的荷瘤雄性BLAB/c-nu/nu裸小鼠作为动物模型，单纯随机化将荷瘤裸小鼠分成对照组和实验组（每组25只），对照组植入空白粒子，实验组植入剂量为14.8MBq的125I粒子，植入后第20天处死裸鼠。DNA提取，亚硫酸氢钠修饰，PCR扩增反应及检测SFRP2及P16基因甲基化程度。结果：125I照射后SFPR2基因甲基化水平呈下降趋势，实验组与对照组甲基化指数比较：实验组Mtl（0.67±0.05）与对照组Mtl（0.84±0.07）二者差异采用student，t检验，P＜0.05；对照组标本中有14例（56%）标本中检测出P16基因启动子区甲基化，实验组标本中有10例（40%）标本中检测出P16基因启动子区甲基化。实验组和对照组肿瘤标本P16基因启动子区甲基化阳性率存在明显的差异性（P<0.05）。结论：125I粒子诱导的抑癌基因启动子甲基化的下调，从而抑制了肿瘤细胞的增殖生长，为125I粒子应用临床组织间植入治疗肿瘤提供了有力证据。
关键词：125I粒子；结直肠癌；SFRP2；P16；甲基化
随着社会经济的发展以及生活方式和饮食习惯的改变，结直肠癌在我国发病率呈逐年上升趋势，自20世纪70年代起年增长率达4%。目前在美国结直肠癌已成为导致患者癌性死亡的第三大疾病[1]，患者生存期明显缩短且生活质量不高。近年来125I粒子组织间植入内放疗对肿瘤的良好治疗效果国内外已有报道，成为治疗大肠癌的重要手段[2，3]。目前研究已证实结直肠癌的发生、发展过程中伴有多个抑癌基因启动子的CpG岛高甲基化，启动子的高甲基化可导致抑癌基因表达下调或沉默[4，5]。然而125I是否对基因甲基化作用有影响目前尚未见类似报道，本实验通过125I作用结直肠癌荷瘤鼠，以此检测其SFRP2及P16基因甲基化改变情况，现将相关实验报道如下。
材料与方法
一、材料
1.实验荷瘤鼠：雄性Balb/c-nu/nu裸鼠50只，6～8周鼠龄，体重18～20g，在SPF条件下接种人结直肠癌hct-8细胞于裸鼠右侧腋窝皮下，购于北京肿瘤研究所，购入时细胞已接种于裸鼠右侧腋窝皮下，肿瘤直径约0.5cm±0.3。购入后在SPF条件下饲养。
2.125I放射性粒子：125I粒子25粒（放射性活度：14.8MBq），空载粒子（0 MBq）25粒，购于上海欣科医药有限公司（销售编号：BT17071）。
3.主要试剂：肿瘤组织DNA提取：使用AXYGEN公司试剂盒提取（美国）基因组DNA亚硫酸氢钠修饰，使用Millipore 公司试剂盒（德国）处理，PCR产物纯化试剂盒（全式金公司）琼脂糖 DNA Marker
4.甲基化检测设备：PyromarkID（QIAGEN公司）、PCR仪（BIO-RAD）离心机（eppendorf）
5.引物设计：SFRP2
参照文献[6]在http//www.urogene.org/methprimer设计引物。合成序列为：5/ -GTTTTTTTTATTTTTTAGATTTGTATAAAAAAGGTTAAGAAAATTTTGGTTGTGTTTTAGTAACGGTTTATTTTGTTTTTTCGGGTCGGAGTTTTTCGGAGTTGCGCGCGGGTTTGTAGCGTTTCGTTCGCGTTGTTTTTTCGGTGTTTCGTTTTTTCGCGTTTTAGTCGTCGGTTGTTAGTTTTTCGGGGTTTCGAGTCGTATTTAGCGAAGAGAGCGGGTTCGGGATAAGTTCGAATTTCGGTCGTTTCGTTTTTTTTCGGTTTCGTTTTTTTTGTTTTTTCGGGGTCGCGCGTTTACGATGTTGTAGGGTTTTGGTTCGTTGTTGTTGTTTTTTTTCGTTTCGTATTGTTGTTTGGGTTCGGCGCGCGGGTTTTTTTTTTTTGGTTAGTTCGATTTTTTTTATAAGCGTAGTAATTGTAAGTTTATTTTTGTTAATTTGTAGTTGTGTTACGGTATCGAATATTAGAATATGCGGTTGTTTAATTTGTTGGGTTACGAGATTATGAAGGAGGTGTTGGAGTAGGTCGGCGTTTGGAT-3/。其中待分析甲基化点为（粉色标记）：TTGTTTTTTCGGTGTTTCGTTTTTTCGCGTTTTAGTCGTCG，F引物（蓝色标记）为：GAAAATTTTGGTTGTGTTTTAGTAA，S引物（蓝色标记）为：GTTGTTAGTTTTT，待分析甲基化点为（粉色标记）：TTGTTTTTTCGGTGTTTCGTTTTTTCGCGTTTTAGTCGTCG，R引物（蓝色标记）为：GAGATTATGAAGGAGGTGTTGGAGT。
P16引物
参照文献[7]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成其序列为：野生型引物（P16-W）：5′-CAGAGGGTGGGGCGGACCCC，3′-CGGGCCGCGGCCGTGG，扩增产物片段长度为140bp。甲基化特异性引物（P16-M）：5′-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC，3′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA，扩张产物片段长度为150bp。非甲基化特异性引物（P16-U）：5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT，3′-CAACCCCAAACCACAACCATAA，扩张引物片段长度为151bp。
二、方法
1.125I粒子的植入：按计算机随机分为两组并植入粒子，对照组：植入空载粒子（0 MBq）；实验组：植入125I粒子（放射性活度：14.8MBq）。植入后继续饲养。第20天时以颈椎脱位法处死小鼠，取出皮下完整肿瘤，并称重（Wt）。以仔源为中心，取直径约1.5cm球形肿瘤组织实验用。并将所取组织迅速放入—80ºC保存备用。
2.组织DNA提取：用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒（AXYGEN）按操作说明提取组织DNA，所有提取DNA均用仪器（spectrophotometer）测量含量、A 260/A280值。
3.亚硫酸盐处理：用CpGenomeTMTurbo Bisulfite Modification Kit（Millipore）试剂盒处理，取10μLDNA液按操作进行，最终以30μLDNA Elution buffer 回收DNA.
4.PCR：用TransStart Taq DNA Polymerase体系酶。做30μL体系。DNA10μL、F引物2μL、R引物2μL、10×TransStart Taq Bnffer 4μL、1.5mM dNTPs 2μL、DNA Polymerase 0.5μL、ddH2O 9.5μL.条件94ºC，5min；94ºC，30sec；56ºC，30sec；72ºC，30sec；72ºC，5min。循环35次，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果。
5.甲基化的检测：PCR产物20μL以PyromarkID96机器以及单链分离纯化试剂盒 PyroGold reagents（Biotage公司）检测甲基化，具体操作按仪器及试剂盒操作说明进行。
6.统计学出来方法：采用SPSS16.0软件，数据以±s表示。两组SFRP2基因甲基化指数差异用方差分t检验析，P<0.05为差异有统计学意义；两组标本P16基因甲基化发生率的差异性采用两样本率的X2检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、SFRP2基因
甲基化检测结果见图1
C1：C/TGAC/TGACTAAAAC/TGC/TGAAAAAAC/TGAAACACC/TGAAAAAACAA
图1 0.8mCi组SFRP2基因甲基化检测结果，黄色部分即为6个甲基化位点，C后百分率即代表该位点 的甲基化程度。甲基化指数（methylation index，Mtl）【8】即为6个位点的平均甲基化率，如上图甲基化指数计算（Mtl=54.4%+54.6%+60.1%+61.2%+57.4%+58.5%/6）
二、P16基因
1.MSP分析结果
对实验组和对照组肿瘤标本用p16基因甲基化引物p16M和p16基因非甲基化引物p16U行组织修饰后DNA进行扩增，实验组肿瘤标本有10例p16M扩增为阳性，15例p16U扩增为阳性。对照组肿瘤标本有14例p16M扩增为阳性，11例扩增为阴性。MSP电泳并照相，结果如图所示。
2.统计学结果分析
表一 实验组和对照组P16基因甲基化检测结果
1：人结肠正常组织 2：对照组肿瘤组织 3：实验组肿瘤组织 U：非甲基化特异性扩增产物引物（151bp）M：甲基化特异性扩增产物（150bp）
讨论
结直肠癌的发生、发展是一个多因素多步骤的过程，其发生过程中都伴有明显的遗传学改变，但所有的结肠癌的发生都不能用遗传学的改变完整的解释。随着对表观遗传学研究的深入，DNA甲基化在结肠癌的发生，发展中同样起着非常重要的作用，并和遗传学的改变共同作用导致肿瘤发生[9]。SFRP2与P16基因作为抑癌基因参与细胞周期的调控，其适度表达可抑制细胞的分裂生长[10]。而抑癌基因高甲基化可导致肿瘤的发生。
125I粒子目前已被用于临床前列腺癌、胰腺癌、脑癌以及结直肠癌等的治疗，其主要通过释放γ射线，能量约35.5KeV，有效照射半径约1.7cm，为低剂量率照射治疗。125I粒子治疗肿瘤的主要作用是通过射线破坏DNA双链结构，致细胞凋亡[3]。
本实验拟探讨125I粒子对结直肠癌SFRP2及P16基因甲基化的作用。使用以125I作为γ射线源作用肿瘤细胞，并且定量检测了SFRP2基因启动子甲基化水平改变，发现经125I照射后SFPR2基因甲基化水平呈下降趋势。实验组与对照组甲基化指数比较：实验组Mtl（0.67±0.05）与对照组Mtl（0.84±0.07）二者差异采用student，t检验，P＜0.05；同时，用MSP方法检测实验组和对照组肿瘤标本P16基因启动子区CpG岛甲基化状态，发现实验组甲基化率（40%）明显低于对照组甲基化率（56%）。实验组和对照组肿瘤标本P16基因启动子区甲基化阳性率存在明显的差异性（P<0.05）。说明125I粒子放射治疗后可使肿瘤组织p16基因甲基化率有一定的降低，对肿瘤有抑制作用。证实了预期结果，125I粒子诱导的抑癌基因启动子甲基化的下调，从而抑制了肿瘤细胞的增殖生长，同时在实验中还发现部分植入125I粒子和未植入125I粒子肿瘤组织可同时有甲基化和非甲基化扩增产物，这种部分甲基化状态可能是由于肿瘤中存在不同的细胞亚群或者肿瘤中有正常的组织或者是由于等位基因中一个甲基化而另外一个未甲基化形成半甲基化状态。
125I粒子下调抑癌基因甲基化水平的机制目前不是很明确。可能的机制主要集中于两点，γ射线直接对DNA双链的破坏；另一个为射线使得DNA甲基化转移酶的表达下降。DNA双链的断裂是γ射线射线对DNA的主要损伤形式，在DNA损伤时伴随着修复系统的启动。断裂的DNA可通过重组及部分片段切除达到修复，然而在上述修复的过程中原本甲基化的胞嘧啶（mC）可能同时被切除，从而导致甲基化的胞嘧啶减少，启动子CpG岛内甲基化的程度降低。另一面甲基化的生成，维持需要甲基转移酶的参与，若γ射线导致相关酶表达减少同样也可以至低甲基化，Jin-xia Ma等[11]以125I粒子照射人胰腺癌SW-1990细胞，总共给以4Gy剂量照射后DNMT1及DNMT3b蛋白表达下降。同样Raiche[12]等以X射线进行的相关实验亦证实甲基化的降低伴随着DNMTs的表达下调。
综上述目前γ射线射线对基因甲基化的影响实验多为体外细胞试验，然而体外细胞生长环境与体内有所差异，并且125I应用临床为永久植入其累计放射能量亦较试验所给以剂量不同，故上述实验是否能证实反映体内基因甲基化改变尚需进一步验证。目前125I粒子对肿瘤的作用主要为导致DNA键的断裂以及细胞的凋亡，该实验首次以定量检测DNA甲基化改变的方式研究了125I粒子诱导的抑癌基因启动子甲基化的下调。这为125I应用临床组织间植入治疗肿瘤提供了有力证据。由于该技术在临床应用时间短，其治疗肿瘤的同时与分子生物学的关系尚需我们不断地完善，更好的指导临床治疗。
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基金项目：云南省自然科学基金（2010ZC221）。
论文作者:章治平1,李晓刚1,陆平2,褚焱1,李,波1,牛
论文发表刊物:《健康世界》2015年4期
论文发表时间:2015/10/26
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