张震[1]2010年在《兔骨髓间充质干细胞构建异种组织工程化尿道修复兔尿道缺损》文中研究指明研究背景泌尿生殖系统先天畸形、后天损伤或因其他疾病造成的尿道缺损或狭窄的手术治疗是泌尿外科医生努力探索的主题之一,但尿道替代材料的缺乏一直是困扰泌尿外科医生最大的难题。组织工程学的兴起为泌尿生殖系统的修复重建开辟了一个崭新的道路。近几年来很多学者在组织工程尿道方面已经取得显着成果。脱细胞小肠粘膜基质,脱细胞膀胱粘膜基质,脱细胞脐静脉基质,脱细胞人羊膜基质等已被用于尿道重建研究,并已经取得一定效果,充分说明利用脱细胞组织基质再造尿道有其可行性。同时随着人们对干细胞基础医学和临床医学研究的不断深入,应用干细胞修复组织器官正逐渐成为现实。目前国内外尚未见到有关以兔骨髓间充质干细胞为种子细胞,脱细胞猪尿道基质为支架材料构建组织工程化尿道修复兔尿道缺损的文献报道。研究目的探索以兔自身的骨髓间充质干细胞为种子细胞构建异种组织工程化尿道修复兔尿道缺损的可行性。材料与方法1.制备脱细胞猪尿道基质,并行组织学检查观察脱细胞效果。2.分离兔骨髓间充质干细胞,鉴定其表型,体外培养增殖后种植于脱细胞猪尿道基质上。3.60只兔随机均分为实验组、对照组,实验组用种植有自体骨髓间充质干细胞的脱细胞猪尿道基质修复约2cm长兔尿道缺损,对照组仅用脱细胞猪尿道基质修复。4.术后1,2,4,8,16,24周分别切取实验组和对照组再造尿道标本,行组织学检查,比较两组差异。5.术后24周两组分别行逆行尿道造影及尿动力检查,比较两组差异。结果1.所制备脱细胞猪尿道基质大体观察白色半透明,质地柔软,有一定的弹性及韧性,倒置显微镜下观察呈网状结构,镜下未见细胞成份。分离培养的细胞表型为CD45阴性,CD166,CD29,CD105阳性,符合骨髓间充质干细胞特征。2.术后24周再造尿道组织学检查结果：实验组尿道腔面光滑,具有和正常尿道类似的组织结构。对照组血管和平滑肌形成较少,有较多纤维瘢痕,再造尿道腔面不如实验组光滑。3.实验组行尿动力检查的术后最大尿道压与术前比较,差异无统计学意义(P>0.05),对照组的术后最大尿道压与术前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.以兔自身的骨髓间充质干细胞为种子细胞,脱细胞猪尿道基质为支架,构建组织工程化尿道,移植修复兔尿道缺损,能够使尿瘘及尿道狭窄发生的机率降低,术后能获得良好的粘膜覆盖,可形成类似于正常尿道的组织结构。2.以骨髓间充质干细胞为种子细胞,脱细胞猪尿道基质为支架,构建组织工程化尿道,材料来源相对充足,手术简单,创伤小,是一个良好的、值得进一步研究的、具有临床应用前景的尿道重建的替代材料。
李泸平[2]2016年在《组织工程化尿道构建及尿道缺损修复的实验性研究》文中研究指明研究背景及目的先天性尿道下裂以及尿道外伤、肿瘤、尿道狭窄等疾病的发生目前有逐年增高趋势,其有效解决办法还依赖于外科手术治疗。传统的外科手术处理,多应用自身包皮、阴囊组织原位修复,或者应用颊粘膜、膀胱粘膜等自体组织移植修复处理。但明显的缺陷就是容易并发术后尿道瘘、尿道再狭窄、尿道结石等,且对于再次手术、尿道缺损较长的病例,容易因自身修复材料不足而令临床医生产生治疗上的无奈。随着医学技术和相关学科的发展,组织工程学首先在骨科及皮肤科等领域出现并取得了一定的研究进展。这也为目前面临的尿道修复材料来源难题提供了一种全新的解决思路。目前国内外学者已经进行了该领域的实验性研究及少部分临床应用的尝试,取得了一定成就,也不同程度地暴露出了一些问题和弊端。特别是在种子细胞的选择方面,仍存在不少争议。研究发现,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,可定向分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的成骨细胞和脂肪细胞、内胚层的肝细胞等。BMSCs具备与ECM的良好生物相容性,在组织工程研究中得到了广泛的应用,并首先在组织工程骨组织的构建试验中取得了很大的成功。另有研究证实,干细胞与尿道上皮细胞的直接接触可以诱导其向尿路上皮定向分化,但具体机制尚不明确。BMSCs的体外分离与培养主要采用以下几种方式:(1)贴壁筛选法;(2)密度梯度离心法;(3)免疫磁珠筛选法;(4)流式细胞仪分选法。尿路上皮细胞是较难培养的上皮细胞之一,既往人们曾经认为尿路上皮细胞会自然衰老凋亡,正常的尿路上皮细胞可以在体外存活,但时间短,很难在体外培养、传代,且无证据表明细胞有数量的增加。随着细胞培养技术的不断完善和细胞培养条件的优化,尿路上皮细胞的培养研究逐步展开并不断获得成功。动物实验表明,膀胱来源的尿路上皮细胞可在体外培养传代至3~12代。国外的研究随后证实,人膀胱移行上皮细胞的体外培养方面的研究也获得了成功。膀胱来源的尿路上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。本实验拟通过应用干细胞(骨髓间充质干细胞)和成体细胞(尿路上皮细胞)联合脱细胞基质材料的体外培养,并应用于长段尿道缺损的修复研究。通过比较实验结果,以期寻找更为理想的种子细胞,进一步推动尿道组织工程的发展。方法1.种子细胞的制备、筛选及鉴定1.1骨髓间充质干细胞的制备、筛选与鉴定选取雄性新西兰白兔为实验对象,抽取双下肢骨髓,利用密度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增、传代。应用流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD44的表达,鉴定确认为骨髓间充质干细胞。将其作为实验用种子细胞之一。1.2尿路上皮细胞的制备、筛选与鉴定以雄性新西兰白兔为实验动物,机械分离法及酶消化法分离提取膀胱黏膜组织中的尿路上皮细胞,进行体外培养、传代。应用免疫荧光法鉴定尿路上皮细胞表面特异性表达因子及标记物——细胞角蛋白-18(CK-18)与和尿溶蛋白-2(UP2)的表达水平,鉴定确认尿路上皮细胞,并作为另外一种实验用种子细胞。2.种子细胞—脱细胞基质材料的复合培养与标记2.1骨髓间充质干细胞(BMSC)—脱细胞基质的制备选取培养传代后已接近90%融合的第4代BMSC,加入含有0.2%5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)的无血清低糖DMEM溶液培养标记,然后应用移液器将制备好的细胞悬液均匀滴加到脱细胞基质粘膜面。联合培养制备复合材料备用。2.2尿路上皮细胞—脱细胞基质的制备选取传代培养后已接近90%融合的第4代尿路上皮细胞备用,0.2%5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)共同培养标记。应用移液器将制备好的细胞悬液均匀滴加到脱细胞基质粘膜面,联合培养制备复合材料备用。3.尿道缺损模型的制作与修复3.1尿道缺损模型的制作全麻下游离雄性新西兰白兔尿道,切除中段尿道长约3cm,人工制作尿道缺损动物模型,备用。3.2尿道缺损的修复56只雄性成年新西兰兔,应用随机数字法分组,分为4组,每组14只。具体分组及修复操作如下:A组(无细胞对照组)即:单纯应用异种脱细胞基质修复组。应用空白脱细胞基质材料直接制作管状尿道,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建;B组(假手术组)即:假手术对照组。尿道缺损模型制作成功后,将尿道缺损后的两个尿道断端直接行端端吻合,恢复尿道连续性;C组(BMSCs组)即:BMSC复合异种脱细胞基质手术修复组。将BMSCs联合脱细胞基质材料联合培养后,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建,作为实验组之一;D组(尿路上皮细胞组)即:为尿路上皮细胞复合脱细胞基质手术修复组。将尿路上皮细胞联合脱细胞基质材料联合培养后,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建,作为另一实验组。结果1.BMSCs呈贴壁式生长,由短梭形逐渐演变为长梭形外观。应用流式细胞仪检测传代至第4代的BMSC,可见其表达CD44阳性,而CD34的表达则为阴性,符合间充质干细胞特征;2.尿路上皮细胞呈贴壁式生长,呈圆形、类圆形外观,逐渐融合形成铺路石样外观。免疫荧光实验结果显示所培养的细胞表达CK-18与UP2呈阳性;3.BMSCs及尿路上皮细胞接种后脱细胞基质材料透明度降低,细胞均呈集落样生长,形成网状结构。4.四组试验动物均全部存活,B组修复后恢复最为顺利,A组修复效果最差,C、D组实验动物观察至术后12周修复效果相当,经统计学检验处理,两组差异无统计学意义。结论1.成功分离获得BMSCs,操作简单且来源丰富,可作为尿道组织工程种子细胞备选;2.成功分离获得尿路上皮细胞,细胞数量多,浓度高,可作为尿道组织工程种子细胞备选;3.BMSCs及尿路上皮细胞均能在脱细胞基质材料上贴附生长,形成立体网状结构,可以作为尿道缺损替代修复材料;4.`BMSCs和尿路上皮细胞均可作为种子细胞应用于组织工程化尿道的构建和长段尿道缺损的修复。
翟弘峰[3]2001年在《组织工程化尿道的实验研究》文中认为对于尿道缺损、后尿道狭窄，临床上常以皮肤(粘膜)游离移植或局部带蒂皮瓣转移修复，但皮肤(粘膜)游离移植常因挛缩导致尿道狭窄，尿瘘发生率亦较高；局部带蒂皮瓣转移则常致局部臃肿，形态不佳，患者及家属难以接受。况且，自体组织移植是以牺牲正常组织为代价的“以手术创伤修复组织缺损”的治疗模式，既增加了新的手术创伤，又增加了手术并发症的机率，且自体组织来源有限，限制了其临床应用。 随着生命科学、材料科学以及相关物理、化学学科的发展，人们提出了一个新的概念——组织工程。它是应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复损伤组织和改善其功能的具有活性的生物替代物的一门科学。虽然组织工程概念的提出只有十几年的时间，但它已得到了异常迅猛的发展，在许多方面已取得重大突破。 组织工程为整形外科医生解决临床问题提供了全新的思维模式。本实验研究、探讨哺乳类动物尿道粘膜上皮细胞的体外培养技术和方法，从仿生学角度出发，探索、制备可生物降解的胶原—壳聚糖复合材料支架，进而采用组织工程技术构建尿道。 实验中发现，以中性蛋白酶与胰蛋白酶联合消化尿道粘膜是比较理想的分离尿道粘膜上皮细胞的方法，并摸索出了获取细胞数量最多时的胰酶消化时间。采用此方法，成功地分离了新西兰幼兔、近交系Luis大鼠的尿道粘膜上皮细胞。 在国内首次报道了哺乳类动物尿道粘膜上皮细胞的体外培养技术和方法。分别采用以胶原为底物、以L-929细胞为滋养层、以胶原为底物同时以L-929细胞为滋养层的培养技术，在体外成功地培养了尿道粘膜上皮细胞，并进行了传代、冻存及复苏。对培养的尿道粘膜上皮细胞进行了HE染色、Giemsa染色、Feulgen染色、免疫组化染色，以透射电镜观察细胞超微结构，对培养的尿道粘膜上皮细胞进行了鉴定，并以流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成情况。整个上皮细胞生长期间无成纤维细胞混杂生长，均为单一的二倍体上皮细胞。细胞可传11～13代，成活50～60天。第9代前的细胞形态良好，与原代无明显区别。细胞间富含桥粒等上皮细胞的典型结构，且没有出现永生化及恶性变。据此，可以认为我们所培养的角化细胞具有干细胞的部
李永伟[4]2014年在《复合转基因EPCs的细胞—细胞外基质复合材料在修复长管状尿道缺损中的实验研究》文中研究说明目的：本文研究旨在利用组织工程学原理、细胞分子生物学技术和干细胞技术等,构建一种全新的、复合了包含有广谱抗微生物活性和促血管化作用的抗菌肽LL-37的转基因血管内皮祖细胞和尿路上皮细胞、平滑肌细胞等种子细胞的新型组织工程化尿道组织,从而探索利用该生物材料修复长段管状尿道缺损的可能性。对其中涉及的转基因技术,如慢病毒表达载体的构建、质粒表达的检测、慢病毒的包装及目的细胞的代感染等方法进行探讨,为以后可能的组织工程学技术联合转基因技术奠定基础。同时,鉴于本文涉及的泌尿系组织工程学常用种子细胞,如内皮祖细胞、尿路上皮细胞等,在分离、培养和鉴定等试验方法方面尚存较多争议,遂结合自身经验探讨循外周血途径高效获取内皮祖细胞,通过膀胱黏膜的移行上皮细胞转化培养尿路上皮细胞的方法。方法：(1)慢病毒的包装和病毒滴度的检测。(2)目的基因LL-37过表达慢病毒载体的构建,并进行超纯化的去内毒素抽提,使其具有较高的安全性,同时对构建的载体PGC-FU-LL-37表达情况进行检测。(3)抽取成年新西兰兔股静脉血液,通过密度梯度离心法获取足够量的单个核细胞,并采用碱性成纤维细胞因子、血管内皮细胞生长因子等活性成分诱导单个核细胞向内皮祖细胞转化。(4)制备好的慢病毒转染目的细胞——外周血途径获取的内皮祖细胞,并通过Western Blot等方法对表达情况进行检测。(5)切取成年新西兰兔膀胱组织,剥离黏膜层用于制备尿路上皮细胞,从肌层取活检制备尿路平滑肌细胞,剩余组织用于制备膜片状膀胱脱细胞基质。(6)将制备好的稳定传代的尿路上皮细胞、平滑肌细胞分别种植在膀胱脱细胞基质两侧,待融合至一定程度后将转基因内皮祖细胞种植到上皮细胞侧。(7)将复合了种子细胞的细胞-细胞外基质复合材料包埋于成年新西兰兔腹壁皮下,定期取材行组织学鉴定。(8)将经过包埋处理的细胞-细胞外基质复合材料卷管后行长管状尿道缺损修复替代,并通过静脉尿路造影或逆行尿路造影检测移植物替代效果。结果：(1)RT-PCR等实验室检测方法证实慢病毒表达载体pGC-FU-LL37-GFP构建成功,慢病毒滴度为2.00E+8TU/ml,通过超纯去内毒素抽提方法使得慢病毒载体安全可用。(2)通过外周血途径(股静脉血液)可有效提取单个核细胞,并通过细胞因子将其转化为干细胞性质的内皮祖细胞。(3)通过转基因技术可有效将目的基因抗菌肽LL-37转染进入制备的目的细胞——内皮祖细胞中,免疫荧光法等检测证实转染效率可达90%左右,Western Blot检测证实准基因内皮祖细胞有效表达抗菌肽LL-37。(4)成功分离培养并纯化了兔尿路上皮细胞和平滑肌细胞,且种子细胞增殖迅速、不易老化。(5)自行创立的膀胱脱细胞基质制备技术——高渗盐水-酶消化法-去垢剂洗涤技术可完全脱去组织中的细胞成分,体外复合种子细胞的培养过程中显示出良好的生物相容性,并且可促进种子细胞的增殖分化和在其上的均匀分布。结论：实验室条件可成功构建包含有抗菌肽LL-37的重组慢病毒表达载体pGC-FU-LL37-GFP,通过转基因技术可高效转染目的细胞并使其表达相关目的蛋白。外周血途径亦可成功分离转化得到足够数量的内皮祖细胞,较之普遍采用的骨髓途径获取单个核细胞的方法具有更高的便捷性和可重复性。通过取材膀胱组织,可快速制备尿路上皮细胞、平滑肌细胞,通过纯化扩增可作为合格的组织工程学种子细胞。高渗盐水-酶消化法-去垢剂洗涤法可制备出完全无细胞成分的膀胱脱细胞基质,且保留细胞外基质的生物学活性,在复合制备的种子细胞后,细胞可在基质表面迅速增殖,通过腹壁皮下包埋的方法可成功制备细胞-细胞外基质复合型组织工程学材料,有望应用于长段管状尿道缺损的组织工程学修复应用中,从而达到真正意义上的生物学修复再生。
杨玉齐[5]2007年在《人羊膜细胞外基质修复兔尿道缺损的实验研究》文中认为背景与目的：先天性以及后天性尿道缺损、尿道损伤等尿道疾患的治疗一直是泌尿外科的难题。文献报道手术方法300余种。许多组织已被尝试用于尿道缺损的修补，其中包括动脉、静脉、阑尾、阴囊皮肤，颊黏膜、口腔黏膜、膀胱黏膜、包皮、输尿管等等。但这些方法多以牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损，效果欠佳，并发症多。随着生命科学、材料科学以及相关学科的迅猛发展，诞生了一门新生交叉学科——组织工程学，它为泌尿系组织或器官的重建开辟了新的途径。在泌尿系组织工程的研究中，支架材料对再造工程化组织具有重要作用。细胞外基质作为支架材料越来越受到重视。细胞外基质是指位于上皮或内皮细胞下层，结缔组织细胞周围，为组织、器官甚至整个机体提供力学支持和物理强度的物质。深入研究表明，细胞外基质不仅为组织和机体提供力学支架和生物支架作用，而且对所作用的细胞类型中基因表达方式、细胞的增殖、黏附、分化、发育、扩散、移行、定居、凋亡等表现都有极其深远的影响。在去除具有抗原性的细胞成分同时，保留其天然的细胞外基质和生物学特性，使其在体内基本达到无免疫原性的状态，是这类材料能够应用于组织修复的理论基础。目前人羊膜细胞外基质用于组织工程化尿道的研究，国内外尚未见报道。本实验旨在用人羊膜细胞外基质修复兔尿道部分缺损，评估其可行性，以期寻找理想的尿道修复材料。方法：取健康孕妇剖宫产羊膜组织，制成人羊膜细胞外基质。12只雄性兔随机分成两组，A实验组，9只；B对照组，3只。将实验组兔人为造成1cm尿道缺损模型，用人羊膜细胞外基质制成相当长度和直径的基质管修补缺损，6-0可吸收线端端吻合，然后逐层缝合各层组织；对照组游离出尿道后于正中切断再吻合。两组受试对象均置8~#硅胶管做支架及导尿。术后1w每只兔每天应用青霉素80万U肌注，术后10d拔除支架管。分别于术后4w、12w、16w分叁批取实验组和对照组的尿道组织，先仔细观察大体标本。然后进行组织学观察。结果：一．人羊膜脱细胞基质：大体观察无色透明，有一定的弹性及韧性，倒置显微镜下观察呈网状结构。二．实验组中有一只第7d出现感染，经消毒、抗生素应用等措施，感染控制，但出现尿瘘，另一只拔管后出现尿瘘；对照组均顺利恢复。叁．术后4w，实验组尿道初步恢复连续性，欠光滑，组织学检查显示尿道上皮细胞已初步覆盖移植区，并可见新生血管，对照组大体观与组织学检查均显示愈合顺利。四．术后12w，实验组尿道大体观呈连续光滑完整的尿道，与对照组难以分辨，组织学检查显示新生尿道上皮细胞排列趋于稳定、规则，并可见散在尿道平滑肌细胞生成，较对照组数量少、排列紊乱。五．术后16w，实验组尿道大体观同对照组，组织学检查实验组尿道组织层次接近对照组，平滑肌数量上与对照组无显着性差别，但排列欠规则。结论：人羊膜细胞外基质可以修复兔尿道1cm的部分缺损。
李正伟[6]2012年在《脂肪干细胞复合异种真皮脱细胞基质修复兔尿道缺损的实验研究》文中研究指明研究背景尿道成形及重建术是先天性尿道下裂、尿道狭窄、尿道损伤等泌尿外科常见病的主要治疗手段,目前尿道成形及重建术式达300余种且不断被相关领域的学者或医务人员进行改良、创新,但术后并发尿道狭窄、尿瘘的情况仍时有发生,尤其是对于修复长段尿道缺损或狭窄及复杂型尿道损伤来说“缺乏理想的尿道修复材料”一直是泌尿外科医生较为棘手的问题。随着组织工程技术的发展,应用天然的生物材料(如组织脱细胞基质)重建或修复尿道已经在临床上取得了一系列可喜的成果。近年来,随着干细胞工程及再生医学的发展,应用干细胞的多项分化潜能构建载有干细胞的复合生物支架材料进行组织器官的重建或修复已成为相关领域的研究热点。同时,相关研究指出脂肪源性间充质干细胞(adipose derived stem cell, ADSCs,以下简称脂肪干细胞)具有向骨组织、软骨组织、心肌组织及上皮组织分化的潜能,且脂肪干细胞缘于其来源广泛、取材方便、再生能力强等优点使其亦然成为组织工程领域种子细胞的研究焦点之一。此外,亦有研究指出异种脱细胞生物支架材料用于组织器官的重建具有可行性,然而“应用负载同种脂肪干细胞的异种真皮脱细胞基质生物复合材料进行兔尿道重建或修复”的文献尚未见有人报道。研究目的探讨应用“负载有同种脂肪干细胞的异种真皮脱细胞基质生物复合材料”行兔尿道修复或重建的效果。材料与方法1.体外分离、培养、扩增兔脂肪干细胞,并利用流式细胞仪进行鉴定。2.观察异种(人)真皮脱细胞基质材料的脱细胞效果,并将体外培养、扩增的兔脂肪干细胞移植于真皮脱细胞基质材料上。3.将54只新西兰雄性大白兔随机均分为叁组,A组(实验组)应用负载有脂肪干细胞的异种真皮脱细胞基质修复长约2.0cm缺损的兔尿道,B组(对照组I)单用异种真皮脱细胞基质材料进行修复,C组(对照组11)将尿道断端缝合于局部组织后直接缝合皮下及皮肤组织。4.分别于术后定期(2、4、7、16周时)切取3个手术组动物的重建的尿道组织,进行组织学观察分析。5.术后16周对实验动物行尿动力和逆行尿道造影检查,并比较其差异。结果1.体外培养、扩增的脂肪干细胞呈梭形,表型为CD34阴性,CD44、CD105阳性,符合间充质干细胞的特征。异种(人)真皮脱细胞基质大体观呈：白色、半透明状、柔软、有一定的弹性及韧性,显微镜下观察见：许多排列紧密呈网状的胶原纤维结构,未见残留有细胞成份。2.术后16周时切取新生的尿道组织行组织学检查：实验组尿道腔面光整平滑,可形成近似正常的尿道结构。与同期的实验组相比,对照组再生的血管和平滑肌相对较少,纤维瘢痕相对较多,新生的尿道腔面不如实验组光滑。3.实验组最大尿道压术后(16周)与术前比较,差异无统计学意义(P>0.05),对照组最大尿道压术后(16周)与术前比较比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论应用负载脂肪干细胞的异种真皮脱细胞基质材料可以修复2cm长的兔尿道缺损,术后粘膜再生及覆盖良好。
刘杰, 傅强[7]2010年在《组织工程技术在下尿路修复重建中的应用》文中研究指明背景:下尿路损伤、炎症、肿瘤以及先天性畸形等原因常可造成下尿路组织的严重缺损。传统手术对于下尿路修复重建存在诸多弊端。组织工程利用脱细胞基质与复合种子细胞的生物支架构建组织器官,为下尿路的临床修复与重建开辟了新的治疗思路。目的:就组织工程技术在男性下尿路修复重建中成熟技术做简单概述,并指出现阶段组织工程在临床应用之不足。方法:以"tissue engineering,urethra engineering,bladder;urethra,testicle"为英文检索词;以"组织工程;尿道重建;膀胱;尿道;睾丸"为中文检索词。应用计算机检索1994-01/2009-06 PubMed数据库和CNKI数据库相关文章,检索到文献72篇,排除重复性研究,最终纳入29篇文献进行分析。结果与结论:目前用膀胱替代材料重建膀胱的实验主要有两种模型,即脱细胞基质支架模型和复合种子细胞的生物支架模型。脱细胞基质支架材料主要有膀胱细胞外基质、尿道细胞外基质、小肠黏膜下基质等。复合种子细胞的生物支架则是将种子细胞接种与相应的支架上,经过相应的处理再回植入体内。这两种模型目前正处于实验与临床研究中。组织工程化尿道方面的应用技术与组织工程化膀胱类似。睾丸组织工程研究目前还处于萌芽阶段。目前组织工程"替代品"还无法与正常的组织器官相媲美,还有一定的缺陷。
王海江[8]2009年在《人脐静脉细胞外基质构建组织工程尿道的实验研究》文中研究指明研究背景及目的对于尿道先天畸形、后天损伤或因其他疾病造成的尿道狭窄或缺损,大多数患者需要尿道成形重建手术治疗。现在尿道成形重建的手术方式多达300余种,但无论何种手术方式,尿瘘、尿道狭窄仍是术后较为常见的并发症,常需要再次、甚至是多次手术治疗,足以说明尿道重建的难度、复杂性及挑战性。为了解决尿瘘和尿道狭窄并最大程度的恢复阴茎尿道功能及外观,新的或改良的手术方式仍然不断涌现,但并无一种普遍适用的方法,关键在于尿道重建的材料。较常用的尿道重建材料有:①膀胱粘膜或口腔粘膜移植物,前者可供组织量大,后者可供组织有限,但两者均造成继发创伤,容易形成尿瘘和尿道狭窄。②阴茎包皮或皮肤游离移植再造尿道,由于缺乏血运,已少应用。③直接利用输尿管、动脉、静脉或阑尾组织进行替代等,取材不便,疗效也欠佳,一直未能成为主流的手术方法。④阴茎皮肤、阴囊纵隔皮肤或包皮瓣带蒂转移再造尿道,优点是血运良好,但可供组织有限,在包皮缺乏、重症尿道下裂以及多次尿道手术失败的患者常无可供利用的组织。随着生命科学、材料科学以及相关学科的迅猛发展,诞生了一门新生交叉学科——组织工程学,它为泌尿系组织或器官的重建开辟了新的途径。在泌尿系组织工程的研究中,支架材料对再造工程化组织具有重要作用,细胞外基质作为支架材料越来越受到重视。细胞外基质是一种特殊的天然生物材料,是生物体原型组织经过特殊脱细胞处理后,仅保留胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白等低抗原性物质,能为组织、器官甚至整个机体提供力学支持和物理强度。研究表明,细胞外基质不仅为组织和机体提供力学支架和生物支架作用,还含有各种生物因子和细胞因子,对于调节细胞在材料上基因表达方式、细胞的增殖、黏附、分化、发育、扩散、移行、定居、凋亡等都有重要作用。在去除具有抗原性的细胞成分同时,保留其天然的细胞外基质和生物学特性,使其在体内基本达到无免疫原性,是这类材料能够应用于组织修复的理论基础。很多学者己在组织工程尿道方面取得显着成果。脱细胞小肠粘膜基质,脱细胞膀胱粘膜基质,脱细胞的血管基质等被用于尿道重建研究,并取得一定效果,说明利用脱细胞组织基质再造尿道有其可行性。因此,我们在前人组织工程化尿道已有研究的基础上提出以人脐静脉细胞外基质重建修复尿道,观察其组织再生能力及能否恢复尿道的功能,以期寻找理想的尿道修复材料。材料与方法取健康孕妇剖宫产脐带,采用酶消化、去污剂和渗透溶液方法处理人脐静脉,制备人脐静脉细胞外基质。倒置显微镜和H-E染色观察细胞脱落情况。24只新西兰雄性白兔,随机分为A(n=12)、B(n=6)、C(n=6)组,A、B组切除前尿道2.0cm,A组用脐静脉细胞外基质修复尿道缺损;B组将其断端与周围组织直接缝合作为对照;C组切断前尿道2.0cm后将断端直接缝合作为另一对照组。叁组受试对象均置8#硅胶管做支架及导尿。术后1w每只兔每天应用青霉素80万U肌注,术后10d拔除支架管。术后2w、4w、8w、16w行免疫组织学观察,术后16w行尿道膀胱造影及尿动力学检查。结果1.人脐静脉细胞外基质:大体观察无色透明,有一定的弹性及韧性,倒置显镜下观察呈网状结构,细胞外基质保持完好,细胞全部脱除。2.实验组中有2只出现感染,经换药、抗生素应用等措施,感染控制,拔尿管后2只出现尿瘘;B组术后3只发生尿瘘,其余可见尿道闭塞,大量结缔组织生长,无正常上皮结构;C组恢复良好。3.术后2w,A组移植段尿道有上皮细胞生长,伴有白细胞及巨噬细胞浸润,术后4w时移植段尿道已被上皮完全覆盖,无炎性细胞。术后8w时可见人脐静脉细胞外基质降解的微小碎片包裹,出现不规则紊乱的平滑肌细胞生长,术后16w时A组的上皮组织及基层下组织与C组无明显差别,平滑肌排列规则,血管数目进一步增多,炎症反应消失,未见脐静脉细胞外基质组织。4.术后16w尿道膀胱造影A、C组见尿道完整、光滑,无尿液外渗、尿道憩室等形成,尿动力学检查示A、C组的膀胱容量、最大尿道压分别与术前比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而B组不能置入测压管检测。结论1.酶消化、去污剂和渗透溶液联合处理人脐静脉是制备细胞外基质较为理想的方法。2.人脐静脉细胞外基质可以修复2.0cm长的兔管状尿道缺损,再造尿道时仅有两个吻合口,术后能获得良好的粘膜覆盖,尿瘘及尿道狭窄发生的机率降低。3人脐静脉细胞外基质替代尿道缺损,材料来源相对充足,手术简单,创伤小是一个良好的、值得进一步研究的可用于尿道重建的替代材料。
刘杰[9]2011年在《尿路缺损肌性管腔修复的种子细胞实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分:Beagle犬脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究目的:验证犬脂肪干细胞(ADSCs)原代培养及诱导成肌细胞方法的可行性,并为肌性管腔的构建提供可靠的种子细胞。方法:取雄性Beagle犬腹股沟处皮下脂肪组织,使用酶消化法行原代脂肪干细胞培养,并对所培养的ADSCs表面标志进行流式细胞仪鉴定;取第1代培养至对数生长期细胞分为实验组A和对照组B两组,诱导剂为10umol/L的5-aza,每日倒置显微镜下观察细胞形态变化,并在诱导的第7,14,21,28天行细胞免疫荧光和流式细胞仪检测其特异性成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达情况。结果:成功从犬腹股沟部皮下脂肪组织分离、培养出ADSCs,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性。倒置显微镜下观察细胞形态变化显示:诱导组细胞诱导3周出现成肌细胞特有的“漩涡”样生长形态,在诱导的第4周单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示:desmin和myosin的表达率在诱导28天时达最高,分别为59.4%和56.1% ,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达。结论:本实验进一步证明了脂肪干细胞可通过诱导向成肌细胞方向分化,为下一步实验提供了可靠的种子细胞。第二部分:Beagle犬上皮细胞原代培养及鉴定的实验研究目的:探讨犬上皮细胞的原代培养方法的可行性,并为尿路肌性管腔粘膜上皮提供可靠的种子细胞。方法:取雄性Beagle犬口腔黏膜上皮组织,使用酶消化法行上皮细胞原代培养,使用3T3细胞作为细胞饲养层,细胞生长至培养皿80%左右行传代处理;每日倒置显微镜下观察细胞形态变化;取第一代生长至对数期细胞行细胞免疫荧光和流式细胞仪鉴定表皮细胞标志蛋白AE1/AE3的表达情况。结果:上皮细胞生长较缓慢,原代需培养20天方能达到100mm培养皿的80%左右,传代后生长速度明显加快,一般10天就能达到100mm培养皿的80%;细胞鉴定采用国际上上皮类组织比较常用的AE1/AE3来鉴定,荧光及流式结果让人满意。结论:本实验进一步证明了上皮细胞可通过原代培养获得,可作为下一步实验可靠的种子细胞。
杜昆峰[10]2016年在《脂肪干细胞联合血管内皮细胞修复兔尿道缺损的实验研究》文中研究表明研究背景先天性尿道下裂、尿道损伤、尿道狭窄等是泌尿外科常见疾病,其有效解决办法仍然依赖于外科手术治疗,而尿道成形及重建术是主要的治疗方式。尿道成形术及重建术种类较多,目前将近有300余种,并且众多学者和医学工作者还一直在对其进行改良和创新。然而,对于长段尿道缺损、尿道狭窄及复杂型尿道损伤的患者而言,术后出现尿瘘、尿道狭窄等并发症的情况还仍然较高,成为令泌尿外科医师颇为头疼的问题。相关研究表明,术后尿道的血液供应情况与上述并发症的发生也存在的一定的联系。随着组织工程技术和干细胞技术的发展,理想的尿道修复支架材料和良好的种子细胞在基础研究及临床上取得了令人满意的成果。脂肪干细胞(Adipose derived stem cell,ADSCs)来源较广泛、取材方便、再生能力较强且具有向骨组织、软骨组织、心肌组织及上皮组织分化的潜能等优点,使其在组织工程领域种子细胞的研究中逐渐成为众多研究者研究的热点。同时,血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VEC)是一种多功能的细胞,位于血管内壁,许多机体的发病过程均有其参与。大量动物实验及临床资料表明,VEC在改善机体缺血部位和损伤部位的血供方面有着得天独厚的优势。近年来,ADSCs和VEC分别单独联合支架材料用来修复尿道的研究报道逐渐增多,且取得了一定的成果。然而“脂肪干细胞联合血管内皮细胞修复兔尿道缺损”的文献尚未见报道。研究目的探讨应用“脂肪干细胞(ADSCs)和血管内皮细胞(VEC)体外共培养,联合脱细胞基质材料构建人工尿道”修复兔尿道缺损的效果。方法1.种子细胞的获取1.1体外分离、培养、扩增兔脂肪干细胞,并利用流式细胞仪进行鉴定;1.2血管内皮细胞的提取、培养及鉴定;1.3 ADSCs与VEC进行共培养。2.分别将ADSCs、VEC以及二者共培养细胞分别与脱细胞基质结合,构建组织工程化尿道。3.将60只雄性成年新西兰兔随机数字法分为5组,分别将其阴茎腹侧尿道制作成缺损长度为2.0cm的动物模型。A组(无细胞对照组)即:单纯应用异种脱细胞基质修复组。B组(假手术组)即:尿道缺损模型制作成功后,将尿道缺损后的两个尿道断端直接行端端吻合;C组(ADSCs组)即:脂肪干细胞复合异种脱细胞基质手术修复组;D组(VEC组)即:血管内皮细胞复合脱细胞基质手术修复组;E组(ADSCs与VEC共培养组)即:ADSCs与VEC共培养后复合异种脱细胞基质手术修复组。4.术后于第1W、2W、4W、12W分别取A、B、C、D、E组实验动物的重建尿道组织,行组织学及免疫组化观察分析。5.术后12W时分别对各组实验动物行逆行尿道造影及尿动力学检查。结果1.体外培养、扩增的ADSCs为梭形。应用流式细胞仪检测表型CD44、CD105阳性,而CD34阴性,符合间充质干细胞特征;VEC原代细胞呈贴壁生长,细胞形态多样,圆形、椭圆形、长梭形或多角形,传代内皮呈铺路石样;共培养细胞7天时部分细胞仍保留原有的梭形,另外一部分细胞形态不同于前者,可呈多角形,巢样分布,14天时观察可见细胞间存在许多相互连接的突触,并且部分细胞可融合成团块状;2.E组检测尿路上皮血管内皮细胞因子(FⅧ)、平滑肌肌动蛋白(a-SMA)均为阳性,与脱细胞基质复合均生长良好。3.术后1W、2W、4W、12W时分别对各组兔子尿道行组织学观察,可见E组毛细血管数目及平滑肌明显多于C、D组;4.统计学结果显示C、D、E叁组和A组相比术后出现并发症的几率低;而C、D、E叁组之间相比术后并发症发生率则无明显差异。结论1.ADSCs和VEC经体外共培养后可作为种子细胞应用于组织工程化尿道的构建和长段尿道缺损的修复。2.VEC可支持ADSCs向尿道上皮方向的转变,并且还可以加快血管的发生;
参考文献：
[1]. 兔骨髓间充质干细胞构建异种组织工程化尿道修复兔尿道缺损[D]. 张震. 郑州大学. 2010
[2]. 组织工程化尿道构建及尿道缺损修复的实验性研究[D]. 李泸平. 郑州大学. 2016
[3]. 组织工程化尿道的实验研究[D]. 翟弘峰. 中国协和医科大学. 2001
[4]. 复合转基因EPCs的细胞—细胞外基质复合材料在修复长管状尿道缺损中的实验研究[D]. 李永伟. 武汉大学. 2014
[5]. 人羊膜细胞外基质修复兔尿道缺损的实验研究[D]. 杨玉齐. 郑州大学. 2007
[6]. 脂肪干细胞复合异种真皮脱细胞基质修复兔尿道缺损的实验研究[D]. 李正伟. 郑州大学. 2012
[7]. 组织工程技术在下尿路修复重建中的应用[J]. 刘杰, 傅强. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
[8]. 人脐静脉细胞外基质构建组织工程尿道的实验研究[D]. 王海江. 郑州大学. 2009
[9]. 尿路缺损肌性管腔修复的种子细胞实验研究[D]. 刘杰. 苏州大学. 2011
[10]. 脂肪干细胞联合血管内皮细胞修复兔尿道缺损的实验研究[D]. 杜昆峰. 郑州大学. 2016