广州市药品检验所四分所 广东广州510000
作者简介：何凌云（1980－），女，汉族，广东广州人，本科，广州市食品药品检验所四分所主管药师，研究方向中药化学成分的提取与测定。
【摘要】目的采用加速溶剂萃取技术（ASE）对传统瑶药定心藤中所含的雪松醇、芦丁、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷三种化合物进行提取并优化提取方法 方法用中心组合设计 (CCD)对ASE中影响提取效率的参数进行优化，确定最佳条件后，分别与加热回流和超声法进行比较，根据HPLC分析所得结果，观察三者化合物提取总量间的差异 结果ASE对定心藤中三个目标成分提取效率较传统方法高10.45%～15.76%（以总活性成分含量计）,由统计分析结果可知，三者存在显著性差异。结论ASE法相较传统方法更为快速、高效，所得化合物总含量更高,因此具有更大的优势。
【关键词】加速溶剂萃取技术；中心组合设计
【中图分类号】R127.3【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0376-01
定心藤（Mappianthus iodoides Hend.-Mazz.）为茶茱萸科植物甜果藤的干燥树藤（Mappianthus iodoides Hand.-Mazz）。该类药材活性成分多种多样 ，其中，含量最为丰富，文献报道较多的为（+）-雪松醇，芦丁 与色谱分析预实验中鉴定出的豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。然而，目前为止，对于定心藤活性成分的提取方法，仍停留在传统的硅胶柱层析、超声萃取等技术上 。本研究的目的在于考察及充分利用ASE的技术特点，高压条件下快速连续萃取,降低中药材提取中人工、能源与试剂消耗并简化操作。同时，通过提取效率对比，探寻其替代传统技术的可能性。
1方法与结果
1.1 仪器、试剂和材料 加速溶剂萃取仪为Dionex ASE 350 ，昆山 KQ-50DE超声净化仪，岛津LC-20A高效液相色谱仪（DAD检测器，迪马C18 钻石柱，规格5μm，250mm×4.6mm）。乙醇购自上海化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）购自默克公司；去离子水由MiLLi-Q系统制备。（+）-雪松醇与芦丁购自中国药品生物制品检定所，定心藤药材来源于广西壮族自治区金秀县山中，采集后晒干、切片保存，并经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为茶茱萸科定心藤（Mappianthus iodoides Hend.-Mazz.）。
1.2 豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷单体的制备 由于未有标准品提供，故须自行制备其单体。称取定心藤药材粉末50g，以5g为一份，置于ASE提取罐中，以130℃，30分钟，循环两次的提取操作，所用溶剂量为每5g药材50mL45%乙醇，合并所得提取液，旋转蒸发浓缩后，采用大孔树酯以10%（v/v，下同）、30%、50%、65%、75%、95%乙醇各300mL，分三次洗脱，取洗脱液进HPLC后，得知该化合物在50%乙醇中含量最高，故将该部分合并，旋蒸浓缩后，挥干溶剂，即得橙黄色粉末状固体。
1.3 药材供试品的制备 将同一批定心藤药材粉，分为9份，每份5g，平行操作。使用超声30min、加热回流3h、ASE按1.2操作，三种方法各提取三份，提取溶剂均为45%乙醇50mL。
1.4 三种化合物的含量测定
1.4.1高效液相色谱实验 具体条件为：流动相A 1%磷酸水溶液，B 乙腈，采用梯度洗脱，梯度程序为： 0～40min 15～40%B，40～50min 40～60%B，50～60min 60～15%B，检测波长210nm，柱温25℃，流速0.8mL/min。
峰1为（+）-雪松醇，2为芦丁，3为豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷
1.4.2标准曲线绘制 各取制备的活性成分对照品或单体10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度即得。取上述标准溶液，精密量取一定量至同一10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得1，2，5，10，20，50，100， 200μg/mL的溶液，进样后记录峰面积。回归方程分别为（+）-雪松醇y=5670.9x+25679,芦丁y = 23230x + 15503，以及豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷y=9245.2x-3737.5，相关系数分别为r2= 0.9997，0.9995和0.9996。结果显示，该方法线性良好，在1～200μg/mL范围内线性良好。
1.4.3定心藤药材中各化合物的含量测定 取定心藤药材粉5g，以1.2部分所述ASE条件提取后，直接进HPLC分析，记录各化合物峰面积。将峰面积代入标准曲线中，求得各化合物含量。
1.5 ASE条件对提取效率影响的考察 除对不同提取方法进行比较之外，本实验还对影响ASE提取效率的温度、提取时间、提取溶剂及提取循环等四个因素进行了考察。根据中心组合（CCD）设计，选取20组条件进行ASE提取，将提取液进HPLC测定各成分含量，根据Design Expert分析结果选择最优条件。结果（见表1）可知，三化合物最优提取条件为提取温度130℃，提取时间50min，采用溶剂为45%乙醇。
1.6 不同提取方法比较 取1.3部分所制备的供试品溶液，采用1.4.3部分所述HPLC条件进行含量测定，以测定结果总量进行统计分析。结果显示，ASE法三种化合物总量 11.43mg/g,超声法为9.629mg/g,回流为10.23mg/g,ASE法相较其他两种方法所得三种化合物总量更高，且由Dunnett-t检验，结果具有显著差异。且在采用ASE技术的情况下，雪松醇、芦丁、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷三种成分的总产量较超声提取高15.76%，较加热回流高10.45%。
2讨论与小结
由表1所列结果可知，当温度由100℃升至130℃时，产量亦随之提升；但当温度超过这一数值时，各化合物产量，特别是化合物1的产量则出现下降趋势。这是由于温度升高时，药材中的活性成分与提取溶剂间相互作用更为频繁，更多化合物分子溶于其中；而过高的温度会使化合物分子受到破坏，致使产量下降。此外，提取时间对结果也会产生较为显著的影响.随着溶剂分子与药材作用时间延长，由于二者相互作用更加充分，故产量也会出现上升。对提取溶剂而言，由于（+）-雪松醇的极性较大，较高的乙醇比例会使其提取量下降，而对芦丁与豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷则反之。本文采用ASE对瑶药定心藤中三种化合物雪松醇、芦丁、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷进行提取，该方法快速、高效、自动化程度高，所得目标化合物纯度高，无需前处理可直接进样。对比传统方法，不但产量上提高程度明显，且更为节能、环保与简便，故可一定程度上替代传统的中药材提取分离方法。
参考文献
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论文作者:何凌云
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/27
标签：化合物论文; 溶剂论文; 芦丁论文; 糖苷论文; 方法论文; 药材论文; 雪松论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;