（1广西医科大学 广西南宁 530021）
（2广西医科大学第一附属医院心胸外科 广西南宁 530021）
【摘要】目的：探讨HB-EGF的表达情况对肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖、迁移的影响，以及HB-EGF对PASMC的作用与PI3K/AKT信号通路的关系。方法：将人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）分为：对照组、HB-EGF组、CRM 197组、LY 294002组。采用MTT法测定HPASMC的增殖情况；采用Transwell法测定HPASMC的迁移情况；采用Western Blot法检测AKT的表达情况。结果：与对照组相比，HB-EGF组细胞的增殖、迁移明显增强（P<0.05），而AKT蛋白表达水平亦升高（P<0.05）；而CRM 197组、LY 294002组细胞的增殖、迁移均被抑制（P<0.05），AKT蛋白表达水平均降低（P<0.05）。结论：HB-EGF可刺激PASMC的增殖和迁移，其机制之一可能是通过激活PI3K/AKT信号通路。
【关键词】HB-EGF；PI3K；AKT；肺动脉平滑肌细胞；增殖；迁移
【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）05-0025-03
Effects of HB-EGF on Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells
Liang Honghua1,Wang Kang1,LiHaiyan1,Ma Xiu tao1,Huan Zichun1,Qin Jiajin2
1.Guangxi Medical University Nanning 530021,China
2. Department of Cardiothoracic Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University Nanning 530021,China
【Abstract】Objective To investigate the effect of HB-EGF on the proliferation and migration of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) and the relationship between HB-EGF and PASMC and PI3K / AKT signaling pathway. Methods Human pulmonary artery smooth muscle cells (HPASMC) were divided into control group, HB-EGF group, CRM group 197 group and LY 294002 group. The proliferation of HPASMC was determined by MTT assay. The migration of HPASMC was measured by Transwell method. The expression of AKT was detected by Western Blot. Results Compared with the control group, the proliferation and migration of HB-EGF group were significantly increased (P<0.05), while the level of AKT phosphorylation in HB-EGF group was also increased (P<0.05); CRM 197 group, LY 294002 group Compared with the control group, the proliferation and migration of the cells in the CRM 197 group and the LY 294002 group were inhibited (P<0.05), and the phosphorylation level of AKT in the CRM 197 group and the LY 294002 group was decreased (P<0.05). Conclusions HB-EGF can stimulate the proliferation and migration of PASMC, one of mechanism may be through the activation of PI3K / AKT signaling pathway.
【Key words】HB-EGF; PI3K;AKT; Pulmonary artery smooth muscle cells; Proliferation; Migration
肝素结合表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的其中一种配体，广泛存在于哺乳动物的多种组织中，能刺激细胞的增殖，在机体的多种生理过程及病理过程起着重要的作用，比如促进组织损伤和伤口愈合、生殖、血管生成，其过度表达与肿瘤和癌症的形成密切相关等[1，2]。研究表明，HB-EGF参与刺激肿瘤细胞的分化、增殖、侵袭，对平滑肌细胞的增殖、迁移亦起刺激作用[3]。本研究将探讨HB-EGF对HPASMC的影响。
1.材料与方法
1.1 主要材料
酶标仪（Thermo公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS），0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、高糖DMEM培养液（南京维森特生物科技有限公司），MTT试剂（北京索莱宝生物科技有限公司），兔抗AKT多克隆抗体（美国Sigma公司），原代HPASMC（CM-H520，上海盖宁生物科技有限公司）。
1.2 HPASMC的培养
购回原代HPASMC后，于5% CO2、37℃培养箱培养过夜。第二天，弃去瓶内培养液，PBS液冲洗2遍，然后用胰蛋白酶分离细胞，接着用血清培养基终止消化。转移至离心管，常温下1000转/分离心5分钟，弃上清液，用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基重悬细胞，计数，用25cm2培养瓶，于5% CO2、37℃培养箱培养。隔天换液，细胞融合90%开始传代。取4～6代细胞备后续实验使用。
1.3 实验分组及细胞增殖实验
取对数生长期HPASMC一瓶，洗涤2次，胰酶消化，离心，用含1%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。于96孔板中每孔种200ul细胞悬液（5×103个），周围设不含细胞的空白对照孔，培养过夜。分为4组，对照组、HB-EGF组、CRM 197组和LY 294002组，各组分别加入：PBS液、含10ng/ml的HB-EGF、含20μg/ml的CRM 197（HB-EGF抑制剂）、含25μmol/L的LY 294002（PI3K阻滞剂），每组设5个复孔。在孵育48h后，每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml），避光孵育4h，弃培养基，每孔加入150ul DMSO溶液，震荡15min。用酶标仪选490nm波长检测各孔的光吸收值（OD值）。重复3次试验。算出细胞增殖率。细胞增殖率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。
1.4 细胞迁移实验
取对数生长期HPASMC一瓶，冲洗2遍，胰蛋白酶消化，离心，用含0.1%胎牛血清DMEM培养基重悬细胞。每孔接种200ul（2×104个）细胞悬液于Transwell小室上室。每孔Transwell小室下室加600ul含10%胎牛血清DMEM培养基。各组上室分别加入：PBS液、含10ng/ml的HB-EGF、含20μg/ml的CRM 197、含25μmol/L的LY 294002。5% CO2、37℃孵育48h。取出小室，弃上室液体，甲醛中固定30min，结晶紫溶液中染色30min，用PBS液侵泡脱色2～3次，用棉签拭去上室内的细胞，晾干，置于干净载玻片上。用高倍显微摄像系统照相计数小室下层细胞。迁移细胞数为5个相邻视野细胞的平均值。
1.5 AKT含量的测定
取对数生长期HPASMC，按上述对照组、HB-EGF组、CRM 197组和LY 294002组处理，48h后，离心收集细胞。在冰上裂解细胞，收集细胞碎片溶液，在4℃12000转/分离心5min，收集上清液即为细胞的蛋白溶液。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE），转PVDF膜，封闭，分别加入1:500兔抗AKT多克隆抗体4℃孵育过夜，二抗常温下孵育1h，TBST脱色3次，暗室曝光，置于显影剂显影，置于定影剂定影，冲洗胶片。运用凝胶图片处理系统分析蛋白条带。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，各组数据以均数（-x）±标准差（s）表示，多组间均数的比较用方差分析处理数据。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 HB-EGF对HPASMC增殖的影响
MTT实验结果显示，与对照组相比，HB-EGF组HPASMC的增殖被明显刺激增强（P<0.05），CRM 197组和LY 294002组HPASMC的增殖被明显的抑制（P<0.05）。见图1。
2.2 HB-EGF对HPASMC迁移的影响
Transwell小室结果显示，与对照组相比，HB-EGF组HPASMC的迁移被明显刺激增强（P<0.05），CRM 197组和LY 294002组HPASMC的迁移受到明显的抑制（P<0.05）。见表。
3.讨论
HB-EGF的过度表达在肿瘤形成的过程中扮演着重要的角色，调节肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，并且在目前癌症的单克隆抗体靶向治疗中，HB-EGF是一个重要的研究靶点[4]。HB-EGF在平滑肌中同样存在着很明显的作用。研究表明，HB-EGF可促进血管的重塑、新生血管的形成，并可促进气道平滑肌细胞的增殖和迁移[5，6]。在HPASMC中HB-EGF是否亦存在同样的作用呢。本研究对HB-EGF对HPASMC的作用进行了探讨。
本研究结果发现，与对照组相比，HB-EGF组外源性增加HB-EGF后HPASMC的增殖和迁移均增强（P<0.05），而CRM 197组在选择性抑制HB-EGF后以及LY 294002组阻滞了PI3K后HPASMC的增殖和迁移均被抑制（P<0.05）。
平滑肌细胞增殖、迁移的调控非常机制复杂，可以同时通过多条信号通路进行调控。PI3K/AKT是很重要的一条信号通路，其通过上游因子激活PI3K/AKT信号通路，介导p38蛋白等下游因子的表达，调控周期蛋白的表达，调控平滑肌细胞的增殖和迁移[7]。HB-EGF可以通过PI3K/AKT通路刺激平滑肌细胞的增殖和迁移[8]。本研究探讨了HB-EGF是否可通过PI3K/AKT信号通路刺激HPASMC的增殖及迁移。
本研究结果显示，与对照组相比，HB-EGF组外源性增加了HB-EGF后HPASMC表达AKT蛋白水平明显增强（P<0.05），而CRM 197组在选择性抑制了HB-EGF后和LY 294002组阻滞了PI3K后HPASMC表达AKT蛋白水平明显减弱（P<0.05）。
综上所述，HB-EGF可刺激PASMC的增殖和迁移，其机制之一可能是通过激活PI3K/AKT信号通路。但详细的调节机制复杂，有待进一步的研究。
【参考文献】
[1] Taylor SR,Markesbery MG,Harding PA.Heparin-binding epidermal growthfactor-like growthfactor (HB-EGF)and proteolytic processing by a disintegrin and metalloproteinases(ADAM)：a regulator of several pathways[J].Semin Cell Dev Biol.2014 Apr；28:22-30.
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基金项目：
广西自然科学基金（项目编号：2013GXNSFAA019151）
论文作者:梁洪华,王康,李海燕,马秀涛,黄子春,覃家锦
论文发表刊物:《心理医生》2017年5期
论文发表时间:2017/5/23
标签：细胞论文; 平滑肌论文; 小室论文; 培养基论文; 对照组论文; 蛋白论文; 肺动脉论文; 《心理医生》2017年5期论文;